安忻蕾，嚴佳玥，魏 巖，陸 倩

（新疆農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院 / 新疆草地資源與生態(tài)重點實驗室, 新疆 烏魯木齊 830052）

種子萌發(fā)是植物生活史中最為敏感的時期[1]，外界環(huán)境等因素對其影響很大，因此這也是植物種群更新繁衍的一個重要環(huán)節(jié)[2]。水分、溫度、光照、氧氣、土壤酸堿和土壤鹽分等是影響種苗建植的關(guān)鍵[3-4]。在養(yǎng)分、溫度、光照等條件均適宜的情況下，具有生理活性的種子萌發(fā)的主要限制因素是水分[5]，其不僅影響萌發(fā)開始時間，同時也決定著植物種子發(fā)芽率、發(fā)芽速率。干旱脅迫不利于種子萌發(fā)，同時也會影響種子的吸水膨脹。以往的研究表明輕度干旱處理對種子萌發(fā)和出苗具有促進作用，而高濃度的 PEG 溶液對種子萌發(fā)具有強烈的抑制作用[6-7]。此外，種子大小的差異決定所含能量的多少，也會影響種子萌發(fā)、幼苗生長和存活[8-9]。Westoby[10]通過對澳大利亞西南部的20 種植物的研究發(fā)現(xiàn)植物的萌發(fā)率、存活率、幼苗根長都與種子大小有關(guān)。潘慧超等[11]研究表明華北駝絨藜(Ceratoides arborescens)大種子的萌發(fā)率、根長、幼苗高度大于小種子[11]。Leishman 和Westoby[12]對29 種植物的研究發(fā)現(xiàn)在干旱條件下大種子比小種子具有高的發(fā)芽率、出苗率和成活率。

種子萌發(fā)對外界環(huán)境脅迫具有高度脆弱性，種子萌發(fā)被認為是植物生命周期中最關(guān)鍵、最脆弱的階段[13]。因此植物表現(xiàn)出復雜多樣的萌發(fā)行為和萌發(fā)策略，來提高物種的適合度。在具有混合型交配系統(tǒng)的物種中，其中通過兩種不同類型和功能的花即兩型花進行繁殖的一類植物具有一種獨特的混合交配系統(tǒng)。紫花地丁(Viola philippica)屬于兩型花植物，同一植株上產(chǎn)生能進行異花授粉的開花受精花CH (chasmogamous)和完全自花授粉的閉花受精花CL (cleistogamous)兩種花型[14]，分別產(chǎn)生CH 種子和CL 種子。這種繁殖行為是一種“兩頭下注”的生殖策略，以此來提高植物對異質(zhì)環(huán)境的適應能力和種群繁殖率[15]。目前關(guān)于紫花地丁種子萌發(fā)特性的研究大多局限于對一種種子展開萌發(fā)試驗，而關(guān)于紫花地丁兩種種子萌發(fā)的探索研究相對較少，且研究關(guān)注焦點主要集中在光照、溫度、鹽分、儲藏方式對于其兩種種子萌發(fā)的影響。蘇雪等[16]研究發(fā)現(xiàn)CH 種子對光照條件敏感。孫慧芳等[17]研究發(fā)現(xiàn)紫花地丁兩種種子萌發(fā)的最適溫度為變溫20 ℃/30 ℃，在 低 濃 度(0.05～0.10 mol·L-1) NaCl 溶 液中CL 種子的萌發(fā)率和種子活力大于CH 種子。但關(guān)于干旱脅迫環(huán)境對紫花地丁兩種種子萌發(fā)的影響缺乏系統(tǒng)研究。干旱脅迫對紫花地丁CH 種子和CL 種子萌發(fā)有何影響，CH 種子和CL 種子的響應是否存在差異？為此，本文對紫花地丁CH 和CL 種子對干旱脅迫的響應進行對比，進一步完善對紫花地丁兩種種子萌發(fā)特性的認識，為揭示其二態(tài)繁育系統(tǒng)的適合度優(yōu)勢及生活史進化機制提供資料。

1 材料與方法

1.1 研究材料

供試種子紫花地丁的開放花種子(CH)和閉鎖花種子(CL) 采收自新疆準噶爾盆地南緣(43°80′N，87°56′ E，海拔830 m)，在蒴果微裂但種子尚未彈出時采收。將采集的新鮮種子凈種后自然風干，放入紙袋內(nèi)，室內(nèi)貯藏備用。試驗于2021 年6 月至7 月進行。

1.2 研究方法

1.2.1兩種種子形態(tài)及大小

隨機選取成熟飽滿CH 種子和CL 種子各25粒，使用游標卡尺測量其長度和寬度，重復4 次；種子重量的測定以每種類型種子500 粒為一組，使用萬分之一天平稱重，重復4 次。并觀察兩種種子形態(tài)。

1.2.2模擬干旱脅迫對種子吸水率影響測定

模擬干旱條件以5%、10%、15%、20%、25%的PEG-6000 水溶液處理，以蒸餾水處理為對照。在培養(yǎng)0.5、1、2、4、8、10、12、14、16、18、20、22、24、28、32、36、40、48、54、60 和66 h 時，測定種子萌發(fā)需水量。每個處理4 個重復，每個重復50 粒種子，將兩種種子置于墊有兩層濾紙的9 cm 培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中加入10 mL 溶液。以種子重量占吸水試驗前種子重量的百分數(shù)表示，計算種子的吸水率。測定時將50 粒種子自培養(yǎng)皿中全部取出，將種子表面水分用濾紙吸干，使用萬分之一天平進行稱重記錄種子重量變化，分析比較不同類型種子的吸水差異。

1.2.3 適宜條件下干旱脅迫對種子萌發(fā)的影響

采用培養(yǎng)皿紙上發(fā)芽試驗[18]，以5%、10%、15%、20%、25% 的PEG 水溶液處理，以蒸餾水處理為對照，每個處理4 個重復，每個重復25 粒種子。將兩種種子置于墊有兩層濾紙的9 cm 培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中加入10 mL 溶液。發(fā)芽試驗于30 ℃光照12 h，20 ℃黑暗12 h 的光照培養(yǎng)箱中進行[16-17]。試驗期間，每天統(tǒng)計種子發(fā)芽數(shù)。7 d 統(tǒng)計發(fā)芽勢，14 d 統(tǒng)計發(fā)芽率，測量幼苗胚芽(包括胚軸和頂芽)與初生根長度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

使用Excel 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，使用SPSS 26.0 進行統(tǒng)計分析，用單因素(one-way ANOVA)方差分析驗證相同濃度不同種子間差異和相同種子不同處理間的差異，用雙因素(two-way ANOVA)方差分析驗證不同紫花地丁CH 種子和CL 種子的差異性。采用Excel 軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種種子形態(tài)及大小

紫花地丁兩型花的果實均為蒴果，果實成熟后三裂，在蒴果內(nèi)包含數(shù)枚種子。產(chǎn)生的兩種種子均呈褐色、倒卵形；從形狀上看，紫花地丁開放花與閉鎖花兩種形態(tài)的種子并沒有顯著差異。但CH 種子的長度及千粒重顯著大于CL 種子(P＜ 0.05)，而CH種子與CL 種子的寬度無顯著差異(P ＞0.05) (表1)。

表1 紫花地丁開放花和閉鎖花種子形態(tài)特征Table 1 Characteristics of chasmogamous (CH) and cleistogamous (CL) seeds of Viola philippica

2.2 種子累計吸水率對模擬干旱脅迫的響應

CH 種子和CL 種子的累計吸水率隨模擬干旱脅迫的加劇呈降低趨勢(圖1)。紫花地丁的兩種種子遇水后前1 h 進入吸脹吸水期，快速吸水，CH 種子的對照組和低濃度(5%～10%) 處理的種子吸水率達到43.32%～44.33%；高濃度(15%～25%) 處理的種子吸水率較低，為28.83%～31.39%。CL 種子的對照組和低濃度(5%～10%) 處理的種子吸水率達到42.18%～43.26%；高濃度(15%～25%) 處理的種子吸水率較低，為27.89%～34.73%。1 h 后種子進入緩慢吸水期，吸水速度增加緩慢。24 h 起對照組和低濃度(5%～10%)處理的CH 種子和CL 種子進入生長吸水期，吸水率再次增加。對照組的CH 種子在種子吸水達到60 h 開始萌發(fā)，此時吸水后的CH種子質(zhì)量增加到未吸水種子質(zhì)量的1.12 倍。CL 種子在種子吸水達到66 h 開始萌發(fā)，此時吸水后的CL 種子質(zhì)量增加到未吸水種子質(zhì)量的1.13 倍。而高濃度(15%～25%)處理的種子吸水率仍然緩慢增加，未進入生長吸水期。

圖1 紫花地丁開放花和閉鎖花種子在不同PEG 濃度下的吸水進程Figure 1 Water absorption of chasmogamous (CH) and cleistogamous (CL) seeds of Viola philippica under treatment with different PEG concentrations

2.3 種子萌發(fā)對模擬干旱脅迫的響應

紫花地丁不同類型種子的發(fā)芽率具有顯著差異(P＜ 0.05)，種子類型、PEG 濃度以及兩者交互對CH種子和CL 種子的發(fā)芽率有顯著作用(P＜ 0.05) (表2)。

表2 不同類型種子及不同PEG 濃度對萌發(fā)影響的二因素方差分析Table 2 Results of two-way ANOVA evaluating the effects of seed type, PEG concentration, and their interaction on seed germination

隨著干旱脅迫的加劇，兩種種子的初始萌發(fā)時間和萌發(fā)達到50%的時間(TG50)延長(圖2)。在低濃度(5%、10%) 處理時CH 種子和CL 種子的初始萌發(fā)時間和TG50均無顯著差異(P ＞0.05)，而高濃度(15%～25%)處理下CH 種子比CL 種子更具有萌發(fā)優(yōu)勢，CH 種子的初始萌發(fā)時間和TG50均顯著小于CL 種子。而在PEG 濃度為25%時，CL 種子發(fā)芽率未達到50%。

圖2 干旱脅迫對紫花地丁開放花和閉鎖花種子萌發(fā)的影響Figure 2 Effects of drought stress on the germination of chasmogamous (CH) and cleistogamous (CL)seeds of Viola philippica

萌發(fā)14 d 時，低濃度(5%、10%) 處理下CH 種子和CL 種子的發(fā)芽率無顯著差異(P＞ 0.05)。與CH 相比，高濃度(15%～25%) 處理顯著抑制CL 種子發(fā)芽率(P＜ 0.05)，與其他PEG 濃度相比，PEG 濃度為25%時顯著抑制CH 和CL 種子發(fā)芽率(圖3)。表明兩種種子均具有一定的抗旱性，且CH 種子較CL種子具有更好的抗旱性。

CH 種子的發(fā)芽勢先增加后減小(圖3)，在5%PEG 時發(fā)芽勢為86%，顯著高于對照組(P＜ 0.05)；在≥10% PEG 顯著低于對照(P＜ 0.05)，25% PEG 時，發(fā)芽勢為0。CL 種子的發(fā)芽勢在5% PEG 時與對照組無顯著差異(P＞ 0.05)，在PEG 濃度≥10%顯著低于對照，且隨著干旱脅迫的加劇呈下降趨勢，在PEG 濃度達到20%時發(fā)芽勢為0。表明輕度干旱可以促進兩種種子萌發(fā)，隨著干旱脅迫的加劇對兩種種子萌發(fā)速度有明顯的延緩作用。

萌發(fā)14 d 時，無論是對照組還是在干旱脅迫下，CL 種子胚芽長度顯著小于CH 胚芽長度(P＜ 0.05)。5% PEG 對CH 種子和CL 種子幼苗的長度有促進作用，之后隨著干旱程度的加劇，兩種種子胚芽長度呈下降的趨勢(圖3)。CH 種子和CL 種子對照組的初生根長度分別為18.6 和13.3 mm，隨著干旱脅迫的加劇兩種種子的幼苗初生根長度呈先增加而后降低的趨勢，兩種種子均在PEG 濃度為25% 時低于對照組。

圖3 干旱脅迫對紫花地丁開放花和閉鎖花種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、胚芽長度和初生根長度的影響Figure 3 Effects of drought stress on the germination rate, germination potential, radical and plumule length of chasmogamous (CH) and cleistogamous (CL) seeds of Viola philippica

3 討論與結(jié)論

種子萌發(fā)對干旱脅迫的響應反映了植物適應局部環(huán)境而進行自我調(diào)節(jié)的生態(tài)機制[19]。大量研究結(jié)果表明，種子萌發(fā)能力均隨干旱脅迫強度的增大而減小[20-23]。何建軍等[24]通過研究干旱脅迫對鹽生草(Halogeton glomeratus)的影響，發(fā)現(xiàn)種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢均隨干旱脅迫程度的增加而降低，本研究表明不同干旱脅迫對紫花地丁兩種種子的萌發(fā)產(chǎn)生一定影響。輕度干旱可以促進兩種種子萌發(fā)，隨著干旱脅迫加劇對紫花地丁種子萌發(fā)具有一定的抑制作用，表現(xiàn)為初始萌發(fā)時間推遲，萌發(fā)時間延長。兩種種子的發(fā)芽勢、胚芽長、初生根長均表現(xiàn)出先增加后減小的趨勢；尤其是25% PEG 溶液抑制紫花地丁種子的萌發(fā)，平均發(fā)芽率低于35%，同時還出現(xiàn)發(fā)芽速度減緩，幼苗出苗不整齊，幼苗生長緩慢、弱小等現(xiàn)象。這與大針茅(Stipa grandis)和克氏針茅(S. sareptanavar.krylovii)[25]，沙蘆草(Agropyro mongolicum)和檸條錦雞兒[21]的研究結(jié)果一致。說明植物在其發(fā)育過程中已經(jīng)形成相對適應干旱脅迫的機制，保證種子萌發(fā)過程能夠順利進行。

本研究結(jié)果顯示，CH 種子和CL 種子對干旱脅迫的響應存在差異。在干旱脅迫下CH 種子發(fā)芽勢高、萌發(fā)整齊，而CL 種子發(fā)芽勢低、萌發(fā)持續(xù)且分散。就發(fā)芽模式可看到，CH 種子在較寬的干旱范圍均可以萌發(fā)，這種萌發(fā)機制可以利用自然降水快速發(fā)芽，從而增加形成幼苗的機會，優(yōu)先占領(lǐng)生境。CL 種子的萌發(fā)特性更適應于降水條件不確定的環(huán)境，這樣可以增加種子成活率，保障植物種群的繁衍。因為這種發(fā)芽模式可以避免遇到少量降水就一齊萌發(fā)而遭遇回干“閃苗”的危險[26-27]。不萌發(fā)的種子可以形成短暫的土壤種子庫，種子以種子庫的形式越冬，這就避免了因種子萌發(fā)成幼苗而不能越冬造成的生殖浪費[28]。此外，種子的萌發(fā)還與種子本身的大小、質(zhì)量有關(guān)[29]。質(zhì)量較大的種子，其胚乳或子葉中供種子萌發(fā)的能量相對較多，更加有利于幼苗建植早期的根系發(fā)育和生物量積累[30]，從而使植物具有更強的生長勢、逆境耐受能力和對資源的競爭能力[31]。大種子為幼苗提供了充足的營養(yǎng)資源，促進了幼苗的生長，大種子比小種子有著更強的在逆境下萌發(fā)的能力[32-34]。本研究結(jié)果表明，CH 種子和CL 種子對干旱脅迫的響應存在差異，在高濃度PEG (15%～25%)處理下，CH 種子的發(fā)芽率顯著大于CL 種子，這可能與CH 種子千粒重大于CL 種子(分別為1.32 和1.09 g)有關(guān)。此結(jié)果與瓜拉那(Paullinia cupanavar.sorbilis)[35]和Dithyreacalifornica[36]的研究結(jié)果一致。這可能是因為紫花地丁兩種種子的成熟時期不同，CH 種子的成熟時期在4 月和5 月，此時烏魯木齊的平均降水量為32.8 和38.9 mm；CL 種子的成熟時期在6 月到10月，此時烏魯木齊的平均降水量為26.2～36.2 mm。因此紫花地丁這一特性的生態(tài)學意義在于在時間和空間上分散風險保證在干旱環(huán)境下的物種延續(xù)，從而形成的一種適應環(huán)境時空異質(zhì)性的對策[15,37]。

植物為適應多變的環(huán)境，會形成多種不同的適應對策[38-40]。具有混合繁育系統(tǒng)的植物在同一植株上可以通過異花授粉產(chǎn)生CH 種子，也可以通過自花授粉產(chǎn)生CL 種子。這種繁育策略能夠為植物提供繁育保障，并且能夠降低由生境改變而引起的滅絕的風險[41]。有研究表明，具有二型繁育系統(tǒng)的植物，其兩種種子的形態(tài)及萌發(fā)的行為有差異[16-17,42]。本研究發(fā)現(xiàn)紫花地丁CH 種子的發(fā)芽率大于CL 種子。說明影響CH 和CL 兩種種子萌發(fā)差異的原因可能是因為繁育方式不同?？ㄅ屮P仙花(Impatiens capensis)CH 種子萌發(fā)率和幼苗存活率均高于CL 種子，且兩種類型的種子重量沒有顯著差異[42]。這種異交產(chǎn)生的后代適合度大于自交的原因可能是CH 花的種子因花粉源不同可能具有異交優(yōu)勢[43]。且由CH 花產(chǎn)生的具有遺傳變異的種子后代更能夠適應不同時間和空間的異質(zhì)生境[44]。而CL 種子為自交產(chǎn)生的后代，純合度更高，這可能會造成一定程度的近親繁殖衰退。這與植物在生命周期的早期表現(xiàn)出來的觀點一致[45]。這表明，多年生紫花地丁的二態(tài)繁育系統(tǒng)產(chǎn)生CH-CL 種子，最大限度地提高了植物在異質(zhì)環(huán)境中的適合度。這種生殖策略不僅避免了密集效應，也減弱同胞子代間的競爭，具有重要的進化生態(tài)意義。

通過研究干旱脅迫對紫花地丁種子萌發(fā)的影響得出，不同梯度干旱脅迫，紫花地丁CH 種子萌發(fā)速率高于CL 種子，且萌發(fā)較早并出苗整齊，CL 種子萌發(fā)持續(xù)且分散。輕度干旱脅迫可以促使兩種種子初生根生長，重度干旱脅迫對兩者均有抑制作用，CH 種子的胚芽長、初生根長均大于CL 種子；CH種子較CL 種子具有更耐旱的萌發(fā)優(yōu)勢。這可能與CH-CL 繁育系統(tǒng)以及種子質(zhì)量有關(guān)。