李小丹,朱麗瓊，曾彩虹，劉 鑫，吳家乾，李丹青，潘傳榮

（1.廣東湛江國家糧食質(zhì)量監(jiān)測站，廣東 湛江 524045；2.廣東省糧食科學(xué)研究所有限公司，廣州 510050）

米糠是稻谷加工時(shí)糙米碾米的主要副產(chǎn)品，其重量占稻谷總重10%左右，主要成分由種皮和胚構(gòu)成[1]，米糠營養(yǎng)豐富，是重要的蛋白資源。為提升米糠的利用價(jià)值，在米糠中提取蛋白質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)化利用是多年來的熱門課題，如何快速測定米糠或提取物中粗蛋白含量是科研人員經(jīng)常關(guān)注的問題。

粗蛋白含量測量方式有傳統(tǒng)的凱氏定氮法和當(dāng)前越來流行的杜馬斯儀器燃燒法，其中凱氏定氮法有全定量和半定量方式。1883年丹麥化學(xué)家凱道爾建立了經(jīng)典的“凱氏定氮法”來測量有機(jī)物中的總氮，迄今為止被人們應(yīng)用了100多年的時(shí)間。更早在1831年，法國化學(xué)家杜馬斯首創(chuàng)一種定氮法，在燃燒管的前端貯有碳酸鉛，在試樣分解前，燃燒時(shí)氮的氧化物通過紅熱的銅粉后被還原可得出有機(jī)物中的含氮量[2]。杜馬斯定氮法比凱式定氮法足足早了52年，因?yàn)闄C(jī)理復(fù)雜和檢測成本高導(dǎo)致了在實(shí)際應(yīng)用中受到限制，在熱導(dǎo)檢測器（TCD）技術(shù)成熟應(yīng)用之后，杜馬斯定氮儀才得以普及應(yīng)用。熱導(dǎo)檢測器基于不同氣體具有不同的熱導(dǎo)率，當(dāng)被測組分與載氣一起進(jìn)入熱導(dǎo)池時(shí)，由于混合氣的熱導(dǎo)率的不同，鎢絲傳向池壁的熱量也發(fā)生變化，致使鎢絲溫度發(fā)生改變，其電阻也隨之改變，進(jìn)而使電橋輸出端產(chǎn)生不平衡電位而作為信號輸出。在國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5—2016《食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)測定》凱氏定氮法為第一法屬仲裁方法，燃燒法為第三法。

本文依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》[3]方法以及在實(shí)際工作中的檢測經(jīng)驗(yàn)，利用凱氏定氮儀中的全定量和半定量法以及杜馬斯燃燒法，分別以全麥粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與蔗糖配成不同含量粗蛋白標(biāo)準(zhǔn)粉、廣東境內(nèi)絲苗米廠生產(chǎn)的新鮮米糠為檢測對象，對3種方法測量粗蛋白的準(zhǔn)確性、平行性和線性范圍進(jìn)行測試比較，總結(jié)探討測試人員應(yīng)用各方法時(shí)孰優(yōu)孰劣。

1 儀器方法

1.1 杜馬斯燃燒法

氣路和燃燒室溫度等儀器狀態(tài)調(diào)試好后，儀器本身有以EDTA為參照物做的內(nèi)置外標(biāo)法用的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用錫箔紙稱粉狀樣品0.0500 g左右，成團(tuán)揉好放入自動(dòng)進(jìn)樣盤，輸入蛋白系數(shù)，自動(dòng)測量結(jié)果，儀器如圖1所示。

圖1 德國格哈特N-pro杜馬斯定氮儀和自動(dòng)進(jìn)樣盤

1.2 半定量凱氏定氮法

稱取粉狀樣品1 g于配套石英U型試管中,加入1:12硫酸銅和硫酸鉀3.2 g和12 mL硫酸,放入消化爐450℃，全部碳化3 h呈綠色透明,取出冷卻，套上定氮蒸餾裝置（圖2）,放入加好3滴溴甲酚綠亞甲基藍(lán)混合指示劑的2%硼酸150 mL，注入40%NaOH濃堿使消化管硫酸銅沉淀變黑，水蒸氣蒸餾使硼酸吸收液到250 mL,轉(zhuǎn)到滴定臺(tái)手工用0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定灰藍(lán)色轉(zhuǎn)棕紅色，計(jì)算結(jié)果。

圖2 上海纖檢儀器有限公司KDN-2C型半定量凱氏定氮儀和消化爐

1.3 全定量凱氏定氮法

稱取粉狀樣品0.5 g于配套石英U型試管中,加入1:12硫酸銅和硫酸鉀2 g和12 mL硫酸,放入石墨消化爐450℃，全部碳化2 h呈綠色透明,取出冷卻套上全定量蒸餾裝置（圖3）,儀器有配好帶有混合指示劑的2%硼酸，20%NaOH濃堿和0.05 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液，全程自動(dòng)滴定，以光敏元件判斷終定，輸入蛋白系數(shù)，自動(dòng)計(jì)算結(jié)果。

圖3 青島海能KN1100型全定量凱氏定氮儀和消化爐

2 測試對象

2.1 米糠原料

新鮮米糠，梅州建豐糧業(yè)發(fā)展有限公司提供。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

全麥粉粗蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)100126，證書標(biāo)注粗蛋白含量（15.8±0.3）%、蔗糖和兩者混合物，混合物粗蛋白含量見表1。

表1 全麥粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和蔗糖混合物

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 杜馬斯定氮儀

乙二胺四乙酸（EDTA）是一種相對穩(wěn)定的有機(jī)物，其化學(xué)式為C10H16N2O8，含N量為9.59%，依次稱取不同質(zhì)量EDTA（純度大于99.999%）放入燃燒儀測試，記錄峰面積，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，蛋白系數(shù)米糠取5.95，標(biāo)準(zhǔn)品與混合物取5.7。結(jié)果見表2、表3、圖4和圖5。

表2 EDTA質(zhì)量和峰面積

圖4 杜馬斯定氮儀EDTA標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 杜馬斯定氮儀測定結(jié)果與蛋白理論值測量相關(guān)性

3.2 半定量凱氏定氮法

半定量凱氏定氮法結(jié)果如表4和圖6。

圖6 半定量凱氏定氮法測定結(jié)果與蛋白理論值測量相關(guān)性

表4 樣品半定量凱氏定氮法測試結(jié)果

3.3 全定量凱氏定氮法

全定量凱氏定氮法結(jié)果如表5和圖7。

圖7 全定量凱氏定氮法測定結(jié)果與蛋白理論值測量相關(guān)性

表5 樣品全定量凱氏定氮法測試結(jié)果

4 結(jié)果與討論

（1）分別采用杜馬斯燃燒法、半定量凱氏定氮法、全定量凱氏定氮法對全麥粉粗蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、蔗糖、兩者混合物和米糠樣品測定，從圖5、6、7的測定結(jié)果與蛋白理論值測量相關(guān)性看出，相關(guān)性R2杜馬斯燃燒法0.9929＞R2半定量凱氏定氮法0.9885＞R2全定量凱氏定氮法0.9751；從表3、4、5中可以看出杜馬斯燃燒法與蛋白理論值的偏差分布在-0.4～0.6之間，半定量凱氏定氮法分布在-1.8～0.1之間，全定量凱氏定氮法分布在-1.6～1.1之間。從數(shù)據(jù)看出杜馬斯燃燒法測量的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性高于凱氏定氮法；凱氏定氮法中的半定量方式優(yōu)于全定量凱氏定氮法。三種定氮測定方法比較如表6：

表3 樣品杜馬斯燃燒法測試結(jié)果

表6 三種定氮方式比較

（2）通過對凱氏定氮法的全定量和半定量法及杜馬斯燃燒法測定蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)的比較發(fā)現(xiàn)，作為蛋白質(zhì)測定的國家標(biāo)準(zhǔn)方法，三種方法檢測結(jié)果并沒有顯著性差異，所以測定米糠中粗蛋白含量時(shí)采用三種方法均是可行的。凱氏定氮法所需設(shè)備價(jià)格低、成本低廉、已經(jīng)有著廣泛的應(yīng)用，即使在很小的實(shí)驗(yàn)室也可以用簡單的凱氏定氮裝置實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的測定，但是操作時(shí)間長，有一定的危險(xiǎn)性，產(chǎn)生有毒有害氣體，危害人體健康，結(jié)果易受人為影響。杜馬斯燃燒法操作過程簡便快捷，時(shí)間只需幾分鐘，不需人看管，不產(chǎn)生有毒有害物質(zhì)，但是儀器很昂貴，檢測成本高。然而，在今天人們越來越注重人員健康和環(huán)境保護(hù)，鑒于杜馬斯燃燒法顯而易見的優(yōu)點(diǎn)，在蛋白質(zhì)檢測領(lǐng)域有逐漸增多趨勢。