李守明， 史榮梅， 李輝玲

(1.石河子農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，新疆石河子 832000； 2.新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司，新疆烏魯木齊 830000；3.巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，新疆庫爾勒 841000)

大蒜(L.)別稱胡蒜，屬于百合科(Liliaceae) 蔥屬()中重要的蔬菜植物，素有“植物黃金”之稱，大蒜精、深加工品已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化，走俏歐洲、美國。大蒜栽培歷史悠久，最早在地中海沿岸國家栽培，后由張騫從西域引入我國陜西關(guān)中地區(qū)，隨后大面積種植，為適應(yīng)特殊的地理環(huán)境，在長期栽培中形成了不同的生態(tài)型地方品種，其中我國四大名蒜之一就是位于天山北坡吉木薩爾的綠嘴白皮蒜。有效利用大蒜種質(zhì)資源并對其變異性進(jìn)行精準(zhǔn)評價，單靠極易受環(huán)境影響的形態(tài)特征來評價物種多樣性難度極大，不能全面反映大蒜資源的真實(shí)狀況，加上長期無性繁殖導(dǎo)致品種退化嚴(yán)重、相互引種導(dǎo)致背景資料缺乏等勢必造成選育和推廣工作滯后等生產(chǎn)問題發(fā)生。

近年來，分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于物種親緣關(guān)系、品種純度鑒定及遺傳多樣性分析等輔助育種領(lǐng)域?；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)的簡單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記研究鮮有報道，因此筆者試圖建立適宜西北地區(qū)大蒜及其野生蒜的SSR-PCR分子標(biāo)記體系，對影響試驗結(jié)果的主要因素進(jìn)行優(yōu)化，以期為后期的種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析及構(gòu)建圖譜等分子標(biāo)記輔助育種工作提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試25份大蒜種質(zhì)資源分別由巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院特色作物室、新疆維吾爾自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院園藝所收集、提供(表1)，分別于2021年4月初種植于巴音郭楞蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院試驗田內(nèi)，常規(guī)田間管理。每份資源取葉片200 mg左右，利用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的新型植物基因組DNA提取試劑盒抽提大蒜的DNA。個別未出苗資源以鱗莖作為材料，利用傳統(tǒng)的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)手提法提取DNA。提取的25份大蒜DNA在140 V恒壓下，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測15 min，用凝膠成像系統(tǒng)檢測并拍照。另用核酸測定儀(NanoDrop-1000)測定質(zhì)量及濃度，記錄數(shù)據(jù)后，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 25份大蒜種質(zhì)資源信息

1.2 引物設(shè)計與合成

綜合參照Barboza等的研究，共設(shè)計50對引物，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成。

1.3 SSR-PCR擴(kuò)增體系正交試驗

本著節(jié)約成本并獲得最佳擴(kuò)增效果的目的，試驗采用總體積為10 μL的體系，引物濃度、模板DNA用量和2×PCR Mix添加量按L(4)正交表設(shè)計試驗(表2)，總計16次試驗。擴(kuò)增程序設(shè)定為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，不同引物最佳退火溫度退火45 s，72 ℃延伸90 s；30次循環(huán)的最后1次循環(huán) 72 ℃ 延伸設(shè)為10 min，4 ℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物。

表2 SSR-PCR擴(kuò)增體系正交試驗設(shè)計

1.4 退火溫度和循環(huán)數(shù)優(yōu)化

不同引物最適退火溫度()值不同，為提高擴(kuò)增效果并盡可能考慮到每對引物的最適，采取引物報告單的上、下游引物退火溫度的平均值設(shè)定。以SSR7為引物，結(jié)合上述擴(kuò)增效果最優(yōu)參數(shù)配比，對循環(huán)數(shù)進(jìn)行單因素試驗優(yōu)化，以6份生物學(xué)性狀差異較大、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的大蒜模板DNA為小群體，設(shè)置梯度為20、25、30、40次循環(huán)。觀察電泳圖，選擇擴(kuò)增效果好且條帶清晰的循環(huán)數(shù)。

1.5 電泳檢測

采用6.0%的非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測擴(kuò)增結(jié)果，電泳儀參數(shù)設(shè)置：200 V恒定電壓，80 min。結(jié)束后小心拆膠，用銀染法顯色至條帶清晰可辨，在醫(yī)用膠片觀察燈下拍照。參考尚小紅等對擴(kuò)增結(jié)果的直觀分析法進(jìn)行打分，打分依據(jù)：1～4分表現(xiàn)為清晰條帶少、雜帶多、重復(fù)性差、背景模糊，5～8分表現(xiàn)為清晰條帶多、有雜帶、重復(fù)性好、背景比較干凈，9～12分表現(xiàn)為清晰條帶多、無雜帶、重復(fù)性好、背景清晰，13～16分表現(xiàn)為清晰條帶多、亮度強(qiáng)、無雜帶、重復(fù)性好、背景清晰。通過Excel表分析16個組合的均值()和極差()，從而選擇最佳因素配比。

1.6 體系穩(wěn)定性檢測及引物篩選

以6份生物學(xué)性狀差異較大、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的大蒜材料為模板，利用優(yōu)化后的最佳SSR-PCR反應(yīng)體系和循環(huán)數(shù)，對50對SSR引物進(jìn)行篩選，最終篩選出條帶清晰可辨、穩(wěn)定性良好的引物作為大蒜材料SSR標(biāo)記多態(tài)性分析的候選引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA模板的檢測

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其中14份大蒜材料DNA的質(zhì)量，具體如圖1所示，可以看出，條帶整齊一致、帶型清晰，材料間DNA濃度較為均勻。核酸檢測儀測定結(jié)果顯示，所提DNA的/位于1.85～2.0之間，濃度為61～193 ng/μL。

2.2 SSR-PCR擴(kuò)增體系的優(yōu)化

擴(kuò)增結(jié)果是PCR體系內(nèi)各因素相互之間綜合作用產(chǎn)生的，正交試驗16個處理的擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，可以看出，各個因素的濃度組合不同，擴(kuò)增效果表現(xiàn)出明顯的差異。越大，說明該因素對擴(kuò)增效果優(yōu)劣影響越大，越大，說明該水平下的擴(kuò)增效果越好。通過對結(jié)果進(jìn)行評價和數(shù)據(jù)分析(表3)得出：各因素對SSR-PCR體系擴(kuò)增結(jié)果的影響程度依次為模板DNA用量、引物濃度、2×PCR Mix添加量。模板DNA用量為30 ng時效果最好，引物濃度為0.75 μmol/L時效果最好；2×PCR Mix添加量為3 μL時最好。但引物濃度的k與k相差不大，且考慮到條帶的清晰程度，10 μL反應(yīng)體系以30 ng模版DNA、0.5 μmol/L引物、5 μL的 2×PCR Mix添加量為最佳組合。

表3 建立SSR-PCR反應(yīng)體系的正交試驗設(shè)計表及結(jié)果

2.3 循環(huán)數(shù)的優(yōu)化

當(dāng)循環(huán)數(shù)為20、25次時，擴(kuò)增結(jié)果譜帶模糊；當(dāng)循環(huán)數(shù)達(dá)到30、40次時擴(kuò)增譜帶清晰易辨。綜合考慮擴(kuò)增結(jié)果質(zhì)量及總PCR反應(yīng)時長，最終設(shè)定最佳循環(huán)數(shù)為30次(圖3)。

2.4 引物篩選

以6份生物學(xué)性狀差異較大、親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的大蒜DNA基因為模板組成小群體篩選，從50對SSR通用引物中最終篩選出13對有效引物(圖4、表4)。圖5為引物SSR7在25份大蒜材料中的SSR擴(kuò)增結(jié)果。

表4 篩選出的13對多態(tài)性SSR引物的序列及其最佳退火溫度

3 討論

3.1 提取DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

提取高質(zhì)量的模板DNA是進(jìn)行SSR-PCR的前提，近年來最簡單的DNA 提取方法是植物基因組DNA提取試劑盒，雖然成本較高，但操作方便快捷、DNA純度高、操作過程毒害少，其應(yīng)用越來越廣泛。然而取材不同，細(xì)胞內(nèi)的組成成分如多酚類化合物、多糖等會影響DNA的提取質(zhì)量。大蒜鱗莖中含有比葉片更多的黏液類物質(zhì)，試劑盒提取效果不如葉片，因此采取傳統(tǒng)的CTAB 法提取，但其操作步驟繁瑣費(fèi)時，所用異丙醇、聚乙烯吡咯烷酮(PVP) 等有很大毒害。相較之下，試劑盒提取的DNA純度高但濃度過低，傳統(tǒng)CTAB法提取的DNA純度一般但濃度很高。因此，在模板DNA試驗實(shí)際的需求量小時建議使用植物基因組試劑盒提取DNA，需求量較大或者取材干擾物質(zhì)多時采用傳統(tǒng)的CTAB 法。

3.2 建立大蒜SSR-PCR體系的影響因素

建立穩(wěn)定的PCR反應(yīng)體系是SSR分析應(yīng)用的基礎(chǔ)，體系涉及到的諸多因子對整個反應(yīng)的敏感性、特異性和產(chǎn)量都有較大影響。因此，篩選適合的SSR引物、建立反應(yīng)體系并進(jìn)一步優(yōu)化體系，是前期需要開展的必備工作。有研究表明，模板DNA濃度過低會造成反應(yīng)后條帶不完全或者電泳結(jié)果中沒有擴(kuò)增產(chǎn)物；濃度過高會增加體系中抑制反應(yīng)的成分含量，出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。引物濃度過低時目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度過低或者出現(xiàn)擴(kuò)增不完全現(xiàn)象，濃度過高則電泳后結(jié)果會出現(xiàn)大量引物二聚體。循環(huán)次數(shù)是SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)的關(guān)鍵因素；次數(shù)設(shè)置過少，目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物量少，電泳結(jié)果不理想；次數(shù)設(shè)置過多，消耗完反應(yīng)物后目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物不再增加，并會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象。

本試驗借助正交表的均衡分散性和整齊可比性，通過多因素聯(lián)合優(yōu)化的正交試驗設(shè)計對影響大蒜DNA SSR反應(yīng)的2×PCR Mix添加量、引物濃度及模板DNA用量等因子進(jìn)行優(yōu)化試驗分析，最終得出適合大蒜 SSR-PCR 的反應(yīng)體系：總體積 10 μ L、模板DNA 30.0 ng、正反引物各0.5 μmol/L、2×PCR Mix 5.0 μL，用dd HO補(bǔ)齊。SSR-PCR擴(kuò)增程序設(shè)定為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，不同引物最佳退火溫度退火45 s，72 ℃延伸90 s；30次循環(huán)的最后1次循環(huán)72 ℃延伸設(shè)為 10 min，4 ℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物。以上述最佳反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序為基礎(chǔ)，進(jìn)一步在50對通用引物中篩選出高多態(tài)性、重復(fù)性良好的13對SSR有效引物，可以為大蒜的品種鑒定、遺傳多樣性等分子輔助研究提供理論和技術(shù)支持。