朱雪成， 劉 靜， 馬紅勃， 王 靜， 劉立偉， 馮國(guó)華， 劉東濤

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇徐州 221131)

小麥?zhǔn)鞘澜缰饕Z食作物之一，因具有極強(qiáng)的適應(yīng)性而在全球廣泛分布。從極地附近的北歐地區(qū)到赤道附近的北非，從盆地吐魯番到“世界屋脊”青藏高原都有小麥的身影。小麥極強(qiáng)的適應(yīng)性主要得益于其長(zhǎng)期演化出的不同生態(tài)發(fā)育類型。

小麥的生態(tài)發(fā)育類型主要受其本身的春化特性和光周期特性影響。春化特性是指小麥在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期需要經(jīng)歷一定時(shí)間和一定范圍的低溫，才能夠進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段，進(jìn)而抽穗開花并且灌漿成熟的特性。根據(jù)其對(duì)低溫范圍和低溫時(shí)間要求的不同，一般將小麥品種劃分為春性、半冬性、冬性、強(qiáng)冬性4類。春性品種對(duì)春化要求最低，不需要低溫階段即可抽穗開花；而強(qiáng)冬性品種一般需要 0～3 ℃下40～50 d的低溫才能夠通過春化階段，否則不能抽穗開花。目前報(bào)道控制小麥春化特性的基因包括、、這3個(gè)開花促進(jìn)因子，和1個(gè)開花抑制因子。作為開花抑制因子，發(fā)生突變時(shí)小麥表現(xiàn)為早花和春性，但是由于基因包含2個(gè)功能冗余的基因，因此只有在小麥3個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變時(shí)該基因才會(huì)失去功能，目前在自然界中尚未發(fā)現(xiàn)該類型小麥。的顯性等位變異是在啟動(dòng)子上插入了一個(gè)逆轉(zhuǎn)座子，該突變可以降低小麥春化需求，但是僅在極少數(shù)品種中出現(xiàn)這類變異?；蛭挥谛←?D染色體的短臂上，且十分靠近著絲粒，該基因受春化作用調(diào)節(jié)小麥的生殖生長(zhǎng)，其功能與下文中的、基因相似且弱于，關(guān)于的研究有待進(jìn)一步深入。

目前研究最為深入的春化基因——基因，在六倍體普通小麥當(dāng)中存在3個(gè)部分同源基因：、、，分別被定位在5A、5B、5D染色體的長(zhǎng)臂上。在位點(diǎn)具有、、這3個(gè)顯性等位變異。這3種顯性等位變異分別在啟動(dòng)子和第一內(nèi)含子區(qū)域發(fā)生了片段插入、序列復(fù)制、缺失以及堿基突變，導(dǎo)致表達(dá)量上升，降低春化需求?；蚰壳耙寻l(fā)現(xiàn)3種顯性等位變異類型，分別是、、。該位點(diǎn)的顯性等位變異均是在第一內(nèi)含子區(qū)域發(fā)生的缺失、堿基突變以及序列重復(fù)。位點(diǎn)存在3個(gè)顯性等位變異：、、，與隱性基因相比，的第一內(nèi)含子缺失了一段4 235 bp的序列；在缺失相同片段的同時(shí)，還在翻譯起始位點(diǎn)上游161 bp處發(fā)生單堿基突變；在啟動(dòng)子區(qū)域有175 bp堿基的插入。有學(xué)者認(rèn)為，的3個(gè)部分同源基因當(dāng)中至少有一個(gè)為顯性時(shí)，那么該小麥品種表現(xiàn)為春性性狀；當(dāng)這3個(gè)等位基因全為隱性時(shí)，小麥表現(xiàn)為冬性性狀。但是春化特性并不是簡(jiǎn)單的質(zhì)量性狀，而是存在中間過渡區(qū)域的數(shù)量性狀。也有研究認(rèn)為，攜帶等位變異、品種分別表現(xiàn)為弱春性和半冬性。趙虹等曾對(duì)黃淮南片麥區(qū)的部分小麥品種進(jìn)行春化基因分子標(biāo)記鑒定，認(rèn)為目前僅用春化基因來確定品種冬春性存在一定的不完善之處。除了生育期性狀，春化基因還對(duì)小麥農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量具有一定影響。簡(jiǎn)俊濤等對(duì)我國(guó)366份小麥品種進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)我國(guó)小麥春化基因的多樣性主要在位點(diǎn)上。

黃淮南片麥區(qū)作為我國(guó)重要的糧食產(chǎn)區(qū)，地處南北方過渡地帶，屬于大陸性季風(fēng)氣候，近幾十年來氣候異常導(dǎo)致早期低溫凍害、春季倒春寒、后期干熱風(fēng)等氣象災(zāi)害頻發(fā)，小麥的安全生產(chǎn)受到嚴(yán)重威脅。近年來，小麥審定品種急劇增加，但這些新品種(系)的春化基因類型并不清楚。本研究利用分子標(biāo)記鑒定了黃淮麥區(qū)部分品種的春化基因類型，并分析了不同基因型品種的生育期以及冬季抗寒性特點(diǎn)，以期為高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)小麥新品種培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和地點(diǎn)

試驗(yàn)材料為2020—2021年度參加國(guó)家黃淮南片水地組區(qū)試參試材料82份、國(guó)家黃淮南片冬水組中種聯(lián)合體區(qū)試參試材料12份、江蘇省淮北片小麥區(qū)試材料27份以及江蘇省徐州農(nóng)科所科企淮北小麥聯(lián)合體參試材料15份，共計(jì)136份小麥新品系。試驗(yàn)地點(diǎn)為江蘇省徐州市，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次，小區(qū)面積13.34 m，機(jī)械條播。

1.2 春化基因的分子標(biāo)記鑒定

采用改良CTAB法提取小麥基因組DNA，取樣時(shí)每份材料取3個(gè)不同單株上的葉片，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確。

基因檢測(cè)根據(jù)Yan等設(shè)計(jì)的春化基因、、的STS特異性分子標(biāo)記引物，詳細(xì)信息見表1。所有引物均由生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為10 μL，包括模板DNA 30～40 ng、10×buffer 1 μL、dNTPs 150 μmol/L、DNA聚合酶1 U，引物VRN1AF/VRN1-INT1R為每條3 pmol，其他引物為每條引物5 pmol。取3 μL的PCR反應(yīng)產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠(含goldview)中進(jìn)行電泳分離檢測(cè)，電泳緩沖液為1×TBE溶液。120 V電泳 30～40 min 后，用Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照成像并保存。

表1 春化基因位點(diǎn)Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1引物序列、擴(kuò)增片段及其相關(guān)信息

1.3 田間性狀的記載和數(shù)據(jù)分析

幼苗習(xí)性：在12月20日前后記載，分匍匐、半匍匐、直立3種類型。

越冬期凍害：越冬期在寒流過后10 d左右分2個(gè)階段記載，分5級(jí)。1級(jí)：無凍害；2級(jí)：葉尖受凍發(fā)黃不超過1/3；3級(jí)：葉片凍死1/3至1/2；4級(jí)：葉片全枯；5級(jí)：植株或大部分分蘗凍死。

抽穗期：以50%以上植株的頂端第1小穗露出葉鞘的日期為準(zhǔn)，從播種到抽穗的日數(shù)為抽穗期。

成熟期：75%麥穗中部籽粒形態(tài)、大小及顏色接近本品種正常狀態(tài)，籽粒變硬(用指甲不易劃破)的日期，從播種到成熟的日數(shù)為成熟期。

數(shù)據(jù)分析采用 Excel 和 SPSS 20 軟件，進(jìn)行獨(dú)立樣本T測(cè)驗(yàn)、方差分析及相關(guān)性分析，差異顯著水平為5%。

2 結(jié)果與分析

2.1 Vrn1基因等位變異的分子檢測(cè)

供試材料分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果詳見表2。在位點(diǎn)上，首先利用引物VRNA1F/VRN1-IN1R檢測(cè)，所有材料都擴(kuò)增出了734 bp的條帶，并沒有965+876、714 bp的條帶產(chǎn)生(圖1-A)。說明這些材料的基因型可能是或；進(jìn)一步檢測(cè)結(jié)果中，在引物 Intrl/A/F2、Intrl/A/R3檢測(cè)下沒有條帶產(chǎn)生(圖1-B)，在Intrl/C/F、Intrl/AB/R檢測(cè)下都擴(kuò)增出了1 068 bp的條帶(圖1-C)，說明供試材料在位點(diǎn)上均為隱性基因。

表2 供試材料及其Vrn1基因的等位變異

檢測(cè)位點(diǎn)時(shí)，在特異引物Intrl/B/F與Intrl/B/R3的擴(kuò)增下所有材料沒有條帶產(chǎn)生(圖2-A)；在Intrl/B/F與Intrl/B/R4引物中都擴(kuò)增出了1 149 bp的條帶(圖2-B)。說明在該位點(diǎn)上供試材料均為隱性基因。

而在位點(diǎn)上有漯麥68等31份材料在引物Intrl/D/F與Intrl/D/R3的檢測(cè)下擴(kuò)增出了1 671 bp大小的條帶(圖3-A)，其余材料沒有條帶；在引物Intrl/D/F與Intrl/D/R4的檢測(cè)下，這31份材料沒有條帶產(chǎn)生，泛麥26等105份材料擴(kuò)增出997 bp大小的條帶(圖3-B)；2對(duì)引物結(jié)果互補(bǔ)。說明泛麥26等105份材料攜帶在位點(diǎn)上為隱性基因，占比77.2%；而漯麥68等31份材料可能為或。利用另2對(duì)引物進(jìn)一步檢測(cè)，顯示漯麥68等31份材料在引物VRN1DF/VRN1-SNP161CR的擴(kuò)增下沒有條帶產(chǎn)生(圖3-C)，而在VRN1DF/VRN1-SNP161AR引物下都擴(kuò)增出612 bp(圖3-D)的條帶；說明全部攜帶顯性等位基因，占比22.8%。

2.2 春化基因?qū)π←溕诘男?yīng)

由表3可知和基因型小麥品種在抽穗期上存在顯著差異，攜帶的材料平均抽穗期182.77 d，比攜帶隱性基因的材料早抽穗1.09 d。攜帶基因的小麥成熟期平均值為234.32 d，平均比春化基因全為隱性的材料早成熟0.22 d，2種基因型間在成熟期上差異并不顯著。

表3 春化基因Vrn-D1對(duì)小麥生育期的影響

2.3 春化基因型、苗期習(xí)性與冬季凍害程度的關(guān)系

根據(jù)苗期習(xí)性將供試材料分為匍匐、半匍匐、直立3類。如圖4所示，基因型中的匍匐、半匍匐、直立的品種分別占3.23%、67.74%、29.03%；在基因型中該比例分別為7.62%、62.86%、29.52%；2種基因型中各苗期習(xí)性品種占比十分接近。可見顯性基因?qū)π←溍缙诹?xí)性并無顯著影響。

由表4可知，攜帶春化基因的材料與春化基因全為隱性的材料之間凍害程度差異不顯著。匍匐、半匍匐的品種的平均凍害程度分別為1.89、2.06，但是兩者差異不顯著；而苗期習(xí)性為直立的材料平均凍害程度為2.60，與以上2類差異達(dá)到顯著水平。可見苗期習(xí)性為匍匐、半匍匐的小麥品種抗寒性較強(qiáng)，苗期直立的材料抗寒性較弱；顯性等位變異對(duì)小麥的抗寒性沒有顯著影響。

表4 不同春化基因型、苗期習(xí)性品種的冬季凍害差異性分析

2.4 小麥生育期與冬季抗寒性的相關(guān)性分析

由表5可知，小麥抽穗期與成熟期呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.32，說明抽穗越早的品種其成熟期也越早；抽穗期與越冬期凍害呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.19，即抽穗越早的品種越冬期凍害嚴(yán)重，冬季抗寒性差。

表5 小麥生育期與凍害的相關(guān)性

3 討論與結(jié)論

3.1 Vrn-D1的分布頻率

李哲等曾對(duì)來自我國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)的276份品種進(jìn)行春化基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)顯性基因主要分布在東北北部春麥區(qū)和西北春麥區(qū)，顯性基因主要分布在東北春麥區(qū)、西北春麥區(qū)和西南冬麥區(qū)；而顯性基因的分布非常廣泛，在長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)、西南冬麥區(qū)、東北春麥區(qū)、西北春麥區(qū)和黃淮冬麥區(qū)都有分布。這與本研究中黃淮麥區(qū)小麥的顯性春化基因都集中在位點(diǎn)上的結(jié)果相一致。郭憲瑞等曾對(duì)黃淮麥區(qū)小麥品種中、這2種顯性等位變異進(jìn)行檢測(cè)，在他們的結(jié)果中，在黃淮麥區(qū)品種中的分布頻率分別為11.5%和19.7%。而本次試驗(yàn)的供試材料中并未出現(xiàn)顯性等位變異?？紤]到前者的試驗(yàn)材料選育時(shí)間的分布較為廣泛，甚至包含一些年代久遠(yuǎn)的地方品種，而本研究的試驗(yàn)材料均為近2年參加大區(qū)試驗(yàn)的新品種(系)，猜測(cè)可能的原因是基因的春性效應(yīng)較強(qiáng)，已經(jīng)不適應(yīng)如今黃淮麥區(qū)的氣候變化或栽培措施，導(dǎo)致其在育種過程中正被逐漸淘汰。

3.2 春化基因與抗寒性

黃淮麥區(qū)的品種主要是春化基因全為隱性的冬性品種和攜帶顯性春化基因的弱春/半冬性品種。近年來黃淮麥區(qū)冬季低溫凍害和春季倒春寒頻繁發(fā)生，嚴(yán)重威脅糧食生產(chǎn)安全，因此提高主栽品種的抗寒性愈發(fā)重要。游光霞等認(rèn)為基因全為隱性的品種冬季抗寒性較好，在育種過程中也有很多育種家根據(jù)冬春性來判斷品種的抗寒性。而新的研究表明小麥的冬春性和抗寒性屬于2種特性，受2種基因控制，只是由于基因連鎖的原因，大多數(shù)春性品種抗寒性較差。本研究結(jié)果顯示，顯性等位變異-對(duì)小麥越冬期抗寒性并無顯著影響。有部分品系(現(xiàn)麥686、鄭研麥176、輪選124等)的3個(gè)位點(diǎn)全為隱性，根據(jù)洛陽(yáng)農(nóng)林科學(xué)院國(guó)家小麥冬春性鑒定結(jié)果顯示也均為冬性，抽穗期較均值遲2 d以上，但這些品種在苗期表現(xiàn)為直立，凍害也達(dá)到3級(jí)，說明依據(jù)冬春性來判斷小麥抗寒性的方法有待商榷。小麥的抗寒性除了抗冬季低溫還包括抗春季倒春寒，本年度春季未發(fā)生明顯的倒春寒現(xiàn)象，所以供試材料的抗倒春寒能力并未體現(xiàn)出差異。在以后的研究中將結(jié)合生理生化指標(biāo)進(jìn)行田間直接鑒定或者人工氣候室模擬鑒定，對(duì)小麥倒春寒抗性進(jìn)一步研究。