嚴寅琿，魯晶娣，黃錦翔，豐丕雪，凌 瑤，易 弋，2*

（1 廣西科技大學生物與化學工程學院 廣西柳州 545006 2 廣西糖資源綠色加工重點實驗室 廣西柳州 545006）

甲殼素作為常見的生物多糖，在自然界中含量排名第二，主要分離自蝦殼、蟹殼、藻類細胞壁等，可通過脫N-乙?；玫揭环N陽離子聚合物——殼聚糖，該聚合物是一種無毒、無味，半透明、略有光澤的白色粉末狀固體物質，主要結構由D-氨基葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵連接而成，分子質量可達數(shù)十萬到百萬[1-2]。殼聚糖在化工、食品及其它行業(yè)有廣泛的應用價值[3]。殼聚糖的高分子質量特性，使其在自然狀態(tài)下非常穩(wěn)定，因分子間具有很強的氫鍵作用而導致其水溶性差，只能溶于醋酸等一些無機酸中，難以直接利用，故未經(jīng)降解處理的殼聚糖在實際應用中會受到限制[2，4]。

殼聚糖酶（EC 3.2.1.132）是一種常用于降解殼聚糖的糖苷水解酶[5]，廣泛分布于細菌、真菌中[6-7]。該酶通過內切方式水解乙?；瘹ぞ厶堑摩?1，4-氨基葡萄糖苷鍵生成殼寡糖（或稱低聚殼聚糖）[8]，這種物質具有低分子質量、低黏度、水溶性好的特性[9]，不僅彌補殼聚糖的不足，而且具有特殊的生理活性和功能[10]。例如可調節(jié)脂肪代謝基因，減少肝毒性脂質、非必需脂肪細胞在體內的過度積累[11]。目前已有多種生物的殼聚糖酶基因在大腸桿菌中實現(xiàn)了重組表達。Lin 等[12]利用大腸桿菌作為宿主實現(xiàn)了枯草芽孢桿菌NCHU-05 的殼聚糖酶基因重組表達，酶比活力分別為3 655 U/mg 和3 780 U/mg。Kilani-Feki 等[13]將一株耐熱型枯草芽孢桿菌csnv26 的殼聚糖酶在大腸桿菌中表達，重組菌的酶產(chǎn)量高達6.2 g/L。段靜[4]在大腸桿菌BL21 中構建并表達解淀粉芽孢桿菌殼聚糖酶與谷胱甘肽轉移酶（Glutathione S- transferase，GST）的融合蛋白，由GST 親和層析柱對重組酶完成高效純化。

在殼聚糖的酶法降解處理過程中，會涉及高溫和酸處理環(huán)節(jié)[14]。如何提高殼聚糖酶的穩(wěn)定性，是該酶實現(xiàn)大規(guī)模應用過程中的主要問題。目前，通過微生物獲得高穩(wěn)定性的酶是最直接和最可靠的來源[15]。中村芽胞桿菌是一種革蘭氏陽性菌，具有較強的環(huán)境耐受性，可在pH 5.5～10、環(huán)境溫度17～50 ℃、高濃度鹽溶液（9% NaCl）的環(huán)境中正常生長[16]。目前該菌株殼聚糖酶基因序列已被公開，然而未見有關該菌株的殼聚糖酶酶學性質的研究報道。本研究首次成功構建表達中村芽胞桿菌殼聚糖酶的重組菌，并對得到的重組酶進行酶學性質研究，以拓展殼聚糖酶酶庫資源，為該酶的后續(xù)研究和應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌BL21（DE3）、pGEX-4T-3 原核表達載體由廣西科技大學發(fā)酵工程研究室提供；殼聚糖（脫乙酰度大于90%）、氨芐青霉素、低分子質量蛋白marker、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG），北京索萊寶科技有限公司；質粒提取試劑盒、DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒，北京天根生化科技有限公司；DNA marker DL 2000、DNA T4 連接酶、限制性內切酶，BamHI 和sall TAKARA 公司；GSTSepharose FF 層析柱，北京韋氏博慧色譜科技有限公司。LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基：1%蛋白胨、0.5%酵母膏、1%氯化鈉，pH 7.2～7.4；SOB（Super Optima1 Broth） 培養(yǎng)基：0.05%氯化鈉，0.5%酵母浸粉，2%蛋白胨，無菌水定容100 mL，pH 7.0；1%殼聚糖溶液：殼聚糖0.1 g，乙酸-乙酸鈉（pH 5.5）緩沖液10 mL；氨芐青霉素溶液：氨芐青霉素0.1 g，無菌水定容2 mL，過濾除菌；IPTG 溶液：IPTG 0.119 g，無菌水定容5 mL。柱層析純化試劑：緩沖液1：Tris 堿0.6 g、NaCl 0.9 g、無菌水定容至100 mL，HCl 調pH 值至8.3；緩沖液2：Tris 堿 0.61 g、還原型谷胱甘肽0.641 g，無菌水定容至100 mL，HCl 調pH 值至8.3，4 ℃保存。

1.2 儀器與設備

電子天平，賽多利斯科學儀器；UV－8000S 紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；H2100R 醫(yī)用離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；BLON－1000Y，超聲波信號發(fā)生器，上海比郎儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 中村芽胞桿菌殼聚糖酶基因克隆與表達載體構建 根據(jù)GeneBank 數(shù)據(jù)庫中中村芽胞桿菌殼聚糖酶的氨基酸序列（GeneBank：WP_061527864.1） 重新設計基因。在http：//www.jcat.de/Start.jsp 網(wǎng)站針對大腸桿菌密碼子偏好性進行優(yōu)化，同時分別在5’和3’端添加酶切位點BamHI 和salI，重新設計得到的基因命名為ChiA，委托杭州弘賽生物科技有限公司使用pUC18 載體進行基因克隆載體的構建并進行測序，構建得到的載體命名為pUC18-ChiA。結果使用Vector NTI 軟件對比驗證。通過BamHI 和salI 雙酶切處理pUC18-ChiA 基因克隆載體和pGEX-4T-3 表達載體得到線性載體與ChiA 基因，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果并回收，回收片段用T4 連接酶連接，最終得到的重組表達載體命名為pGEX-4TChiA。

1.3.2 重組表達菌株構建和驗證 將-80 ℃保存的感受態(tài)大腸桿菌細胞BL21（DE3）冰浴解凍，之后加入20 μL 重組載體pGEX-4T-ChiA，冰浴30 min 后轉移到42 ℃恒溫水浴鍋中孵育120 s。將孵育后的細胞懸液置于冰水浴2 min，轉入SOB 培養(yǎng)基并放置在37 ℃恒溫水浴中靜置30 min，37℃培養(yǎng)1 h。將上述成功轉化的感受態(tài)細胞4 ℃離心（10 000 r/min，10 min），棄上清，加入100 μL PBS 緩沖液吹打混勻沉淀。吸取50 μL 細胞懸液涂布于LB 固體培養(yǎng)基 （Amp 質量濃度80 μg/mL），37 ℃倒置培養(yǎng)12 h，挑選陽性克隆，經(jīng)PCR、雙酶切以及測序確認，構建成功的重組表達菌株命名為大腸桿菌（E.coli BL21-pGEX-4T-ChiA）。

1.3.3 重組酶誘導表達和純化 將重組表達載體轉接到LB 液體培養(yǎng)基中 （Amp 質量濃度50 μg/mL），37 ℃培養(yǎng)至OD600nm為0.4～0.6 時，加入誘導劑IPTG（終濃度0.07 mmoL/L），16 ℃誘導10 h。12 000 r/min，4 ℃離心10 min 收集菌體。加入30 mL PBS，吹打混勻，隨后冰浴條件下超聲細胞破碎，條件設置為功率100 W，工作2 s、停止2 s，時間10 min。細胞破碎液12 000 r/min，4 ℃離心15 min，取上清得重組酶粗酶液。重組酶已融合GST標簽蛋白，因此使用親和層析法對重組酶進行純化，層析柱為GST-Sepharose FF。具體步驟如下：粗酶液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾。加入7 個柱體積緩沖液1 平衡層析柱。將過濾好的上清液與緩沖液1 混勻，0.45 μm 濾膜過濾，上樣。加入20 個柱體積的緩沖液1 清洗層析柱。加入5 mL 緩沖液2 進行洗脫，收集含有純化的重組酶洗脫液。SDSPAGE 電泳檢測純化結果。

1.3.4 重組酶酶活和蛋白濃度測定 酶活采用3，5-二硝基水楊酸 （3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法進行測定[17]，步驟如下：首先將100 μL 重組酶酶液、700 μL 乙酸-乙酸鈉緩沖液 （pH 5.5）和200 μL 1%殼聚糖溶液（pH 5.5） 混勻后置于37 ℃水浴20 min，再加入2 mL DNS 溶液沸水浴7 min，最后用無菌水稀釋至5 mL 體積并在470 nm 處測定OD 值。使用經(jīng)高溫滅活的酶液作為對照。酶活定義：在上述反應條件下1 min 內生成1 μmol 還原糖所需的酶量。蛋白濃度測定參照考馬斯亮藍法[18]，以牛血清蛋白作標準蛋白。在6 組試管內分別加入不同體積的牛血清蛋白樣品溶液（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1 mL）、無菌水（1，0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL）、相同體積的考馬斯亮藍溶液（5 mL），充分混勻后放置5 min，在595 nm 處測定各管吸光度值，以吸光度值為縱坐標，牛血清蛋白樣品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，之后在比色管內將50 μL 純化后的重組酶洗脫液與5 mL 考馬斯亮藍溶液混勻，室溫靜置5 min，將測得的595 nm 處的吸光度值代入標準曲線求得重組酶濃度。

1.3.5 酶學性質測定 最適溫度： 將重組酶在25，30，34，37，41，46，51，55 ℃溫度下進行酶促反應，按照DNS 法測定酶活，以測得的酶活最大值為100%，計算各溫度下的相對酶活。

溫度穩(wěn)定性： 將重組酶在不同溫度下保溫15，30，45，60，80 min 之后在最適溫度下進行酶促反應，按照DNS 法測定酶活，以各溫度下未進行保溫處理的酶活為100%，計算各溫度下不同保溫時間的相對酶活。

最適pH 值：將重組酶分別加入到乙酸-乙酸鈉（pH 2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5）緩沖液及磷酸氫二鈉-檸檬酸（pH 7.0，7.5，8.0）緩沖液中，按照DNS 法測定酶活。以測得的酶活最大值為100%，計算各pH 值下的相對酶活。

pH 穩(wěn)定性： 將重組酶在不同pH 值下保溫30，60 min，在最適溫度下按照DNS 法測定酶活，以各pH 值下未進行保溫處理的酶活為100%，計算各pH 值下不同保溫時間的相對酶活。

不同金屬離子的影響： 在最適酶促反應體系中加入濃度為5 mmol/L 的不同金屬離子溶液（Fe3+、Cu2+、Zn2+、K+、Ca2+、Mn2+、Mg2+、Na2+、Ag+、Ni+、Hg+及EDTA），在37 ℃反應體系下溫浴20 min，470 nm 處測吸光度值，以未處理的體系測得的酶活為對照，定義對照組酶活為100%。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 每組試驗獨立重復3 次，使用Excel 和Orign 軟件（2020 版）進行數(shù)據(jù)處理和繪圖，結果以平均值±標準差形式進行表示。

2 結果與分析

2.1 重組酶酶活及蛋白純化濃度測定

重組酶誘導表達及純化結果如圖1所示，經(jīng)純化后得到一條相對分子質量大約為57 ku 的融合蛋白，其中含GST 標簽蛋白26 ku，目的蛋白31 ku。由考馬斯亮藍法得蛋白質濃度線性回歸方程y=4.36143x+0.0004，可得質量濃度為10.932 μg/mL。DNS 法測得酶活為6.135 U/mL，酶比活力561.19 U/mg。

圖1 SDS-PAGE 電泳分析Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis analysis

2.2 酶學性質測定

2.2.1 最適反應溫度與溫度穩(wěn)定性 由圖2a 可知不同溫度下（25～55 ℃）重組酶的酶活力，其酶活具有先增加后降低的趨勢，在37 ℃時酶活力最高，55 ℃時完全喪失活性。溫度穩(wěn)定性結果如圖2b，重組酶在37 和42 ℃下具有極其良好的穩(wěn)定性，在30 ℃時穩(wěn)定性略有下降，但仍能保持較高水平酶活，而在51 ℃以上的環(huán)境中穩(wěn)定性急劇下降，30 min 內即可導致酶活性喪失。

圖2 殼聚糖酶最適反應溫度（a）及溫度穩(wěn)定性（b）Fig.2 Optimum reaction temperature of chitosanase （a），temperature stability of chitosanase （b）

2.2.2 最適pH 值和pH 值穩(wěn)定性 由圖3a 可知，重組酶在pH 4.5 時具有最高酶活性。pH 4.5～5 范圍內具有80%以上的酶活性，隨著pH 值繼續(xù)升高，重組酶酶活力逐漸下降，pH 8.0 時酶活性基本喪失。由圖3b 可知，在pH 2.5～6.5 的條件下處理30 min，酶活有一定程度的下降，但整體剩余的酶活仍在70%以上。該酶在酸性環(huán)境下有較好的活性和穩(wěn)定性。

圖3 殼聚糖酶最適pH 值（a）和pH 值穩(wěn)定性（b）Fig.3 Optimal reaction pH of chitosanase （a），pH stability of chitosanase （b）

2.2.3 金屬離子及表面活性劑對殼聚糖酶的影響 0.5 mmol/L 金屬離子及表面活性劑對重組酶酶活性影響如圖4所示，金屬離子Mn2+、Ca2+、Mg+對酶活性具有一定程度的激活作用，其中Mn2+激活效果最明顯，可將酶活性提高至130%，Ca2+和Mg2+次之，可分別提升約10%，15%的酶活性。Cu2+、Zn2+、Ni+、Fe3+這些離子對重組酶的酶活性有比較明顯的抑制作用，Cu2+、Fe3+離子可削弱酶活至60%的水平，而Zn2+、Ni+離子可減少約50%的酶活。Ag+、Hg+會導致酶活性完全喪失。K+、Na+、EDTA 對重組酶的活性幾乎沒有影響，其中EDTA 的作用結果表明該蛋白的活性位點并無金屬離子配體。

圖4 金屬離子及表面活性劑對殼聚糖酶的影響Fig.4 The influence of metal ions and surfactants on chitosanase

3 討論

大腸桿菌作為一種常見的原核表達系統(tǒng)具有操作簡單、成本低、高生產(chǎn)率、表達速度快等優(yōu)點[19]。本試驗首次將中村芽胞桿菌該新物種體內的殼聚糖酶基因在大腸桿菌中實現(xiàn)異源表達并進行酶學性質分析。結果表明純化后的中村芽胞桿菌殼聚糖酶酶比活力為561.19 U/mg，遠高于Rivas 等[20]研究的芽孢桿菌屬殼聚糖酶（56.9 U/mg）以及段衫[5]重組表達的沙雷氏菌殼聚糖酶（69.7 U/mg），但是大大低于Lin 等[12]在大腸桿菌中表達的枯草芽孢桿菌殼聚糖酶（3 655 U/mg）。因此，認為中村芽胞桿菌殼聚糖酶相較于其它一些菌種在殼聚糖水解方面具有一定的優(yōu)勢。

重組表達后的中村芽胞桿菌殼聚糖酶最適溫度為37 ℃，42 ℃處理60 min 以上可以保持75%酶活，46 ℃下處理30 min 最低酶活仍然可以維持在50%，具有良好的溫度穩(wěn)定性。同其它殼聚糖酶相比最適溫度低10～15 ℃，但是溫度穩(wěn)定性要高5 ℃[21-22]，這與中村芽胞桿菌自身強環(huán)境耐受性特點相一致。在殼寡糖生產(chǎn)過程中通常會維持在較高的反應溫度，目的是為了加快反應速率，減少微生物的污染[23]，因此溫度穩(wěn)定性高的殼聚糖酶在工業(yè)生產(chǎn)中有縮小成本、降低風險等優(yōu)勢。有研究表明殼聚糖酶通過真核表達后最適溫度會提高10 ℃，溫度穩(wěn)定性提高5 ℃[24-25]，這可能是真核表達系統(tǒng)對酶進行糖基化修飾的結果[26]。后續(xù)可將中村芽胞桿菌殼聚糖酶在真核表達系統(tǒng)進一步優(yōu)化修飾表達增強其熱穩(wěn)定性。

中村芽胞桿菌殼聚糖酶的最適pH 值為4.5，在pH 4.0～5.5 處理60 min 后最低酶活仍可維持在70%以上這一較高水平，與枯草芽孢桿菌殼聚糖酶（最適pH 5.5）和芽孢桿菌屬TS（最適pH 5.0）相比在酸性環(huán)境下具有更強的耐受力[21-22]。殼聚糖降解過程隨著時間增加其溶液黏度會不斷上升以及流動性降低，最終會導致酶促反應被逐漸抑制，工業(yè)上常用的解決方法是加入鹽酸或醋酸等酸溶液來改變殼聚糖的構象從而降低黏度帶來的負面作用[14]，該步驟會導致溶液pH 值降低影響殼聚糖酶的活性，而中村芽胞桿菌殼聚糖酶較強的酸耐受力有更好的應用前景。

不同金屬離子和表面活性劑對中村芽胞桿菌殼聚糖酶的酶活力影響存在差異。K+和Na+對中村芽胞桿菌殼聚糖酶酶活性沒有影響的原因可能是因為這些離子在細胞內外分布最廣最常見，是細胞正常生存的必需離子，同時也是胞內進行滲透壓調節(jié)的最主要離子。EDTA 作為一種金屬離子絡合劑，并未影響中村芽胞桿菌殼聚糖酶酶活性，推測這是因為該酶活性中心不存在金屬離子所導致的[15]。Ag+、Hg+完全抑制中村芽胞桿菌殼聚糖酶的酶活性，這可能與Ag+、Hg+是重金屬離子相關，重金屬通常情況下會造成蛋白質變性，例如Hg+可與半胱氨酸殘基側鏈的巰基這一活性基團發(fā)生作用改變其空間折疊結構，使得底物配對幾率降低從而抑制酶的活性[27]。5 mmol/L 的Cu2+、Zn2+、Ni+、Fe3+對酶活性有40%～50%的抑制作用。在其它研究中，枯草芽孢桿菌殼聚糖酶的活性會被約6 mmol/L 的Cu2+、Fe3+完全抑制[20]。解淀粉芽孢桿菌殼聚糖酶酶活力會被0.1 mmol/L Cu2+和Fe3+減少40%，2 mmol/L Zn2+減少55%，1 mmol/L Ni+減少13%[4-5]，這與本文的研究結果相一致。此外，F(xiàn)e3+是一種具有較強電負性的金屬陽離子，可能會改變蛋白質分子的電荷分布，使得酶與底物的結合能力被降低[4]。Mn2+、Ca2+、Mg2+離子對中村芽胞桿菌殼聚糖酶有較明顯的激活作用，有研究表明枯草芽孢桿菌殼聚糖酶氨基酸序列的第186～198 位對應的天冬氨酸和天冬酰胺側鏈上的氧原子是Ca2+的激活結合位點，可以引起殼聚糖酶的空間結構發(fā)生變化，促進酶活性[28]。Mg2+可以作用在藍藻Ch1H蛋白H 亞基內第468 位纈氨酸，624 位亮氨酸，660 位谷氨酸等活性氨基酸構成的活性結合位點，促進底物激活作用，并且這些氨基酸序列在各種生物中是高度保守的[29]。在Tottey 等[30]的研究中，3 個組氨酸和1 個谷氨酸所形成的結構域會導致Cu2+和Zn2+與蛋白質結合的緊密程度往往比Mn2+更加穩(wěn)定，這與作者所研究的對酶活性效果影響最高的3 種離子Zn2+（降低50%），Cu2+（降低40%），Mn2+（促進30%）一致。因此推測在中村芽胞桿菌殼聚糖酶中也存在相似的結構位點，有必要進一步分析。隨著殼寡糖應用面不斷擴大，探索新型穩(wěn)定高效的殼聚糖酶來滿足日益增長的工業(yè)需求非常必要，本研究結果拓展了殼聚糖酶資源，為中村芽胞桿菌殼聚糖酶后續(xù)基礎研究和實際應用提供理論依據(jù)。