薄 偉，王 松，王 晉，康紅梅，劉琛彬

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院, 山西 太原 030031）

重金屬污染具有隱蔽性、持續(xù)性和不可逆性，會(huì)對水體和土壤資源產(chǎn)生嚴(yán)重破壞。隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，工礦業(yè)活動(dòng)日益增多，鉛鋅礦資源開采冶煉所產(chǎn)生的含鉛(Pb)工業(yè)污水、礦渣、尾沙等毒害物質(zhì)對周邊生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重污染[1]。值得關(guān)注的是，水體中Pb 超標(biāo)不僅影響水體生態(tài)環(huán)境，更對人類健康造成嚴(yán)重威脅[2]。Pb 含量在多數(shù)重金屬礦區(qū)嚴(yán)重超標(biāo)，因此，盡快降低工礦區(qū)Pb 對環(huán)境的污染，是迫切需要解決的生態(tài)環(huán)境問題。

Pb 是植物生長發(fā)育的非必需元素，但卻容易被植物富集，只有累積超過一定閾值時(shí)，才會(huì)對植物產(chǎn)生負(fù)面影響。目前，利用富Pb、耐Pb 型植物修復(fù)環(huán)境是控制Pb 污染的重要措施之一，加快篩選評價(jià)這些植物，充實(shí)Pb 植物修復(fù)材料庫，對開展土壤和水體Pb 污染植物修復(fù)具有重要意義[3]。觀賞草本植物多應(yīng)用于城市綠化，其體內(nèi)富集的Pb 也不會(huì)經(jīng)由食物鏈進(jìn)入人體，是理想的Pb 污染植物修復(fù)材料。研究者已對垂盆草(Sedum sarmentosum)[4]、紫花苜蓿(Medicago sativa)[5]和黑麥草(Lolium perenne)[6]等植物的耐Pb 性及適應(yīng)策略進(jìn)行了研究，但涉及的觀賞草本種類仍然有限。

水生鳶尾是鳶尾科鳶尾屬(Iris)中為數(shù)較少的多年生草本植物，卻兼具生長強(qiáng)健、花期長、適應(yīng)性強(qiáng)、觀賞效果好等特點(diǎn)，是城市水體綠化和造景的優(yōu)良植物素材[7]。從水生鳶尾中篩選富集、轉(zhuǎn)運(yùn)能力較強(qiáng)的耐Pb 植物種類并用于營造城市水體景觀，可實(shí)現(xiàn)改善水體Pb 污染和美化環(huán)境的目的。為此，采用營養(yǎng)液培養(yǎng)法，測定4 種水生鳶尾Pb 脅迫(1 200 mg·L-1Pb)條件下地上和地下部分的Pb 吸收量，并對其生長指標(biāo)(形態(tài)指標(biāo)、生物量指標(biāo)的脅迫指數(shù)) 及生理指標(biāo)(脅迫指數(shù)) 進(jìn)行差異比較及分析，綜合評價(jià)其耐Pb 性，為水生鳶尾的耐Pb 品種篩選及耐Pb 種質(zhì)選育奠定理論基礎(chǔ)，也為Pb 污染水體修復(fù)提供植物資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以引自江蘇的花菖蒲(I. ensatavar.hortensis)、西伯利亞鳶尾(I. sibirica)、玉蟬花(I. ensata)、黃菖蒲(I. spseudacorus)為試材，依次編號1～4，栽培于山西現(xiàn)代園藝科技示范基地。參試材料均為當(dāng)年從根狀莖無性繁殖的幼苗，選取長勢一致的新生幼苗待用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考施旭麗等[8]的方法，將待用鳶尾根部洗凈后，去離子水緩苗培養(yǎng)，待有白色新根長出置于含有1/2 Hoagland 營養(yǎng)液的塑料箱(容積4 L)中預(yù)培養(yǎng)，并用具孔泡沫板固定，每個(gè)塑料箱栽植同種鳶尾12 株。預(yù)培養(yǎng)20 d 后，4 種鳶尾分別設(shè)置對照(CK，Pb 濃度為0)和脅迫(PB，Pb 濃度為1 200 mg·L-1)2 個(gè)處理組，脅迫組中Pb 以Pb(NO3)2的形式加入，對照組則1/2 Hoagland 營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。營養(yǎng)液用氣泵加氧，每4 d 更換1 次，室內(nèi)溫度25 ℃。每種鳶尾各處理測定指標(biāo)分別重復(fù)3 次。

1.3 指標(biāo)測定及方法

脅迫20 d 后，在CK 和PB 組中分別收集各鳶尾幼苗，用直尺測量最長葉長(LL)、葉寬(LW，最長葉最寬處)和最長根長(RL)；分離莖葉和根部，洗凈后稱量莖葉(SFW)和根(RFW)的鮮質(zhì)量，烘箱105 ℃殺青1 h，80 ℃烘干至恒重，稱取莖葉(SDW) 和根(RDW)的干質(zhì)量；采用硫代巴比妥酸比色法測定葉片丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量[9]、NBT 光還原法測定葉片超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性[10]、紫外線吸收法測定葉片過氧化氫酶(catalase, CAT)活性[11]，茚三酮比色法、考馬斯亮藍(lán)法分別測定葉片脯氨酸(proline, Pro)[12]、可溶性蛋白(soluble protein，SP) 含量[13]；參考田松青等[14]方法，分別選取PB 處理各鳶尾烘干至恒質(zhì)量的地上部分和地下部分，測定Pb 濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

依據(jù)各鳶尾地上部分和地下部分的Pb 濃度計(jì)算富集系數(shù)(BCF)和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)(TC)[15]。

BCF= 植株地上部分Pb 濃度/營養(yǎng)液中Pb 濃度；

TC= 植株地上部分Pb 濃度/植株根中Pb 濃度。

基于上述指標(biāo)的測定值分別計(jì)算LL、LW、RL、SFW、RFW、SDW、RDW 及MDA、SOD、CAT、Pro、SP 的脅迫指數(shù)。

脅迫指數(shù) = (處理組該指標(biāo)的測定值/對照組該指標(biāo)的測定值) × 100%[8]。

隸屬函數(shù)計(jì)算公式如下：

式中：Xj為第j個(gè)指標(biāo)值，U(Xj)為第j個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，Xmax和Xmin分別為第j個(gè)指標(biāo)的最大和最小值。

各項(xiàng)指標(biāo)的權(quán)重：

式中：Wj為第j個(gè)綜合指標(biāo)在全部指標(biāo)中的重要程度，Pj為第j個(gè)綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率。

水生鳶尾的綜合耐Pb 性強(qiáng)弱：

式中：F值表示水生鳶尾在Pb 脅迫下的耐Pb 性綜合得分值。

采用SPSS 18.0 軟件分別對4 種水生鳶尾的12 個(gè)耐Pb 指標(biāo)進(jìn)行方差分析(單因素ANOVA)、相關(guān)性分析(Pearson)、主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb 在水生鳶尾不同器官的富集和分布

如表1 所列，地上和地下部分富集Pb 最高的水生鳶尾為花菖蒲，吸收Pb 的主要部位在地下部分，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于富集在地上部分的Pb 含量。黃菖蒲地下和地上部分Pb 富集量最小，其他水生鳶尾介于兩者之間。4 種水生鳶尾BCF 和TC 以花菖蒲最高，分別達(dá)到8.12 和0.24，其次為西伯利亞鳶尾(6.30和0.22)，黃菖蒲最低(1.38 和0.06)。

表1 Pb 脅迫后4 種水生鳶尾地上部分和地下部分Pb 富集量和分布情況Table 1 Above and underground Pb concentrations after Pb stress in four aquatic Iris species

2.2 Pb 脅迫下水生鳶尾幼苗生長及生理指標(biāo)的脅迫指數(shù)分析

經(jīng)1 200 mg·L-1Pb 脅迫后4 種水生鳶尾的7 個(gè)生長指標(biāo)脅迫指數(shù)如表2 所列。在Pb 脅迫下，玉蟬花和黃菖蒲的生物量、黃菖蒲的莖葉鮮重和干重、玉蟬花的葉長明顯下降，脅迫指數(shù)較低。不同鳶尾多數(shù)指標(biāo)的脅迫指數(shù)均存在較大差異，葉長脅迫指數(shù)為65.72%～96.97%，莖葉鮮質(zhì)量、干質(zhì)量的脅迫指數(shù)分別在31.01%～92.83%、21.60%～81.67%，根鮮質(zhì)量、干質(zhì)量的脅迫指數(shù)分別在21.83%～96.95%、49.27%～90.98%，以莖葉、根鮮質(zhì)量的脅迫指數(shù)差異最大，說明參試水生鳶尾的莖葉鮮質(zhì)量、根鮮質(zhì)量對Pb 脅迫更為敏感。

表2 Pb 脅迫后4 種水生鳶尾各生長和生理指標(biāo)的脅迫指數(shù)Table 2 Stress indices for different growth and physiological factors in four aquatic Iris species following Pb stress%

如表2 所列，1 200 mg·L-1Pb 脅迫下，黃菖蒲的SOD、CAT 脅迫指數(shù)較低，而MDA 的脅迫指數(shù)則相對較高，說明Pb 脅迫對其生理代謝造成較大的不利影響；而花菖蒲SOD、SP 和Pro 的脅迫指數(shù)較高，MDA 的脅迫指數(shù)變化幅度較小，表明Pb 脅迫對其生理代謝的抑制作用相對較弱。

2.3 單項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性分析

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，各指標(biāo)間均表現(xiàn)出不同程度的相關(guān)性(表3)。如，SP 與SOD 顯著相關(guān)(r= 0.957，P＜ 0.05)，說明SP 與SOD 攜帶了95.7%的共同信息，需要篩選出既可替代原有指標(biāo)，又相互獨(dú)立、信息不重疊的新指標(biāo)來鑒定水生鳶尾的耐Pb 性。

表3 單項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)系數(shù)矩陣Table 3 Correlation matrix of all stress indices and physiological factors

2.4 單項(xiàng)指標(biāo)主成分分析及綜合評價(jià)

對各耐Pb 指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如表4 所列，原有12 個(gè)指標(biāo)轉(zhuǎn)變?yōu)? 個(gè)相互獨(dú)立的主成分因子(CI1、CI2、CI3)，貢獻(xiàn)率分別為55.02%、24.11%、20.87%，主成分CI1中 LL、LW、SFW、RFW、RDW系數(shù)較大，這5 個(gè)指標(biāo)均與Pb 脅迫下植物生長狀況有關(guān)，所以CI1主要表示生長狀況綜合因子；主成分CI2中對應(yīng)較大的變量為負(fù)向標(biāo)MDA，反映出Pb 脅迫下植物質(zhì)膜的受損程度，所以CI2主要表示傷害程度綜合因子；RL 在主成分CI3中具有較大載荷，反映出植物可通過調(diào)節(jié)根系生長，增強(qiáng)從環(huán)境中吸收水和養(yǎng)分的能力來耐受Pb 脅迫，因而CI3主要表示耐Pb 能力綜合因子。同時(shí)LL、LW、SFW、RFW、RDW 在貢獻(xiàn)率較高的主成分CI1中系數(shù)較大，認(rèn)為這些指標(biāo)在一定程度上可作為鑒定水生鳶尾耐Pb 能力的重要指標(biāo)。

表4 綜合指標(biāo)的系數(shù)和貢獻(xiàn)率Table 4 Principal component analysis coefficients and cumulative contributions for the different stress indices and physiological factors

如表5 所列，4 種水生鳶尾中，花菖蒲在U(X1)和U(X3)隸屬值最高，反映了植株形態(tài)和生物量受Pb 脅迫影響較小，對Pb 毒害的耐受力較強(qiáng)；而西伯利亞鳶尾在U(X2)中分值最高，表明Pb 脅迫并未加劇植物細(xì)胞膜脂過氧化作用。綜合D(X1)、D(X2)和D(X3)，耐Pb 能力最強(qiáng)的水生鳶尾為花菖蒲，西伯利亞鳶尾、黃菖蒲次之，玉蟬花最弱。

表5 鳶尾屬植物綜合指標(biāo)值、權(quán)重、F 值和綜合排序Table 5 Comprehensive index, weight value, F value, and comprehensive ranking of the four Iris species

3 討論與結(jié)論

篩選Pb 富集植物是進(jìn)行Pb 污染地區(qū)植物修復(fù)工作的前提。已有許多科研學(xué)者對Pb 富集植物進(jìn)行了篩選分析。如，馬藺(Iris lactea)在尾礦Pb 污染區(qū)葉片和根系富集的Pb 含量分別為126.9 和1 725 mg·kg-1[16]。溪蓀(I. sanguinea) 在500 mg·L-1Pb 脅迫下，其地上和地下部分Pb 含量僅為671.38 和835.77 mg·kg-1[17]。Panda[18]把地上部分富集Pb 含量大于1 000 mg·kg-1的植物定義為Pb 超積累植物。本研究中，1 200 mg·L-1Pb 脅迫下4 種水生鳶尾地上部分Pb 含量均在1 000 mg·kg-1以上，但富集于根的Pb濃度遠(yuǎn)高于地上部分，這與前人的研究結(jié)果一致[16]。同時(shí)，各鳶尾Pb 富集量也表現(xiàn)出較大差異，以花菖蒲地上、地下部分Pb 含量最高，分別達(dá)到9 739.24、40 999.05 mg·kg-1，可能是花菖蒲生物量較大，尤其是具有粗壯的根莖，積累了一定的養(yǎng)分，對植株逆境耐性起到重要作用，因而表現(xiàn)出花菖蒲各部分Pb 富集量高于西伯利亞鳶尾、玉蟬花和黃菖蒲的結(jié)果[14]。從轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)來看，花菖蒲、西伯利亞鳶尾轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)分別為0.24 和0.22，表明這兩種水生鳶尾能較快地將富集的Pb 運(yùn)向地上部，黃菖蒲轉(zhuǎn)運(yùn)Pb 的能力則相對較差。在工礦區(qū)重Pb 污染治理中，結(jié)合美化環(huán)境，花菖蒲、西伯利亞鳶尾具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

近年來，有關(guān)Pb 對植物生長發(fā)育及生理代謝的影響研究已成為探討植物逆境適應(yīng)性的熱點(diǎn)之一。粟春青等[19]認(rèn)為，低濃度Pb 處理會(huì)使金花茶(Camellia nitidissima)地上和地下部分生物量增加。Iqbal 等[20]則認(rèn)為，高濃度Pb 脅迫會(huì)引起玉米(Zea mays)營養(yǎng)物質(zhì)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)受阻，影響植物長勢，導(dǎo)致生物量下降?？梢姡参飳p度Pb 脅迫具有一定抵御能力，但隨著Pb 濃度的升高，生長受到明顯抑制。本研究中，在1 200 mg·L-1Pb 處理下，參試的4 種水生鳶尾幼苗均出現(xiàn)葉和根生長緩慢，生物量下降等受害癥狀，說明1 200 mg·L-1Pb 脅迫可抑制水生鳶尾幼苗的生長發(fā)育，但Pb 對不同鳶尾的毒害作用也存在較大差異，表明4 種水生鳶尾對Pb 脅迫表現(xiàn)出不同的耐受性。

植物在遭受逆境時(shí)體內(nèi)活性氧(ROS)會(huì)處于失衡狀態(tài)，導(dǎo)致ROS 過量積累，氧化逆境又引起MDA含量增加，進(jìn)一步對機(jī)體造成損傷。SOD、CAT 作為ROS 清除酶，可協(xié)同作用將超氧陰離子自由基、過氧化氫轉(zhuǎn)變成水，減少ROS 對機(jī)體的負(fù)面影響[21]。已有研究表明，鳳仙花(Impatiens balsamina)可通過調(diào)節(jié)活性氧清除酶活性，抵御輕度Pb 脅迫對自身的毒害，但1 000～1 500 mg·kg-1高濃度Pb處理的SOD、CAT 活性則顯著降低[22]。香根草(Vetiveria zizanioides)酶活性隨Pb 濃度增加表現(xiàn)出先升后降的趨勢，SOD、CAT 活性在4 mmol·L-1Pb濃度處理下明顯下降[23]。與前人研究得出的結(jié)果類似，本研究中，1 200 mg·L-1Pb 處理時(shí)，黃菖蒲葉片MDA 含量明顯增加，SOD、CAT 活性均明顯下降。說明在此濃度下機(jī)體酶保護(hù)系統(tǒng)失活或破壞，過量ROS 致使細(xì)胞氧化損傷，導(dǎo)致MDA 含量增加。而其他鳶尾MDA 含量略有增加，證明該濃度內(nèi)機(jī)體細(xì)胞受損程度較輕，表現(xiàn)出一定的耐Pb 性。植物受到逆境脅迫時(shí)，Pro 能與蛋白質(zhì)產(chǎn)生水合作用，避免細(xì)胞的空間結(jié)構(gòu)被逆境破壞，并可與SP 一起以滲透調(diào)節(jié)的形式保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[24]。黑麥草(Lolium perenne)能通過快速提高Pro 含量，緩解Pb 損傷，但高濃度Pb 脅迫超出了黑麥草忍受極限，Pro 明顯下降[25]。相同的研究結(jié)果也出現(xiàn)在玉米(Zea mays)的耐Pb 研究中[26]。本研究中，1 200 mg·L-1Pb 脅迫可能調(diào)控了花菖蒲相關(guān)基因表達(dá)，使葉內(nèi)Pro 和SP 含量明顯增加，緩解環(huán)境水勢下降造成的細(xì)胞失水，以保持植株正常生長代謝，這可能是花菖蒲有效抵御Pb 脅迫的機(jī)制之一。而玉蟬花、西伯利亞鳶尾的Pro 含量均低于對照，這與毛雪飛等[27]對金銀花(Lonicera japonica) Pb 脅迫的研究結(jié)果一致。推測是高濃度Pb 影響兩種水生鳶尾的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，阻礙了Pro 合成所致。

基于多指標(biāo)進(jìn)行綜合分析可避免單項(xiàng)指標(biāo)鑒定時(shí)的片面性，從而更加全面、準(zhǔn)確地鑒定植物的抗逆能力。因此，多數(shù)研究學(xué)者采用隸屬函數(shù)分析、主成分分析及聚類分析綜合評價(jià)植物抗逆性[28-29]。本研究中，運(yùn)用隸屬函數(shù)結(jié)合主成分分析對參試4 種水生鳶尾耐Pb 性進(jìn)行綜合評價(jià)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，主成分分析將原來12 個(gè)單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)化成3 個(gè)主成分因子，第1 主成分貢獻(xiàn)率較高，達(dá)到55.02%，其中5 個(gè)耐Pb 指標(biāo)(LL、LW、SFW、RFW、RDW)載荷較大，表明這5 項(xiàng)生長指標(biāo)能夠在一定程度上反映水生鳶尾耐Pb 能力，可作為水生鳶尾耐Pb 性評價(jià)的指標(biāo)。這與施旭麗等[8]得出菊花(Chrysanthemum×morifolium)耐鎘性評價(jià)的主要指標(biāo)為SFW、SDW和RFW 等生物量指標(biāo)的研究結(jié)果相似。而這些直觀的生長指標(biāo)也更易應(yīng)用于評價(jià)植物抗逆性的實(shí)踐中。

綜上，參試4 種水生鳶尾Pb 的富集、轉(zhuǎn)運(yùn)能力及耐Pb 性存在明顯差異，初步評價(jià)出耐Pb 型水生鳶尾(花菖蒲)和較耐Pb 型水生鳶尾(西伯利亞鳶尾)，這兩種水生鳶尾Pb 的富集、轉(zhuǎn)運(yùn)能力較強(qiáng)，不僅可用于Pb 污染水體的植物修復(fù)，也為耐Pb 水生鳶尾品種選育以及后續(xù)耐Pb 基因挖掘奠定基礎(chǔ)。