吳蕙慧 羅澤宇 莊涵喻 劉雋華 羅迪青 趙玉昆#

銀屑病是一種常見并易復(fù)發(fā)的慢性皮膚病，患病率約2%-3%，以青壯年為多。銀屑病病因至今未明，普遍認(rèn)為它是遺傳與環(huán)境等多種因素相互作用的多基因遺傳病，通過免疫反應(yīng)介導(dǎo)人體免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、炎癥介質(zhì)等方面的失衡，與炎癥性關(guān)節(jié)炎，心腦血管疾病，心理疾病等存在關(guān)聯(lián)。迄今為止，并無令人滿意的治療策略。近年來研究發(fā)現(xiàn)促血管生成因子水平的升高與血管生成異常與銀屑病發(fā)病密切相關(guān)［1］。我們研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型皮損中血管密度增加［2］以及VEGF 水平升高［3］，本研究將繼續(xù)以咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型為實驗對象，評估其皮損中VEGFR-1 與VEGFR-2 的表達(dá)水平，為銀屑病血管機制的研究以及抗血管治療提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料8-11 周齡Balb/c 雌性小鼠12 只，SPF級，體重在18-22 g 之間，購于中山大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SYXK（粵）2010-0108，飼養(yǎng)于無特定病原條件下，隨時供給水和食物。所有動物實驗均通過中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)（編號：2012353）。5%咪喹莫特乳膏，商品名：艾達(dá)樂，3M 公司生產(chǎn)。兔抗鼠VEGFR1 抗體、VEGFR2 抗體，購自BIOSS 北京博奧森公司。

1.2 方法（1）采用咪喹莫特乳膏誘導(dǎo)法建模。購入的Balb/c 小鼠用剃毛器在每只小鼠背部剃去約2 cm×3 cm 區(qū)域的毛發(fā)，區(qū)域中剩余毛發(fā)用脫毛劑（薇婷，法國Reckitt Benckiser 公司）完全去除。分為正常對照組、實驗組，正常對照組5 只，實驗組7 只。實驗組按照文獻(xiàn)方法［4］建模。正常對照以白凡士林80 mg 處理6 天。造模第7 天，將12 只Balb/c 小鼠以頸椎脫臼法處死后剪取小鼠背部皮損石蠟包埋、組織切片行以下實驗：（2）HE 染色（3）VEGFR-1、VEGFR-2 免疫組化染色（SP 法），并應(yīng)用Image-ProPlus6.0 軟件分析得出該片免疫組化染色陽性的累積光密度值（IOD）。（4）每張切片均隨機選取5 個不同視野（200 倍），計算該視野的微血管數(shù)、毛囊數(shù)、表皮厚度以及陽性染色的血管數(shù)和毛囊數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析SPSS13.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量單位使用（x±s）表示，符合正態(tài)分布圖使用t檢驗，不符合則使用秩和檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 成功建模使用咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型第7 天，局部皮膚出現(xiàn)邊界清楚、大小形狀不等的紅色斑塊，表面覆有白色鱗屑；正常對照組皮膚未見明顯異常，見圖1。HE 染色顯示實驗組小鼠表皮角化過度、角化不全，伴有munro 或Kogoj微膿腫，棘層增厚，顆粒層缺失，角質(zhì)形成細(xì)胞約8-10 層，表皮增生呈杵狀，真皮乳頭上延，真皮淺層及乳頭可見炎性細(xì)胞浸潤，以及較多新生毛細(xì)血管，見圖2，與人類銀屑病高度相似。

圖1 （a）正常組和（b）實驗組皮膚大體表現(xiàn)

圖2 （a）正常組和（b）實驗組小鼠皮損組織病理（HE 染色，×200）

2.2 VEGFR-1、VEGFR-2 免疫組化染色及IOD值比較見表1。實驗組表皮全層、真皮淺層微血管以及毛囊可見散在的棕黃色染色的陽性細(xì)胞，見圖3。

圖3 （a）實驗組VEGFR-1 免疫組化染色；（b）正常組VEGFR-1 免疫組化染色；（c）實驗組VEGFR-2 免疫組化染色；（d）正常組VEGFR-2 免疫組化染色，SP 染色，×200）。

表1 兩組VEGFR-1、VEGFR-2 免疫組化染色I(xiàn)OD 值比較（x±s）

2.3 真皮血管VEGFR 染色陽性率比較見表2。

表2 兩組真皮血管VEGFR 染色陽性率比較（x±s）

2.4 兩組間毛囊VEGFR 染色陽性率比較見表3。

表3 兩組毛囊VEGFR 染色陽性率比較（x±s）

2.5 VEGFRs 免疫組化染色I(xiàn)OD 值與微血管數(shù)量相關(guān)性比較實驗組VEGFR-1 血管免疫組化染色I(xiàn)OD 值（Pearson 積矩相關(guān)系數(shù)，r=0.931，P＜0.05）；與實驗組VEGFR-2 血管免疫組化染色I(xiàn)OD值（Spearman 等級相關(guān)系，r=0.751，P＜0.05）與微血管計數(shù)存在正相關(guān)關(guān)系。

2.6 VEGFRs 免疫組化染色I(xiàn)OD 值與表皮厚度相關(guān)性比較VEGFR-1 免疫組化IOD 值與表皮厚度（57.84±35.55）μm 存在正相關(guān)（Pearson 積矩相關(guān)系數(shù)，r=0.871，P＜0.05）；VEGFR-2 免疫組化IOD 值與表皮厚度存在正相關(guān)（Spearman 等級相關(guān)系數(shù)，r=0.785，P＜0.05）。

3 討 論

銀屑病是一種常見的，慢性炎癥性，多系統(tǒng)疾病，其發(fā)病機制復(fù)雜，血管生成與微血管異常是銀屑病發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)，微循環(huán)的改變是銀屑病的重要組織病理改變［5］，表現(xiàn)為真皮乳頭層血管增多，迂曲擴(kuò)張，而且血管變化先于銀屑病的表皮增生，銀屑病的改善通常伴隨著血管結(jié)構(gòu)的正?；苌膳cVEGF 密切相關(guān)［6］。VEGFR-1 和VEGFR-2 是傳導(dǎo)VEGF 信號的主要酪氨酸激酶受體，目前研究認(rèn)為VEGFR-1 可間接或直接調(diào)節(jié)VEGFR-2 信號，VEGFR-1 是在胚胎形成期正常血管發(fā)育所必須的，VEGFR-2 則主要介導(dǎo)VEGF 的促血管生成與增生［7］。目前已有研究證實在銀屑病中，血管內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF/VEGFR 信號能增強血管通透性，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，同時能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞的生長。角質(zhì)形成細(xì)胞的VEGF/VEGFR 信號能通過自分泌方式加強角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和表皮屏障穩(wěn)態(tài)，這可能是銀屑病表皮變化及Koebner 現(xiàn)象的機制之一。此外，VEGF 能增強VEGFR 的表達(dá)，進(jìn)一步擴(kuò)大銀屑病病理生理變化［7］。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，實驗組皮損出現(xiàn)VEGFR-1、VEGFR-2 蛋白的過度表達(dá)并分布在表皮角質(zhì)形成細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞，VEGFR-1 與VEGFR-2 免疫組化染色的光密度值與血管數(shù)量、表皮厚度呈正相關(guān)關(guān)系，提示VEGFR-1 與VEGFR-2 的表達(dá)強度與小鼠銀屑病模型的嚴(yán)重程度相關(guān)，與人類銀屑病表達(dá)模式一致，提示咪喹莫特銀屑病小鼠模型在VEGF/VEGFR 信號機制上的研究價值。

正常組血管內(nèi)皮細(xì)胞表面VEGFR-1 和VEGFR-2 表達(dá)密度無明顯差異，而實驗組血管內(nèi)皮細(xì)胞表面VEGFR-1 的表達(dá)密度高于VEGFR-2，目前尚無關(guān)于人類銀屑病皮損中VEGFR-1 和VEGFR-2 比例變化的研究，尚需進(jìn)一步探究。實驗組皮損中VEGFR-1 與VEGFR-2 在毛囊的表達(dá)較正常組高，提示VEGFR-1 與VEGFR-2 可能通過調(diào)控毛囊參與到銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞增殖與血管增生［8］。

咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型的皮損臨床表現(xiàn)與病理特征與人類銀屑病類似，尤其是存在與人類銀屑病相似的血管增生相關(guān)因子（VEGFA）及其受體（VEGFR-1、VEGFR-2）的異常表達(dá)和分布，為咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病小鼠模型用于銀屑病血管生成方面的機制研究及抗血管治療的研究提供實驗基礎(chǔ)。