熊長輝，徐建民，楊 夢，宗 俊，潘歡弘，劉曉青

江西省疾病預(yù)防控制中心,江西南昌 330029

布魯菌病是由于感染布魯菌引起的人獸共患傳染病。我國引起布魯菌病的病原菌以羊種布魯菌居多，其中又以羊種3型布魯菌為主[1]。為了解江西省近年來布魯菌病流行情況，本研究對江西省近幾年分離的布魯菌進(jìn)行鑒定和基因多態(tài)性分析。

1 材料與方法

1.1菌株來源 近幾年從江西省布魯菌病監(jiān)測點(diǎn)及醫(yī)院送檢標(biāo)本中分離得到的布魯菌32株。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要儀器 生物安全柜(美國Thermo)、培養(yǎng)箱(日本EYELA SLI-1200)、超凈工作臺(江蘇蘇凈)、PCR儀(美國Bio-Rad)、自動凝膠成像儀(美國Bio-Rad)、高速冷凍離心機(jī)(德國Sigma 3-18K)、微量高速離心機(jī)(德國Eppendorf)。

1.2.2主要試劑及耗材 PCR引物(上海生工公司合成)、布氏瓊脂(BBL公司)、普通瓊脂糖(Geng公司)、細(xì)菌DNA提取試劑盒(凱杰生物)、PCR相關(guān)試劑均為大連寶生物公司產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌基因組DNA的提取 從平板上挑取純化培養(yǎng)后的布魯菌先滅活，再按照試劑盒說明書操作步驟，提取布魯菌的DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2布魯菌表面蛋白31(BCSP31)PCR鑒定 參考文獻(xiàn)[2],用BCSP31-PCR對布魯菌進(jìn)行鑒定。

1.3.3AMOS-PCR鑒定 參考文獻(xiàn)[2]，用AMOS-PCRρ[A、M、O、S分別為牛(Abortus)、羊(Melitensis)、綿羊(Ovis)、豬(Suits)首字母的縮寫]進(jìn)行布魯菌菌種的鑒定。

1.3.4rpoB基因檢測 布魯菌rpoB基因的PCR擴(kuò)增，上、下游引物分別為rpoB-F：5′-ATGGCTCAGACCCATTCTTTC-3′，rpoB-R：5′-TTATTCTGCCGCGTCCGGAA-3′。反應(yīng)體系(25 μL)：10×緩沖液2.5 μL，脫氧核苷三磷酸(dNTPs)2 μL，rpoB上、下游引物各1 μL，Taq酶(5 U/μL)0.5 μL，去離子超純水17 μL，模板1 μL。PCR條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3.5rpoB-PCR產(chǎn)物測序 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，獲得特異性目的條帶，并且送上海生工測序。測序結(jié)果用MEGA6.0軟件分析。

2 結(jié) 果

2.1BCSP31-PCR鑒定 所有菌株DNA的BCSP31-PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳，均顯示出布魯菌特異性條帶，部分菌株的BCSP31-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

注：M為分子標(biāo)準(zhǔn)帶；1～13為布魯菌BCSP31-PCR產(chǎn)物；+為陽性對照；-為陰性對照。

2.2AMOS-PCR鑒定 所有菌株DNA AMOS-PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳，均顯示出731 bp的羊種布魯菌特異性條帶，部分菌株的AMOS-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。

注：M為分子標(biāo)準(zhǔn)帶；1～13為布魯菌AMOS-PCR產(chǎn)物；+為陽性對照；-為陰性對照。

2.3rpoB基因檢測 所有菌株DNA的rpoB基因PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳，均顯示出4 300 bp的特異性條帶，部分菌株的rpoB基因PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖3。

注：M為分子標(biāo)準(zhǔn)帶；1～16為布魯菌rpoB基因PCR產(chǎn)物。

2.4rpoB-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序 通過MEGA6.0軟件分析其序列，N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，參數(shù)設(shè)置為“bootrap=500”“cutoff=90%”，羊種布魯菌rpoB基因高度同源，見圖4。

圖4 羊種布魯菌rpoB基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討 論

布魯菌病是全球范圍的動物源性人獸共患傳染病[3]，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球每年約有50萬布魯菌病新增病例[4-6]。并且布魯菌病感染早期癥狀與其他發(fā)熱性疾病癥狀非常相似，許多患者在發(fā)病早期極易被誤診為其他發(fā)熱性疾病，因此，探討布魯菌病患者早期快速診斷的方法對患者的治療和預(yù)后有積極的意義。盡管目前布魯菌病的診斷技術(shù)有了較大的提升，但仍存在診斷技術(shù)原因?qū)е碌恼`診和延遲診斷[7]。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，PCR檢測技術(shù)廣泛應(yīng)用于布魯菌的診斷，目前文獻(xiàn)報(bào)道的PCR方法很多，布魯菌屬水平的檢測一般用普通PCR，其中主要是以BCSP31(B4/B5)、16S rRNA、Virb8，外膜蛋omp25、omp31、LSP pgm等基因?yàn)橐罁?jù)設(shè)計(jì)引物[8-10]，而種水平的鑒定則用多重PCR方法，比如AMOS-PCR[11]。BCSP31是布魯菌中的一種免疫原性膜蛋白，存在于布魯菌的各種型菌株中，根據(jù)BCSP31蛋白的基因設(shè)計(jì)B4-B5引物進(jìn)行PCR，各種型菌株均可出現(xiàn)特異性擴(kuò)增產(chǎn)物[12]。AMOS-PCR檢測方法可從屬的水平上鑒定布魯菌，但不能區(qū)分具體種型。有文獻(xiàn)報(bào)道顯示，羊種菌依然是當(dāng)前主要流行種型，牛種菌次之，由此可見AMOS-PCR檢測方法可以涵蓋國內(nèi)的流行菌株，有較高的應(yīng)用價(jià)值[13]。本研究采用BCSP31基因?qū)杲魇》蛛x的布魯菌菌株進(jìn)行鑒定，采取AMOS-PCR進(jìn)行布魯菌菌種的鑒定，結(jié)果顯示江西省近年人感染的布魯菌均為羊種布魯菌。rpoB基因編碼DNA依賴的RNA聚合酶β亞單位，是一個(gè)高度保守的管家基因，也常被用作細(xì)菌鑒定的標(biāo)志基因和系統(tǒng)發(fā)育分析的位點(diǎn)[14-15]?；?6S rRNA的分析被普遍認(rèn)為能鑒定細(xì)菌至屬水平，而不能解決近緣種之間的分類問題[16-17]。rpoB基因表現(xiàn)出比16S rRNA更大的優(yōu)越性。李旦等[18]通過對布魯菌rpoB基因的研究，認(rèn)為rpoB基因能用于鑒定所有的布魯菌種及大部分的生物變種。ADEKAMBI等[19]認(rèn)為，rpoB基因測序能準(zhǔn)確反映細(xì)菌的鳥嘌呤加胞嘧啶的百分含量，DNA-DNA雜交水平及平均核苷酸同源性(2個(gè)菌株共享的全基因組序列的比例)，能在種和亞種水平反映細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，可作為一個(gè)強(qiáng)有力的微生物鑒定工具。本研究對近年江西省分離的布魯菌菌株rpoB基因序列進(jìn)行了同源分析，結(jié)果表明與江西省近年人感染的羊種布魯菌rpoB基因序列高度同源。本研究利用BCSP31-PCR和AMOS-PCR對江西省分離的布魯菌進(jìn)行了鑒定和分型，利用rpoB基因序列進(jìn)行同源分析，建立了用于布魯菌實(shí)驗(yàn)室鑒定和分型的方法，為布魯菌病的監(jiān)測和疫情的處置提供了更快捷的實(shí)驗(yàn)室檢測手段。