王澤涵， 于文濤， 樊曉靜， 劉財(cái)國(guó)， 房婉萍， 蔡春平， 葉乃興

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州 350002； 2.福州海關(guān)技術(shù)中心/福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350001；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京 210095)

茶樹(shù)[(L.) O. Kuntze]起源于中國(guó)，我國(guó)的茶樹(shù)種質(zhì)資源十分豐富。福建省漳州市位于福建省南部，毗鄰廣東省，該地獨(dú)特的氣候十分適宜茶樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育，該地有大量的地方特異性茶樹(shù)種質(zhì)資源。目前在漳州市南部的云霄縣、詔安縣等地陸續(xù)發(fā)現(xiàn)野生茶樹(shù)群落。然而近年來(lái)漳州部分地區(qū)的茶樹(shù)資源并未得到有效保護(hù)，出現(xiàn)亂砍濫伐等現(xiàn)象。本研究采集漳州市云霄縣、詔安縣2地的茶樹(shù)種質(zhì)資源，構(gòu)建DNA指紋圖譜和分子身份證，有利于對(duì)漳州市地方茶樹(shù)資源的鑒定和保護(hù)。

20世紀(jì)以來(lái)，DNA分子標(biāo)記技術(shù)如RFLP、RAPD、SSR以及SNP等開(kāi)始應(yīng)用于種質(zhì)資源方面的研究。分子標(biāo)記技術(shù)在構(gòu)建指紋圖譜和分子身份證等方面已有較多運(yùn)用。SNP分子標(biāo)記技術(shù)具有自動(dòng)化、高通量、遺傳穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。王大莉用SNP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)不同品種香菇進(jìn)行指紋圖譜的構(gòu)建。魏中艷等利用SNP技術(shù)對(duì)不同區(qū)域大豆進(jìn)行DNA指紋圖譜構(gòu)建，并根據(jù)大豆的特性構(gòu)建分子身份證。樊曉靜等用SNP標(biāo)記技術(shù)并同茶樹(shù)種質(zhì)基本信息結(jié)合，構(gòu)建了103份茶樹(shù)種質(zhì)資源的分子身份證。此前筆者所在課題組已對(duì)漳州南部特色茶樹(shù)種質(zhì)進(jìn)行了報(bào)道，但關(guān)于該地區(qū)茶樹(shù)種質(zhì)資源分子身份證的構(gòu)建未見(jiàn)相關(guān)研究。本研究利用SNP標(biāo)記及茶樹(shù)種質(zhì)的基本信息對(duì)74份茶樹(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行指紋圖譜和分子身份證的構(gòu)建，旨在為該地區(qū)茶葉地方種質(zhì)的保護(hù)、利用、開(kāi)發(fā)和后續(xù)的選育等工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料共74份，于2020年11月分別采自福建省漳州市的云霄縣南烏山、烏山、大帽山、小帽山、梁山、雞籠山和詔安縣秀篆鎮(zhèn)寨坪村和龍傘山。其中，云霄縣茶樹(shù)種質(zhì)61份，詔安縣茶樹(shù)種質(zhì)13份。茶樹(shù)品種的基本信息見(jiàn)表1。茶樹(shù)鮮葉放入 -80 ℃ 冰箱冷凍保存。

表1 漳州南部74份茶樹(shù)種質(zhì)基本信息

1.2 樣品DNA的提取

茶樹(shù)DNA樣品的提取和濃度檢測(cè)詳見(jiàn)樊曉靜等的方法。

1.3 SNP位點(diǎn)的挖掘和最佳SNP位點(diǎn)的篩選

本研究所用的茶樹(shù)SNP位點(diǎn)共24個(gè)，詳細(xì)的選用見(jiàn)樊曉靜等的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用GenAlEx6.503軟件進(jìn)行位點(diǎn)多態(tài)性分析。利用數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)篩選和分析，確定每個(gè)SNP位點(diǎn)處的樣品基因型。將茶樹(shù)的基本信息與其24個(gè)SNP位點(diǎn)信息相結(jié)合，并用條碼生成器和二維碼在線生成軟件以數(shù)字條形碼和二維碼的形式構(gòu)建茶樹(shù)種質(zhì)分子身份證。

2 結(jié)果與分析

2.1 福建漳州南部茶樹(shù)種質(zhì)資源SNP標(biāo)記多態(tài)性描述

通過(guò)對(duì)96個(gè)位點(diǎn)的篩選，獲得78個(gè)多態(tài)性強(qiáng)、適用于福建漳州南部茶樹(shù)種質(zhì)基因分型的特異性引物。78個(gè)SNP標(biāo)記多態(tài)性信息指數(shù)為0.040～0.693，平均值為0.426。觀測(cè)雜合度范圍為0.014～1.000，平均值為0.345。期望雜合度的范圍為0.013～0.500，平均值為0.276。固定指數(shù)為 -1.000～0.660，平均值為-0.114。次等位基因頻率范圍為0.047～0.541，平均值為0.219(表2)。

2.2 福建漳州南部茶樹(shù)種質(zhì)資源指紋圖譜的構(gòu)建

通過(guò)SNP數(shù)據(jù)分析軟件，可以得出每個(gè)SNP位點(diǎn)上每個(gè)茶樹(shù)種質(zhì)是純合子(XX，YY)或雜合子(XY)。筆者所在課題組前期從96個(gè)SNP位點(diǎn)中篩選出了24個(gè)多態(tài)性較高的位點(diǎn)，74份茶樹(shù)種質(zhì)的位點(diǎn)信息見(jiàn)表2，構(gòu)建的指紋圖譜見(jiàn)圖1。

表2 漳州南部茶樹(shù)種質(zhì)資源78個(gè)SNP標(biāo)記多態(tài)信息

2.3 福建漳州南部茶樹(shù)種質(zhì)資源分子身份證的構(gòu)建

茶樹(shù)的分子身份證由28位數(shù)字組成，其中前4位數(shù)字是茶樹(shù)的基本信息，后24位是茶樹(shù)的位點(diǎn)信息(表3)。筆者所在課題組前期已根據(jù)茶組植物的分類、產(chǎn)地信息和茶樹(shù)種質(zhì)資源的類型進(jìn)行了種植資源信息編碼的構(gòu)建。如云霄云香茶，它屬于茶組植物中的茶樹(shù)()，編碼為1；原產(chǎn)地為福建，編碼為35；茶樹(shù)種質(zhì)資源類型為地方種質(zhì)，編碼為2，因此他的基本信息編碼為1352。共有24種基因型，3種等位基因(XY、XX和YY)，每個(gè)位點(diǎn)分別用1～3代表等位基因的多態(tài)性。以云霄云香茶為例，其24個(gè)SNP分子標(biāo)記的基因型分別為T(mén)T、CC、AA、CT、AG、GG、TC、CC、TT、TT、TT、AG、AG、GG、TT、AG、TT、TC、TC、TT、CG、AA、CC、TC，轉(zhuǎn)換成24位數(shù)字為222112132221123131131331。因此小帽山云香茶的分子身份證為135222211213222112 3131131331。云霄云香茶的身份證信息及其轉(zhuǎn)化的條碼和二維碼見(jiàn)圖2。

表3 福建漳州南部茶樹(shù)種質(zhì)資源的分子身份證

3 討論與結(jié)論

分子身份證的構(gòu)建逐漸趨向于數(shù)字化。陸徐忠等用SSR技術(shù)將商品信息與標(biāo)記信息相結(jié)合構(gòu)建了水稻的分子身份證，并制作了相應(yīng)的條形碼信息。陳小紅等用SSR技術(shù)，根據(jù)電泳條帶有無(wú)賦值1/0，形成0/1字符串的編碼方式構(gòu)建黍稷種質(zhì)的身份證。上述方法所構(gòu)建的品種身份證形式簡(jiǎn)潔，容易用電子產(chǎn)品等識(shí)別。但他們所使用的SSR標(biāo)記多為隨機(jī)標(biāo)記，無(wú)法與樣品表型性狀相聯(lián)系。相對(duì)于上述技術(shù)，SNP標(biāo)記技術(shù)具有針對(duì)性強(qiáng)，來(lái)源豐富等優(yōu)勢(shì)。張昆鵬用SSR標(biāo)記和SNP標(biāo)記構(gòu)建不同油菜品種的指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)SNP技術(shù)計(jì)算的遺傳系數(shù)更精準(zhǔn)可靠。Jones等為了對(duì)SSR標(biāo)記和SNP標(biāo)記進(jìn)行比較，以不同品系的玉米作為試驗(yàn)材料進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明SNP的可重復(fù)性較SSR更高。通過(guò)前人的研究可以發(fā)現(xiàn)SNP標(biāo)記具有較高的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，這些優(yōu)點(diǎn)為指紋圖譜和分子身份證的構(gòu)建奠定了一定的基礎(chǔ)。因此本研究基于SNP技術(shù)對(duì)福建漳州南部的茶樹(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行指紋圖譜和分子身份證的構(gòu)建。

分子身份證可以更加簡(jiǎn)單明了地進(jìn)行種質(zhì)資源的鑒定。本研究構(gòu)建了74份茶樹(shù)種質(zhì)的分子身份證，包含二維碼信息和條形碼信息，每份茶樹(shù)品種獨(dú)有且號(hào)碼唯一?；诓铇?shù)的身份證號(hào)，本研究構(gòu)建了條形碼和二維碼，條形碼可以被電子設(shè)備快速掃描識(shí)別，二維碼則可以容納大量的圖片和數(shù)字信息。這些技術(shù)的使用在漳州南部茶樹(shù)種質(zhì)資源的鑒定和保護(hù)中發(fā)揮重要的作用。SNP位點(diǎn)選用的越少，品種的成本就會(huì)越低，筆者所在課題組前期篩選出最佳的24個(gè)SNP位點(diǎn)可以有效鑒別茶樹(shù)種質(zhì)資源。本研究利用這24個(gè)SNP位點(diǎn)對(duì)來(lái)自福建漳州南部的74份茶樹(shù)種質(zhì)資源進(jìn)行指紋圖譜和分子身份證的構(gòu)建。目前，把條形碼和二維碼技術(shù)應(yīng)用于分子身份證構(gòu)建的研究較少，郭艷春等利用SSR技術(shù)構(gòu)建了黃麻種質(zhì)的分子身份證。樊曉靜等利用SNP技術(shù)構(gòu)建了茶樹(shù)的分子身份證。本研究利用SNP技術(shù)首次構(gòu)建了福建漳州南部74份茶樹(shù)種質(zhì)資源的分子身份證，這為福建漳州茶樹(shù)種質(zhì)資源的區(qū)分、保護(hù)和合理開(kāi)發(fā)選育提供了新思路。

致謝：本研究試驗(yàn)樣品采集承蒙云霄縣茶葉科學(xué)研究所王彩云、方德音、蔡捷英、王金煥等老師，漳州仙隱峰茶葉有限公司張木山總經(jīng)理，福建省顧恒生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司張英豪總經(jīng)理， 福建省元?jiǎng)咨鷳B(tài)科技有限公司王元?jiǎng)锥麻L(zhǎng)的支持和幫助，特此致謝！