何美君，程雨萌，陳茜，趙健，白光

作者單位：1遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110847；2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽(yáng) 110033

胃食管反流?。╣astroesophageal reflux disease，GERD）是指胃、十二指腸內(nèi)容物向食管中反流而引起病人反酸、燒心等癥狀的一種疾?。?］。根據(jù)食管黏膜在胃鏡下的表現(xiàn)，GERD又可分為反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）、非糜爛性胃食管反流?。╪onerosive gastroesophageal reflux disease，NERD）和巴雷特食管（Barrett esophagus，BE）3種類(lèi)型。近年來(lái)，GERD在我國(guó)的發(fā)病率逐年增高，其中NERD約占GERD發(fā)病率的70%［2］。且NERD病人常合并有焦慮抑郁等心理疾病，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量［3］。祖國(guó)醫(yī)學(xué)中并無(wú)對(duì)應(yīng)NERD的病名記載，但根據(jù)其臨床特征，可歸于中醫(yī)“吞酸”“反胃”“梅核氣”等范疇。NERD的中醫(yī)病機(jī)主要是肝失疏泄，胃失和降。目前質(zhì)子泵抑制劑（proton-pump inhibitors，PPIs）對(duì)NERD治療的整體療效欠佳，病人易出現(xiàn)復(fù)發(fā)而影響生活質(zhì)量，因此更多的病人尋求中醫(yī)藥治療［4］。本研究檢索搜集了中國(guó)知網(wǎng)（CNKI）數(shù)據(jù)庫(kù)里關(guān)于中醫(yī)藥治療NERD的臨床文獻(xiàn)，深入挖掘中藥治療NERD的用藥規(guī)律，并運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析常用配伍組合藥物治療NERD的潛在機(jī)制。以期為臨床治療NERD提供用藥思路并為進(jìn)一步明確藥物作用機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料來(lái)源進(jìn)入CNKI官網(wǎng)頁(yè)面的高級(jí)檢索，以（中醫(yī)OR中藥）AND（非糜爛性胃食管反流病OR NERD）為檢索式進(jìn)行主題詞檢索，檢索年限為2000年1月至2021年1月。共檢索到文獻(xiàn)283篇。

1.2 文獻(xiàn)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)運(yùn)用中醫(yī)或中西醫(yī)結(jié)合治療NERD的文獻(xiàn)中所涉及的所有中醫(yī)方劑；方劑中藥味具體、完整；服藥方式為口服；同一中藥方劑的多篇文獻(xiàn)只納入1篇。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)單味中藥；未明確記載用量；劑型為膠囊劑、膏劑、注射劑；少數(shù)民族醫(yī)藥的方劑；用于實(shí)驗(yàn)研究的方劑；以霧化吸入、灌腸、離子導(dǎo)入等給藥方式均予以排除。

1.3 中藥名稱(chēng)與中醫(yī)證型規(guī)范方劑中出現(xiàn)的產(chǎn)地命名、炮制及別名的中藥，參照全國(guó)中醫(yī)藥行業(yè)高等教育“十二五”規(guī)劃教材《中藥學(xué)》進(jìn)行規(guī)范，比如炒枳殼錄為枳殼，生甘草錄為甘草等［5］。納入的文獻(xiàn)中的中醫(yī)證型參考《胃食管反流病中西醫(yī)結(jié)合診療共識(shí)意見(jiàn)》（2017）進(jìn)行規(guī)范［6］。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.1 運(yùn)用中醫(yī)傳承計(jì)算平臺(tái)V 3.0分析組方用藥規(guī)律將最終納入的89首處方錄入到中醫(yī)傳承計(jì)算平臺(tái)V3.0。在錄入過(guò)程中，由兩個(gè)人對(duì)每個(gè)方劑中的中藥進(jìn)行校對(duì)，以保證錄入的準(zhǔn)確性。錄入后，首先對(duì)NERD的證型分布進(jìn)行分析。運(yùn)用中醫(yī)傳承計(jì)算平臺(tái)V3.0的“數(shù)據(jù)分析”功能對(duì)藥物的基本規(guī)律進(jìn)行分析，包括用藥頻率，功效，以及藥物的四氣五味與歸經(jīng)。最后用關(guān)聯(lián)規(guī)則（FP-tree）、聚類(lèi)分析（層次聚類(lèi)法）分析方劑配伍規(guī)律。

2.2 運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析核心組方作用機(jī)制

2.2.1 獲取核心方的有效成分和作用靶點(diǎn)運(yùn)用TCMSP和Batman數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索得到陳皮、半夏、海螵蛸、柴胡、黃連、吳茱萸六味中藥的有效成分及作用靶點(diǎn)。TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)置化合物的口服生物利用度（OB）≥30%，類(lèi)藥性指數(shù)（DL）≥0.18。

2.2.2 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將“2.2.1”中得到的靶點(diǎn)輸入到String網(wǎng)站，設(shè)置confidence score值為0.9，以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape3.8.0進(jìn)行可視化。再運(yùn)用cytoHubba插件，篩選度值（Degree）排名前10的核心靶點(diǎn)。

2.2.3 生物學(xué)功能及通路富集分析用R3.6.1對(duì)“2.2.2”中篩選的核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析。

3 結(jié)果

3.1 證型分布NERD的肝胃不和證最多（33個(gè)，37.1%），肝胃郁熱證（25個(gè)，28.1%），氣郁痰阻證（14個(gè)，15.7%），中虛氣逆（13個(gè)，14.6%），寒熱錯(cuò)雜證（4個(gè)，4.5%）。

3.2 用藥頻次分析對(duì)納入的89首方劑中的中藥進(jìn)行用藥頻次分析，總計(jì)有130味中藥，使用頻次≥30的中藥有11味（表1）。

表1 治療NERD使用頻次≥30的中藥

3.3 藥物基本信息分析分析所有中藥的四氣、五味、歸經(jīng)以及功效。藥性分析得出溫性藥使用最多，藥用頻次354次；五味中苦味頻次最高，頻次為546次（表2）。藥物歸經(jīng)頻次排名前3依次為脾經(jīng)717次，肺經(jīng)545次，胃經(jīng)534次（表3）。藥物功效排名前3依次為補(bǔ)虛類(lèi)176次，理氣類(lèi)151次，化痰止咳平喘類(lèi)144次（表4）。

表2 治療NERD中藥的四氣五味頻次分析

表3 治療NERD中藥歸經(jīng)的頻次分析

表4 治療NERD中藥功效的頻次分析

3.4 藥物組方規(guī)律分析根據(jù)中藥處方的數(shù)目并結(jié)合中藥數(shù)量及藥物組合頻次，將支持度設(shè)為20%，置信度設(shè)為0.6，得到40個(gè)藥物組合并按照出現(xiàn)頻次由高到低排序（表5）。再點(diǎn)擊中醫(yī)傳承計(jì)算平臺(tái)的“規(guī)則分析”，得到10條藥物組合規(guī)則（表6）。

表5 治療NERD的40中藥物組合頻次表

表6 治療NERD的關(guān)聯(lián)規(guī)則頻次統(tǒng)計(jì)表

3.5 聚類(lèi)分析應(yīng)用中醫(yī)傳承計(jì)算平臺(tái)V3.0的聚類(lèi)分析功能（k-means算法與回歸模型相結(jié)合），均將聚類(lèi)個(gè)數(shù)分別設(shè)置為3、4、5，分別得到聚類(lèi)分析核心組合，不同顏色代表不同分組，不同顏色點(diǎn)數(shù)與方劑數(shù)量呈正相關(guān)，越靠近回歸曲線，表示越與此類(lèi)的核心藥物接近。

3.6 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析核心方劑配伍治療NERD的潛在作用機(jī)制

3.6.1 靶點(diǎn)獲取與核心靶點(diǎn)篩選去重后共獲取陳皮、半夏、海螵蛸、柴胡、黃連、吳茱萸的作用靶點(diǎn)220個(gè)。將220個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。以TSV格式導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件，用cytoHubba插件按Degree計(jì)算得到排名前10位的基因分別為JUN、AKT1、MAPK3、MAPK1、RELA、IL6、MAPK14、CXCL8、FOS、MAPK8，并構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

3.6.2 核心靶點(diǎn)的GO和KEGG富集分析結(jié)果用R3.6.1對(duì)篩選出的10個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG分析。GO富集分析結(jié)果得到生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）各10個(gè)（P＜0.05）。主要包括蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活化、促分裂原活化蛋白激酶活化、激活轉(zhuǎn)錄因子、氧化應(yīng)激等。進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析獲得P＜0.01的信號(hào)通路20條。說(shuō)明核心方可能作用于Toll樣受體、IL-17、AGE-RAGE、T細(xì)胞受體、TNF等信號(hào)通路從而發(fā)揮治療NERD的作用。

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于NERD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前研究認(rèn)為與內(nèi)臟高敏感、抗反流屏障功能減弱、食管黏膜屏障受損等病理機(jī)制相關(guān)［7-8］。臨床治療NERD以 質(zhì) 子 泵 抑 制 劑（proton pump inhibitors，PPIs）為主，但有40%～50%的病人無(wú)應(yīng)答［9］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為NERD的病機(jī)為胃失和降，胃氣上逆。治療上以疏肝和胃為基本原則。本研究運(yùn)用中醫(yī)傳承計(jì)算平臺(tái)軟件分析中醫(yī)藥治療NERD的組方規(guī)律，并用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析核心配伍的可能作用機(jī)制，為臨床選方用藥及開(kāi)展基礎(chǔ)研究提供了依據(jù)。

由納入的研究證型分析得到，目前研究的NERD證型以肝胃不和證最多，占所有研究的37.1%。從古至今，中醫(yī)常從“肝”治療吐酸類(lèi)疾病。如劉完素在《素問(wèn)·玄機(jī)原病式·吐酸》中曰：“酸者，肝之味，由火盛制金，不能平木，則肝木自盛故為酸也?！比纭端拿餍姆ā吩唬骸胺矠橥趟岜M屬肝木，曲直作酸也?！备沃魇栊?，調(diào)暢全身氣機(jī)。脾主運(yùn)化升清，胃主受納降濁。肝的疏泄功能正常，才能使脾胃氣機(jī)升降調(diào)達(dá)。此外肝主情志，若情志不暢，則會(huì)肝失疏泄，氣機(jī)升降紊亂，胃氣上逆則會(huì)引起反酸等各種病癥。

由納入的89首方劑分析得到，藥物四氣以溫為主，五味以苦為主，歸經(jīng)中以脾、肺、胃經(jīng)最多。功效以補(bǔ)虛類(lèi)、理氣類(lèi)、化痰止咳平喘類(lèi)為主。使用頻次≥30的中藥有11味，包括半夏、柴胡、黃連、海螵蛸、吳茱萸、陳皮、茯苓、厚樸、白術(shù)、甘草、枳實(shí)。其中半夏能夠消痞除結(jié)、和胃降逆，具有良好的止嘔作用。柴胡善條達(dá)肝氣，疏肝解郁，善于調(diào)節(jié)肝氣犯胃所致的惡心、嘔吐、反酸等癥狀。黃連能清熱燥濕，尤善清泄中焦胃火，治療濕熱蘊(yùn)結(jié)脾胃之嘔吐吞酸等。海螵蛸具有制酸止痛之功效，能夠治療胃酸過(guò)多、胃痛吞酸，且常與延胡索、白及、瓦楞子等藥同用。海螵蛸和煅瓦楞子中的有效成分不僅可制酸止痛、還可促進(jìn)破損的食管黏膜修復(fù)，被稱(chēng)為“中藥制酸劑”［10］。吳茱萸主入肝經(jīng)既能散肝經(jīng)之寒邪，又疏肝氣之郁滯，具有降逆止嘔之功效。陳皮理氣健脾，燥濕化痰，有苦降之性，《本草綱目》言其“療嘔穢反胃嘈雜，時(shí)吐清水”，善治嘔吐、呃逆等疾病。厚樸、枳實(shí)能理氣除滿(mǎn)消積，治療濕阻中焦，胃脹嘔吐等。茯苓、白術(shù)能夠健脾益氣祛濕，實(shí)土以抑木，使運(yùn)化有權(quán)，氣血生化有源。炙甘草配合茯苓、白術(shù)以益氣健脾，配合白芍以緩急止痛［11］?？傮w來(lái)講，以上藥物為小柴胡湯、左金丸、四君子湯的主要藥物組成。取柴胡、陳皮疏肝理氣；白術(shù)、甘草、茯苓健脾益氣；半夏、厚樸、枳實(shí)降逆止嘔；黃連、吳茱萸和胃止痛以及海螵蛸的制酸止痛之功。體現(xiàn)了治療NERD應(yīng)以疏肝和胃降逆為治療原則。

根據(jù)關(guān)聯(lián)規(guī)則得到常用藥物組合40個(gè)，其中兩味藥的組合34個(gè)，三味藥的組合6個(gè)。頻次位列前五名的藥物組合依次為黃連-吳茱萸、半夏-黃連、半夏-海螵蛸、半夏-陳皮、半夏-柴胡。黃連、吳茱萸是左金丸的藥物組成，可見(jiàn)左金丸在治療NERD中的應(yīng)用頻率最高。此外，黃連與海螵蛸、吳茱萸；柴胡、吳茱萸；吳茱萸的關(guān)聯(lián)性置信度均為1。這更加說(shuō)明左金丸在NERD中的應(yīng)用十分常見(jiàn)，這可能與NERD以肝胃不和證居多有關(guān)。左金丸具有很好的和胃降逆止嘔的功效，在治療NERD中臨床療效顯著［12］。左金丸首見(jiàn)于朱丹溪所作之《丹溪心法》。以黃連和吳茱萸6∶1的比例組成。具有疏肝降逆止嘔的功效，起到肝胃同治的作用［13］。NERD病人多伴有焦慮抑郁情緒，導(dǎo)致肝失疏泄，氣郁而化熱橫逆犯胃，故胃氣上逆而惡心吞酸。因此用左金丸治療可清除郁熱，通降胃氣而起到治療作用。半夏加黃連是半夏瀉心湯里的配伍，半夏能散結(jié)消痞，黃連瀉熱降逆。一寒一熱，辛開(kāi)苦降，使胃腸氣機(jī)升降得復(fù)［14］。根據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，半夏瀉心湯能降低食管黏膜損傷程度，減輕食管局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。其能通過(guò)降低胃酸的分泌調(diào)節(jié)體內(nèi)降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）的合成與分泌，從而防止食管黏膜受損［15］。半夏加海螵蛸則更能起到制酸止痛的作用。半夏和陳皮是二陳湯的組成，具有理氣和中，健脾和胃止嘔的功效。半夏和柴胡則組成為柴胡半夏湯。此方劑名出自《類(lèi)證活人書(shū)》，具有和解少陽(yáng)，清熱祛痰之功，在治療氣郁痰阻型胃食管反流病中療效顯著［16］。

運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)一步分析核心藥物陳皮、半夏、海螵蛸、柴胡、黃連、吳茱萸的核心藥物網(wǎng)絡(luò)。用cytoHubba插件按Degree計(jì)算得到排名前10位的基因分別為JUN、AKT1、MAPK3、MAPK1、RELA、IL6、MAPK14、CXCL8、FOS、MAPK8。通 過(guò)GO和KEGG分析得到，這些核心基因可能是通過(guò)Toll樣受體、IL-17、AGE-RAGE、T細(xì)胞受體、TNF等信號(hào)通路來(lái)起到治療作用。目前對(duì)于NERD發(fā)病機(jī)制的研究多集中在內(nèi)臟高敏感。內(nèi)臟高敏感可分為外周敏化和中樞敏化。目前研究者們對(duì)于食管內(nèi)臟高敏感的研究更多地將目光聚焦到了中樞神經(jīng)遞質(zhì)以及突觸間信號(hào)傳遞方式的改變。而c-Fos蛋白作為中樞性?xún)?nèi)臟感覺(jué)興奮性遞質(zhì)在中樞敏化的形成中發(fā)揮著重要的作用。張秀蓮等［17］研究證實(shí)，疏肝和胃方可能通過(guò)降低腦、脊髓背角ncNOS及即早基因（c-Fos）的蛋白表達(dá)而緩解食道內(nèi)臟高敏感性，進(jìn)而影響食管內(nèi)臟中樞敏感化機(jī)制的形成。此外，在NERD病人食管黏膜下還存在炎癥反應(yīng)。趙新勝［18］研究發(fā)現(xiàn)，NERD病人食管下段黏膜組織中IL-6、IL-1β、IFN-γ以及TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯增加，并且與酸反流評(píng)分（De Meester）成正相關(guān)。

5 結(jié)論

綜上，本研究通過(guò)運(yùn)用中醫(yī)傳承計(jì)算平臺(tái)分析CNKI數(shù)據(jù)庫(kù)中臨床治療NERD的中藥方劑，挖掘常用的藥物組合并分析可能的作用機(jī)制。分析得出中醫(yī)藥治療NERD常以左金丸合柴胡半夏湯加減為基礎(chǔ)方，起到理氣健脾，疏肝降逆之功效。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，核心藥陳皮、半夏、海螵蛸、柴胡、黃連、吳茱萸可能是通過(guò)Toll樣受體、IL-17、AGE-RAGE、T細(xì)胞受體、TNF等信號(hào)通路來(lái)起到治療NERD的作用。以此為臨床辨證用藥和開(kāi)展基礎(chǔ)研究提供了參考依據(jù)。