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        糖絡寧調控miR-211 對糖尿病周圍神經病變大鼠背根神經元凋亡的影響

        2022-10-20 13:39:50辛競妍朱雨菲吳長江謝文瑩張濤靜
        中國醫(yī)藥導報 2022年27期
        關鍵詞:高糖抑制劑神經元

        張 晨 陳 楓 辛競妍 朱雨菲 李 矜 吳長江 謝文瑩 張濤靜

        1.北京中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院,北京 100029;2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院內分泌科,北京 100078

        背根神經元(dorsal root ganglion neurons,DRGn)是人體內重要的感覺神經元,位于血神經屏障之外的特殊生理位置使其暴露在全身代謝和缺氧應激下,在高糖環(huán)境中更容易受到損害[1]。DRGn 細胞凋亡是糖尿病周圍神經病變(diabetic peripheral neuropathy,DPN)發(fā)生發(fā)展的重要因素[2-3]。既往研究發(fā)現(xiàn),高糖能抑制DPN 大鼠DRGn 細胞活性,糖絡寧可以降低高糖引起的細胞凋亡水平[4-5],其作用與內質網(wǎng)應激下的蛋白激酶R 樣內質網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)/C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)凋亡通路有關[6],而更深層的介導基因尚未明確。微RNA(microRNA,miRNA)在內質網(wǎng)應激下是調控細胞從保護性的未折疊蛋白反應轉至激活凋亡的關鍵因子[7-8],其中miR-211 依賴PERK 誘導而作用于促凋亡轉錄因子CHOP 的表達[9]。本研究以miR-211 為切入點,通過體外實驗觀察糖絡寧對大鼠DRGn 凋亡的影響及miR-211 在其中的作用,探討其治療DPN 的作用機制。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物

        用于制備含藥血清和空白血清的SPF 級SD 大鼠[60 只,8 周齡雄性,體重(200±30)g]及用于提取DRGn 細胞的SPF 級SD 懷孕大鼠均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2016-0006。大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學動物實驗中心,實驗室環(huán)境為國標GB14925-2001[10]規(guī)定的動物實驗設施及大鼠SPF 級屏障環(huán)境。本研究經北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(201811)。實驗中心溫度(20±2)℃,濕度45%~65%,12 h 明暗交替。

        1.2 實驗用藥

        糖絡寧制劑(由生黃芪、丹參、川牛膝、狗脊、全蝎組成)為北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院藥房提供,濃度為生藥0.5 g/ml。

        1.3 主要試劑及儀器

        BeyoRTTMⅡcDNA 第一鏈合成試劑盒(碧云天公司,批號:D7168S)、BCA 蛋白濃度測定試劑盒(MDL,批 號:MD913053)、Annexin V-FITC/PI Kit/凋亡檢測試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司,批號:FXP018)、Neurobasal 培養(yǎng)基(Gibco,批號:21103049)、兔抗PERK、轉錄激活因子4(activator of transcription 4,ATF4)、真核細胞起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α,eIF2α)(abcam,批號:ab186284、ab216839、ab32157)、兔抗CHOP(Cell Signaling 公司,批號:L63F7)、低溫離心機(德國Sigma 公司,型號:3-30K)、熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)儀(美國Applied biosystems,型 號:StepOne Softwar),電泳儀(北京百晶生物技術有限公司,型號:BG-subMIDI)。

        1.4 研究方法

        1.4.1 糖絡寧含藥血清的制備 雄性SD 大鼠60 只,適應性喂養(yǎng)1 周后,采用隨機數(shù)字表法將其分為糖絡寧含藥血清組(30 只)和空白血清組(30 只),分別以糖絡寧組方生藥2.5 g/(kg·d)灌胃和等體積蒸餾水灌胃,連續(xù)給藥10 d,末次給藥后2 h 內以2%戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,腹主動脈取血,3000 次/min重復10 min(半徑95 mm,溫度4℃)離心,分離血清水浴滅活,過濾除菌后,-80℃環(huán)境中冷凍保存。

        1.4.2 DRGn 細胞分離培養(yǎng)及分組 DRGn 細胞分離培養(yǎng)參照既往實驗[11-12],神經元專用培養(yǎng)基中細胞貼壁達70%~80%后,進行分組。將細胞分為正常組、高糖組、糖絡寧組、miR-211 抑制劑陰性組和miR-211 抑制劑組。正常組給予10%空白血清+神經元專用培養(yǎng)基;高糖組給予10%空白血清+高糖神經元專用培養(yǎng)基(含50 mmol/L 葡萄糖);糖絡寧組予10%糖絡寧含藥血清+高糖神經元專用培養(yǎng)基;miR-211 抑制劑陰性組和miR-211 抑制劑組分別先予空載體和miR-211 抑制劑載體轉染DRGn 細胞,再予10%空白血清+高糖神經元專用培養(yǎng)基培養(yǎng)。各組細胞干預24 h,隨后收集細胞進行相關檢測。

        1.4.3 流式細胞儀檢測 經胰酶消化、1 000 次/min 重復5 min 二次離心(離心半徑95 mm,溫度4℃)及稀釋(調節(jié)濃度為1×105~5×105個/ml)后收集細胞懸液于流式管中。室溫避光孵育,孵育5 min 后加入10 μl碘化丙錠溶液、400 μl PBS,立刻進行流式檢測,用Cell Quest 軟件進行分析,繪制雙色散點圖。

        1.4.4 實時熒光定量PCR 提取各組實驗細胞miR-211,使用BeyoRTTMⅡcDNA 第一鏈合成試劑盒將miR-211合成cDNA,根據(jù)引物設計原則,利用Primer 6 設計合成引物,引物序列見表1。取上述cDNA 及對應引物,開始qRT-PCR 反應程序,反應體系共20 μl:cDNA 2 μl,master mix 10 μl,正向引物1 μl,反向引物1 μl,ddH2O 6 μl。反應條件見表2。每次反應均設陰性平行對照組,實驗重復3 次,根據(jù)得到的熒光信號計算Ct 值及基因的相對表達量。

        表1 miR-211 引物序列

        表2 聚合酶鏈式反應條件

        1.4.5 Western blot 采用細胞懸液5 倍體積的細胞裂解液,提取總蛋白,經BCA 試劑盒進行濃度測定后,SDS-PAGE 法分離蛋白質,轉移至PVDF 膜,5%脫脂奶粉溶液封閉搖動1 h,采用兔PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜,并用HRP 標記山羊抗兔IgG(H+L)室溫下孵育60 min(1∶4 000),最終顯色成像獲得蛋白條帶,Image J 軟件計算灰度值。

        1.5 統(tǒng)計學方法

        采用SPSS 26.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用均數(shù)±標準差()表示,比較采用t 檢驗。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結果

        2.1 五組細胞凋亡率比較

        高糖組細胞凋亡率高于正常組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。高糖組與miR-211 抑制劑陰性組細胞凋亡率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P >0.05)。糖絡寧組和miRNA-211 抑制劑組細胞凋亡率低于高糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。見圖1~2。

        圖1 各組細胞凋亡率散點圖

        圖2 五組細胞凋亡率比較(n=3)

        2.2 五組miR-211 基因表達情況比較

        高糖組miR-211 基因表達高于正常組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。高糖組與miR-211 抑制劑陰性組miR-211 基因表達比較,差異無統(tǒng)計學意義(P >0.05)。糖絡寧組和miR-211 抑制組miR-211 基因表達低于高糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。見圖3。

        圖3 五組miR-211 基因表達情況比較(n=3)

        2.3 五組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達水平比較

        高糖組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達水平高于正常組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。高糖組與miR-211 抑制劑陰性組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP蛋白表達水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P >0.05)。糖絡寧組和miRNA-211抑制組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達水平低于高糖組,差異有統(tǒng)計學意義(P <0.05)。見圖4~5。

        圖4 五組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達條帶圖

        圖5 五組PERK、eIF2α、ATF4、CHOP 蛋白表達水平比較

        3 討論

        糖尿病周圍神經病變屬于中醫(yī)“消渴病痹癥”范疇,以氣虛血瘀或陰虛血瘀,氣陰兩虛夾瘀,陰陽兩虛夾痰瘀,陽虛寒凝,肝腎虧虛的規(guī)律動態(tài)演變[13-15]。高彥彬教授基于絡病理論,認為其病機本質為氣陰兩虛、脈絡瘀阻,治療上強調以滋陰補氣、活血化瘀通絡為要,研制出中藥成方糖絡寧,臨床療效確切[16]。經既往研究證實,糖絡寧可以減輕內質網(wǎng)應激的損害,抑制坐骨神經及施萬細胞中PERK/IRE1α-CHOP、PI3K/Akt通路的表達,改善施萬細胞及DRGn 細胞凋亡[17-22]。

        目前臨床普遍認為,血糖升高會激發(fā)內質網(wǎng)應激,長期持續(xù)的應激和細胞損傷啟動細胞凋亡,但在應激背景下如何協(xié)調其他通路啟動細胞凋亡,其轉變的關鍵節(jié)點仍在探索。研究發(fā)現(xiàn),PERK 信號依賴性的miR-211 可以抑制生物鐘協(xié)調新陳代謝和晝夜節(jié)律,限制蛋白質超負荷,是內質網(wǎng)應激下調節(jié)凋亡的潛在靶點[23]。本團隊前期通過基因芯片篩選發(fā)現(xiàn),糖絡寧對DPN 的治療作用與miR-211 的下調有關[24],基于前期實驗提出設想:糖絡寧可能通過作用于miR-211下調PERK/CHOP 凋亡通路而保護背根神經元。本研究結果顯示,高糖組細胞miR-211 與PERK/CHOP通路均顯著升高,且呈現(xiàn)出高凋亡率,提示高糖誘導下的背根神經節(jié)中,miR-211 顯著過表達可促進DRGn 細胞中PERK/CHOP 通路的表達及細胞凋亡,可能導致細胞功能障礙。糖絡寧組DRGn 細胞凋亡率降低,miR-211 和PERK/CHOP 通路表達下調,達到與miR-211 基因沉默的相似效果,提示糖絡寧可能通過作用于miR-211 下調凋亡通路而保護DRGn細胞,治療DPN。

        DPN 是糖尿病并發(fā)癥中較為特殊的一種,治療局限在預防性管理與疼痛控制上[25-28],針對病理機制的治療方法仍在探索。目前臨床主要關注神經在營養(yǎng)超負荷下的能量代謝問題,糖尿病營養(yǎng)物質代謝紊亂時神經元的內質網(wǎng)和線粒體功能如何調節(jié)、過量葡萄糖和脂質對神經能量的作用是否協(xié)同一致等尚未被解釋。針對神經的能量利用是開發(fā)DPN 有效療法的途徑,miRNA 被認為是其中的關鍵靶點[29]。本研究從細胞角度分析糖絡寧對DPN 模型大鼠背根神經元凋亡的作用,結果顯示其機制與抑制miR-211 表達有關,但miR-211 如何靶向調控基因抑制凋亡及糖絡寧如何抑制miR-211 的表達仍需進一步探索。

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