連鶴娜，李春杰

（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心 / 甘肅省西部草業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心 / 蘭州大學(xué)草地微生物研究中心 / 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 甘肅 蘭州 730020）

醉馬草(Achnatherum inebrians)是禾本科芨芨草屬(Achnatherum) 多年生草本植物，主要分布在新疆、青海、甘肅、陜西等西北地區(qū)[1]，是我國北方天然草原主要烈性毒草之一。自然生長(zhǎng)的醉馬草多為醉馬草-內(nèi)生真菌共生體。禾草內(nèi)生真菌是指在禾草中度過全部或部分生命周期，而禾草不顯示外部癥狀的一類真菌[2]。禾草內(nèi)生真菌通常情況下是指子囊菌門麥角菌科下的有性態(tài)Epichlo?屬和其所對(duì)應(yīng)的無性態(tài)Neotyphodium屬內(nèi)生真菌[3-4]，按照最新的國際命名法規(guī)，現(xiàn)已統(tǒng)一稱為Epichlo?屬[2]。禾草內(nèi)生真菌提高了禾草對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的抗性，如耐旱性[5]、耐鹽堿性[6-7]、耐寒性[8]、耐金屬性[9]、抗病性[10]、抗蟲性[11]、驅(qū)鳥性[12]等。大部分醉馬草生長(zhǎng)在西北地區(qū)，但據(jù)第二次全國土地普查報(bào)告顯示，中國鹽堿化耕地主要分布在東北、華北以及西北內(nèi)陸地區(qū)，其中西北內(nèi)陸地區(qū)尤為嚴(yán)重，鹽堿化土壤面積已達(dá)200 多萬hm2[13]。

種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)是植物生長(zhǎng)周期中生理代謝最旺盛、最敏感的階段[14]，鹽脅迫可能會(huì)改變其細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變[15]，限制生長(zhǎng)，甚至不能完成生命周期。為此，尋求醉馬草耐鹽途徑和方法對(duì)促進(jìn)鹽脅迫下醉馬草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)具有重要意義。近年來，許多學(xué)者開展了添加外源物質(zhì)研究植物耐鹽性，其中水楊酸 (salicylic acid, SA) 是一種重要的外源激素。其作為一種信號(hào)分子，能在植物體內(nèi)觸發(fā)一系列防御機(jī)制[16]，對(duì)植物的抗旱性[17]、抗寒性[18]、耐熱性[19]、抗鹽性[20]都有一定影響。外源噴撒SA 可以增加鹽脅迫下紫花苜蓿(Medicago sativa)幼苗含水量、緩解鹽脅迫對(duì)株高和莖粗的抑制作用，提高超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶的活性，減少丙二醛的積累[21]。黃玉梅等[22]研究表明，1.0 mmol·L-1的SA 可以提高鹽脅迫下百日草(Zinnia elegans)種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，并提高其抗性氧化酶活性。

目前有關(guān)外源物質(zhì)對(duì)醉馬草種子萌發(fā)的影響研究較少，僅有柳莉等[23]報(bào)道了1.5 mmol·L-1SA 浸種能緩解低溫脅迫對(duì)醉馬草種子萌發(fā)的影響。關(guān)于鹽脅迫下SA 浸種對(duì)醉馬草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響尚未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以醉馬草感染內(nèi)生真菌 (E+) 和未感染內(nèi)生真菌 (E-) 種子為材料，研究不同濃度SA 浸種對(duì)NaCl 脅迫下醉馬草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響，從而篩選出提高鹽脅迫醉馬草種子發(fā)芽能力的最佳SA 濃度，進(jìn)一步探索添加SA 對(duì)提高醉馬草建植期耐鹽性的作用，為研究醉馬草抗鹽性、生理生化及分子機(jī)理奠定了一定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為醉馬草E+、E-種子。醉馬草種子于2019 年采自蘭州大學(xué)榆中校區(qū)試驗(yàn)田(104°08′ E，35°56′ N，海拔1 514 m)，帶菌率為100%，將一半種子用稀釋100 倍的70%甲基托布津浸泡2 h 滅菌，滅菌后鏡檢，確認(rèn)帶菌率為0，得到不帶菌的醉馬草種子。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1鹽脅迫下醉馬草種子的發(fā)芽試驗(yàn)

種子萌發(fā)試驗(yàn)采用TP 法，從供試醉馬草種子中篩選出顆粒飽滿，大小均勻的成熟種子，用1%次氯酸鈉浸泡5 min 后，立即轉(zhuǎn)移到70%乙醇中浸泡2 min，取出后用蒸餾水沖洗3～5 次，用濾紙將水分吸干后置于含有雙層濾紙的9 cm 培養(yǎng)皿中，每皿30 粒種子，每個(gè)培養(yǎng)皿中分別加入5 mL 不同濃度的NaCl 溶液 (0、50、100、150、200、250 mmol·L-1)，共6 個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)4 次，NaCl 溶液濃度為0 組使用蒸餾水，為對(duì)照組。將培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱，溫度設(shè)置為25 ℃，用箱暗發(fā)芽。試驗(yàn)期間，濾紙始終保持濕潤而無明水，每天補(bǔ)充對(duì)應(yīng)濃度鹽溶液使脅迫種子的鹽濃度保持恒定。自種子置培養(yǎng)皿之日起，每天觀察并記錄發(fā)芽數(shù)。14 d 后選擇E+、E-醉馬草種子發(fā)芽率最接近50%的鹽濃度模擬鹽脅迫，進(jìn)行鹽脅迫下SA 浸種試驗(yàn)。

1.2.2 水楊酸浸種對(duì)鹽脅迫下E+和E-醉馬草種子萌發(fā)的影響

通過鹽脅迫試驗(yàn)選取200 mmol·L-1的NaCl 溶液模擬鹽脅迫，SA 處理液設(shè)0、0.05、0.10、0.25、0.50、1.00 mmol·L-16 個(gè)濃度梯度，每個(gè)處理重復(fù)4 次，0 處理為不加SA 處理液，為對(duì)照組。將消毒后的種子分別放入各濃度SA 中浸泡24 h。每個(gè)培養(yǎng)皿放入兩層濾紙，并加入5 mL 200 mmol·L-1NaCl溶液，然后將種子均勻放入培養(yǎng)皿。放置于恒溫箱內(nèi)25 ℃暗萌發(fā)。試驗(yàn)期間保持濾紙濕潤，鹽分濃度恒定。每天觀察記錄發(fā)芽數(shù)，待種子萌發(fā)結(jié)束后測(cè)量胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)、鮮重、干重等指標(biāo)。

種子萌發(fā)以胚根長(zhǎng)與種子等長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)達(dá)到種子的一半為標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)第5 天測(cè)定發(fā)芽勢(shì)。第14 天測(cè)定發(fā)芽數(shù)，計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)，并從各重復(fù)組中隨機(jī)選取10 株幼苗，測(cè)定其胚根長(zhǎng)和胚芽長(zhǎng)及幼苗總鮮重，不足10 株則全部測(cè)量，取平均數(shù)。測(cè)量鮮重后的幼苗裝入信封袋在60 ℃下烘干2 d 至恒重，測(cè)量總干重和幼苗含水量。種子萌發(fā)指標(biāo)計(jì)算公式如下：

式中：n14和n5分別代表第14 天和第5 天的種子發(fā)芽數(shù)，M代表供試種子總數(shù)，Gt指第t天種子的發(fā)芽數(shù)，Dt指相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)，S指一定時(shí)期內(nèi)正常幼苗的單株長(zhǎng)度[22]。

1.3 綜合水楊酸緩解醉馬草種子萌發(fā)鹽害作用的評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.3.1 模糊隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)法

采用模糊隸屬函數(shù)法分別計(jì)算不同SA 對(duì)鹽脅迫下E+和E-醉馬草種子萌發(fā)生長(zhǎng)緩解作用的隸屬函數(shù)值，以綜合評(píng)價(jià)鹽脅迫下不同SA 對(duì)醉馬草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的緩解作用[24]。計(jì)算公式如下：

式中：μ(Xj) 代表第j個(gè)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值；Xj代表第j個(gè)指標(biāo)值；Xmin代表第j個(gè)指標(biāo)的最小值；Xmax代表第j個(gè)指標(biāo)的最大值。

1.3.2 單項(xiàng)指標(biāo)主成分分析

單項(xiàng)指標(biāo)主成分分析為篩選評(píng)價(jià)SA 緩解E+、E-醉馬草種子鹽害作用的主要指標(biāo)，對(duì)E+和E-醉馬草的各單項(xiàng)指標(biāo)的系數(shù)ω 進(jìn)行主成分分析[24]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 26.0 軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示測(cè)定結(jié)果，分別對(duì)不同鹽濃度處理、鹽脅迫下不同SA 處理進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行Duncan’s 多重比較分析；采用模糊隸屬函數(shù)法綜合評(píng)價(jià)不同SA 對(duì)鹽脅迫下醉馬草種子萌發(fā)生長(zhǎng)的緩解作用；通過單項(xiàng)指標(biāo)主成分分析以篩選評(píng)價(jià)SA 緩解醉馬草鹽害作用的主要指標(biāo)；采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鹽脅迫對(duì)醉馬草種子萌發(fā)特性的影響

50～250 mmol·L-1鹽濃度均對(duì)醉馬草種子的萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用，且隨鹽濃度增加，抑制作用增強(qiáng)(表1)。其中在50、100 mmol·L-1鹽濃度下，E+、E-醉馬草發(fā)芽率低于對(duì)照組(P＞ 0.05)，在150、200 和250 mmol·L-1鹽濃度下，種子發(fā)芽率顯著低于對(duì)照組(P＜ 0.05)。在50 mmol·L-1鹽濃度下，E+、E-醉馬草發(fā)芽勢(shì)略低于對(duì)照組，其余4 組鹽濃度下( ＞ 50 mmol·L-1)，二者發(fā)芽勢(shì)均顯著低于對(duì)照組(P＜ 0.05)。說明低濃度鹽脅迫對(duì)醉馬草種子萌發(fā)無顯著影響(P＞ 0.05)，在各鹽濃度下，E+、E-醉馬草發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)較對(duì)照組均顯著降低，且除200 和250 mmol·L-1鹽濃度之間醉馬草活力指數(shù)無顯著差異外，其余各濃度之間其發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均存在顯著差異。此外，不同鹽濃度脅迫下，E+醉馬草種子萌發(fā)狀況優(yōu)于E-，其中在200 mmol·L-1鹽濃度下，E+醉馬草發(fā)芽率顯著高于E-，說明在較高鹽濃度下，E+醉馬草的耐鹽性顯著高于E-。

表1 不同濃度鹽脅迫處理下醉馬草種子的萌發(fā)情況Table 1 Germination of drunken horse grass seeds under different concentrations of salt stress

2.2 不同濃度水楊酸對(duì)鹽脅迫下醉馬草種子萌發(fā)特性及幼苗生長(zhǎng)的影響

2.2.1 不同濃度水楊酸對(duì)鹽脅迫下醉馬草發(fā)芽指標(biāo)的影響

當(dāng)SA 為0.10 mmol·L-1時(shí)，醉馬草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)最高(表2)。在0.05～0.50 mmol·L-14 個(gè)SA 濃度下，醉馬草發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)均高于對(duì)照，其中，0.05、0.10 和0.50 mmol·L-1濃度下E+醉馬草發(fā)芽率顯著高于對(duì)照 (P＜ 0.05)；在0.05～0.50 mmol·L-14 個(gè)SA 濃度下E+、E-醉馬草發(fā)芽勢(shì)均顯著高于對(duì)照。1.00 mmol·L-1濃度下，E+、E-醉馬草發(fā)芽率均低于對(duì)照，發(fā)芽勢(shì)為0。說明0.05～0.50 mmol·L-1的SA 顯 著 促 進(jìn) 醉 馬 草 的 萌 發(fā)，1.00 mmol·L-1的SA 抑制醉馬草的萌發(fā)。此外，E-醉馬草發(fā)芽率在5 個(gè)SA 濃度下均與對(duì)照無顯著差異，說明E-醉馬草種子的萌發(fā)能力比E+弱。與對(duì)照相比，E+醉馬草發(fā)芽率在0.05～0.50 mmol·L-1SA 濃度下分別增加50.52%、59.61%、35.01%、52.52%，發(fā)芽勢(shì)分別增加75.55%、126.05%、111.10%、100%，在1.00 mmol·L-1濃度下發(fā)芽率降低37.49%；E-醉馬草發(fā)芽率在0.05～0.50 mmol·L-1SA 濃度下分別增加26.31%、31.60%、24.28%、36.85%，發(fā)芽勢(shì)分別增加138.50%、184.70%、181.93%、138.50%，在1.00 mmol·L-1濃度下發(fā)芽率降低39.46%。在5 個(gè)SA 濃度梯度下，醉馬草發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)大致呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。

當(dāng)SA 為0.10 mmol·L-1時(shí)，醉馬草種子的發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)最高(表2)。在0.05～0.50 mmol·L-14 個(gè)SA 濃度下，醉馬草發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均高于對(duì)照組，其中，在0.05 和0.10 mmol·L-1濃度下E+醉馬草發(fā)芽指數(shù)顯著高于SA 濃度為對(duì)照組 (P＜0.05)，在0.05～0.50 mmol·L-14 個(gè)濃度下，E+醉馬草活力指數(shù)顯著高于對(duì)照組；在0.05、0.10 和0.25mmol·L-1下E-醉馬草發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均顯著高于對(duì)照組。1.00 mmol·L-1時(shí)，醉馬草發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)低于對(duì)照組，其中，E+醉馬草發(fā)芽指數(shù)顯著低 于 對(duì) 照 組。綜 上 所 述，0.05 和0.10 mmol·L-1的SA 顯 著 促 進(jìn) 醉 馬 草 種 子 萌 發(fā)，1.00 mmol·L-1的SA 抑制醉馬草種子萌發(fā)。與對(duì)照組相比，E+醉馬草發(fā)芽指數(shù)在0.05～0.50 mmol·L-1SA 濃度下分別增加63.61%、74.01%、57.70%和49.26%，活力指數(shù)分別增加152.17%、201.28%、153.01%和88.07%，在1.00 mmol·L-1濃度下發(fā)芽指數(shù)降低58.85%，活力指數(shù)降低43.79%；E-醉馬草發(fā)芽指數(shù)在0.05～0.50 mmol·L-1SA 濃度下分別增加65.79%、78.01%、72.09%和51.79%，活力指數(shù)分別增加192.76%、201.90%、176.39%和99.37%，在1.00 mmol·L-1濃度下發(fā)芽指數(shù)降低57.42%，活力指數(shù)降低73.09%。在5 個(gè)SA 濃度梯度下，醉馬草發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。此外，E+醉馬草發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均高于E-醉馬草。

表2 不同濃度SA 對(duì)鹽脅迫下醉馬草種子萌發(fā)情況的影響Table 2 Effects of different concentrations of salicylic acid on the germination of drunken horse grass under salt stress

2.2.2 不同濃度水楊酸對(duì)醉馬草胚根和胚芽長(zhǎng)的影響

E+、E-醉馬草胚根長(zhǎng)隨SA 濃度的增加呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢(shì)，其中0.05～0.50 mmol·L-1濃度下胚根長(zhǎng)度顯著高于對(duì)照組 (P＜ 0.05) (表3)，與對(duì)照組比較，E+醉馬草胚根長(zhǎng)度依次增加62.26%、71.70%、69.81 和、62.26%，E-醉馬草依次增加65.22% 、60.87% 、89.13% 和80.43% 。 當(dāng)SA 濃度為0.10 mmol·L-1時(shí)E+醉馬草胚根長(zhǎng)達(dá)到最大，與0.05、0.25 和0.50 mmol·L-1無 顯 著 差 異 (P＞0.05)。當(dāng)SA 濃度為0.25 mmol·L-1時(shí)E-醉馬草胚根長(zhǎng)達(dá)到最大，與0.05 和0.10 mmol·L-1存在顯著差異，與0.50 mmol·L-1濃度無顯著差異。1.00 mmol·L-1SA 下E+、E-醉馬草胚根長(zhǎng)顯著低于對(duì)照組，分別比對(duì)照組低24.53% 和21.74%。在0.05 和0.10 mmol·L-1SA 濃 度 下，E+醉 馬 草 胚 根 長(zhǎng) 顯 著 高于E-，分別相差13.16%和22.97%，其余濃度下二者差異不顯著。

表3 不同濃度SA 對(duì)鹽脅迫下醉馬草胚根和胚芽的影響Table 3 Effects of different concentrations of salicylic acid on radicle and germ lengths of drunken horse grass under salt stress

E+、E-醉馬草胚芽長(zhǎng)隨SA 濃度的增加呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢(shì)，其中0.05～0.50 mmol·L-1濃度下胚芽長(zhǎng)度顯著高于對(duì)照組 (表3)，與對(duì)照組比較，E+醉馬草胚芽長(zhǎng)度依次增加62.50%、75.00%、69.38%和44.38%，E-醉馬草依次增加67.65%、69.12%、55.88%和21.06%。E+、E-醉馬草均在SA 濃度為0.10 mmol·L-1時(shí)胚芽長(zhǎng)達(dá)到最大。1.00 mmol·L-1SA 下E+、E-醉馬草胚芽長(zhǎng)度低于對(duì)照組 (P＞ 0.05)，分別比對(duì)照組低6.88%%、36.03%。在0.05、0.10、0.25 和1.00 mmol·L-1的SA 處理下，E+醉馬草幼苗胚芽長(zhǎng)都顯著高于E-，分別比E-高14.04%、21.74%、27.83%和71.26%。

綜上所述，SA 濃度0.05～0.50 mmol·L-1可以顯著促進(jìn)鹽脅迫醉馬草幼苗胚根和胚芽的生長(zhǎng)，而當(dāng)SA 濃度超過1.00 mmol·L-1則會(huì)抑制胚根和胚芽的生長(zhǎng)。E+醉馬草胚根胚芽長(zhǎng)始終大于E-醉馬草，說明E+醉馬草的生長(zhǎng)能力和耐鹽能力高于E-醉馬草。

2.2.3 不同濃度水楊酸對(duì)醉馬草幼苗生長(zhǎng)及含水量的影響

在0.05、0.10、0.25 和0.50 mmol·L-1SA 濃度下，E+、E-醉馬草幼苗鮮重顯著高于對(duì)照組 (P＜ 0.05)(表4)，E+醉馬草幼芽鮮重分別增加16.66%、25.07%、21.99%和11.09%，E-醉馬草分別增加20.13%、16.13%、9.69%和14.84%。在1.00 mmol·L-1濃度下，E+、E-醉馬草幼芽鮮重低于對(duì)照組，但差異不顯著 (P＞0.05)，分別降低2.68% 和7.29%。E+醉馬草在0.10 mmol·L-1SA 濃度下鮮重最高，顯著高于0.50 和1.00 mmol·L-1，與0.05 和0.25 mmol·L-1差異不顯著。E-醉馬草在0.05 mmol·L-1SA 濃度下鮮重最高，顯著高于0.25 和1.00 mmol·L-1。

表4 不同濃度SA 對(duì)鹽脅迫下醉馬草幼苗含水量的影響Table 4 Effects of different concentrations of salicylic acid on the water content of drunken horse grass seedlings under salt stress

在0.05～1.00 mmol·L-15 個(gè)SA 濃度下，E+、E-醉馬草干重均高于對(duì)照組，其中當(dāng)SA 濃度為0.05和0.10 mmol·L-1濃度時(shí)E+醉馬草干重顯著高于對(duì)照組，分別增加27.97%和37.21%，在0.10 mmol·L-1SA 濃度下E+醉馬草干重最高，顯著高于0.25和0.50 mmol·L-1，與0.05 mmol·L-1差異不顯著。當(dāng)濃度為0.05 mmol·L-1濃度時(shí)E-醉馬草干重顯著高于對(duì)照組，增加了17.30%。

當(dāng)SA 濃 度 為0.05、0.10 和0.25 mmol·L-1時(shí)，E+醉馬草幼苗含水量顯著高于對(duì)照組，分別增加14.03%、22.28% 和25.99%，當(dāng)SA 濃度為0.05、0.10和0.50 mmol·L-1，E-醉馬草幼苗含水量顯著高于對(duì)照組，分別增加22.50%、18.38% 和17.41%；在1.00 mmol·L-1濃度下，E+、E-醉馬草幼苗含水量低于對(duì)照組，分別降低4.42%、10.08%，但差異不顯著 (P＞0.05)。在0.25 mmol·L-1SA 濃度下E+醉馬草幼苗含水量最高，顯著高于0.05、0.50和1.00 mmol·L-1，與0.10 mmol·L-1差異不顯著。在0.05 mmol·L-1SA 濃度下E-醉馬草幼苗含水量最高，顯著高于1.00 mmol·L-1，與其余3 個(gè)SA 濃度差異不顯著。

另外，SA 濃度為0.10、0.25 和1.00 mmol·L-1時(shí)，E+醉馬草鮮重和幼苗含水量顯著高于E-；SA 濃度為0.05、0.10 mmol·L-1時(shí)，E+醉馬草干重顯著高于E-。綜上所述，隨著5 個(gè)SA 處理濃度的遞增，醉馬草鮮重、干重和幼苗含水量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)SA 濃度為0.10 mmol·L-1時(shí)，E+醉馬草鮮重和干重最高，0.25 mmol·L-1時(shí)幼苗含水量最高，當(dāng)SA 濃度為0.05 mmol·L-1時(shí)，E-醉馬草鮮重、干重和幼苗含水量最高。

2.3 SA 對(duì)鹽脅迫下醉馬草種子萌發(fā)緩解效果綜合分析

在外源激素SA 處理下E+、E-醉馬草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等形態(tài)指標(biāo)變化不同，應(yīng)用單一指標(biāo)不能準(zhǔn)確反映SA 的作用。模糊隸屬函數(shù)法可綜合各指標(biāo)，依據(jù)其隸屬函數(shù)值排序綜合評(píng)價(jià)鹽脅迫下SA 對(duì)醉馬草種子萌發(fā)的緩解作用，可避免單一指標(biāo)評(píng)價(jià)所帶來的片面性從而更加客觀真實(shí)[25]。計(jì)算不同濃度SA 處理下的E+、E-醉馬草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚芽長(zhǎng)、胚根長(zhǎng)、鮮重、干重和幼苗含水量的隸屬函數(shù)值，將各濃度SA 的各項(xiàng)隸屬函數(shù)值累加進(jìn)行綜合分析 (表5)。不同SA 處理濃度下E+醉馬草 的 隸 屬 函 數(shù) 值 排 序：0.10 mmol·L-1組 ＞ 0.25 mmol·L-1組 ＞ 0.05 mmol·L-1組 ＞ 0.50 mmol·L-1組 ＞對(duì)照組 ＞ 1.00 mmol·L-1組，E-醉馬草的隸屬函數(shù)值排 序 為：0.05 mmol·L-1組 ＞ 0.10 mmol·L-1組 ＞0.25 mmol·L-1組 ＞ 0.50 mmol·L-1組 ＞對(duì) 照 組 ＞1.00 mmol·L-1組。0.10～0.50 mmol·L-1濃度的SA 對(duì)鹽脅迫下E+、E-醉馬草種子的萌發(fā)均具有一定緩解作用，其中0.10 mmol·L-1SA 對(duì)E+醉馬草具有較好的緩解作用，0.05 mmol·L-1SA 對(duì)E-醉馬草具有較好的緩解作用。而1.00 mmol·L-1的SA 則抑制了鹽脅迫下E+、E-醉馬草種子的萌發(fā)。

表5 SA 緩解鹽脅迫下醉馬草種子萌發(fā)及芽苗生長(zhǎng)的隸屬函數(shù)值Table 5 Membership function values of drunken horse grass germination and bud and seedling growth under salt stress alleviated by salicylic acid

2.4 SA 對(duì)鹽脅迫下醉馬草種子萌發(fā)緩解效果的主成分分析

E+醉馬草SA 處理下主成分分析的第Ⅰ主成分特征值λ1= 6.682 (表6)，貢獻(xiàn)率為74.242%，種子萌發(fā)各指標(biāo)所對(duì)應(yīng)的特征向量中，胚根長(zhǎng)和活力指數(shù)性狀的數(shù)值較大，分別為0.939 和0.932，主要反映了SA 處理下醉馬草的幼苗根系生長(zhǎng)狀況和種子活力；第Ⅱ主成分特征值λ2= 1.139，貢獻(xiàn)率為12.658%，各指標(biāo)對(duì)應(yīng)的特征向量中，干重和發(fā)芽率性狀的數(shù)值較大，分別為0.479 和0.409，主要反應(yīng)了SA 處理下醉馬草的幼苗干物質(zhì)量和種子發(fā)芽狀況。

E-醉馬草SA 處理下主成分分析的第Ⅰ主成分特征值λ1= 6.418 (表6)，貢獻(xiàn)率為71.308%，種子萌發(fā)各指標(biāo)所對(duì)應(yīng)的特征向量中，發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)的數(shù)值較大，分別為0.937 和0.926，主要反映了在SA 處理下E-醉馬草發(fā)芽高峰的發(fā)芽狀況和種子活力；第Ⅱ主成分特征值λ2= 1.216，貢獻(xiàn)率為13.508%，各指標(biāo)所對(duì)應(yīng)的特征向量中，鮮重和幼苗含水量的數(shù)值較大，分別為0.552 和0.510，主要反映了E-醉馬草幼苗的總物質(zhì)量和幼苗的水分狀況。

表6 SA 對(duì)鹽脅迫下醉馬草種子萌發(fā)緩解效果的主成分分析Table 6 Principal component analysis of the alleviating effect of salicylic acid on seed germination of drunkenhorse grass under salt stress

綜上可知，以上主成分分析分別反映了SA 對(duì)鹽脅迫下E+、E-醉馬草種子萌發(fā)緩解作用的9 個(gè)指標(biāo)86.900%和84.816%的信息，對(duì)綜合評(píng)價(jià)SA 緩解醉馬草種子鹽害作用的意義較大。因此，胚根長(zhǎng)、活力指數(shù)、干重、發(fā)芽率可作為SA 緩解E+醉馬草鹽害作用綜合評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)；發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、鮮重、幼苗含水量可作為SA 緩解E-醉馬草鹽害作用綜合評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)。

3 討論與結(jié)論

種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)是生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵階段，種子的萌發(fā)除了與種子自身的遺傳因素有關(guān)外，還受外界環(huán)境，如溫度、水分、光照、滲透脅迫等的影響[26-27]。鹽堿環(huán)境下植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)都會(huì)在一定程度上受到抑制，如鹽脅迫下降低了黑麥草(Lolium perenne)[28]、新麥草(Psathyrostachys juncea)[25]、紫花苜蓿[21]的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和活力指數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)，醉馬草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均隨著鹽濃度的上升呈下降趨勢(shì)，在150 mmol·L-1及以上鹽濃度脅迫下，醉馬草發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)顯著下降。此外，E+醉馬草在本研究每個(gè)鹽濃度下發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)等指標(biāo)均高于E-，尤其在較高鹽濃度200 mmol·L-1下，E+醉馬草發(fā)芽率顯著高于E-，說明內(nèi)生真菌可以促進(jìn)鹽脅迫下種子的萌發(fā)，提高草種的耐鹽性，這與內(nèi)生真菌促進(jìn)鹽脅迫下野大麥(Hordeum brevisubulatum)種子的萌發(fā)結(jié)果[29]一致。曠宇等[30]的研究也表明，內(nèi)生真菌顯著提高了中華羊茅(Festuca sinensis)種子的耐鹽性。

本研究對(duì)鹽脅迫下醉馬草種子進(jìn)行SA 浸種處理，結(jié)果表明較低濃度SA (0.05～0.50 mmol·L-1)下，醉馬草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、胚根長(zhǎng)、胚芽長(zhǎng)、鮮重、干重、幼苗含水量與對(duì)照組相比，隨著SA 濃度上升呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，但當(dāng)SA 濃度過高時(shí) (1.00 mmol·L-1)，則會(huì)抑制醉馬草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)。E+醉馬草在0.10 mmol·L-1SA 濃度下萌發(fā)效果最好，而E-醉馬草在0.05 mmol·L-1下萌發(fā)效果最好，這可能是因?yàn)閮?nèi)生真菌提高了醉馬草對(duì)外界環(huán)境的耐受性，使E+醉馬草對(duì)SA 的敏感程度低于E-。外施SA 對(duì)種子的萌發(fā)均有一定的促進(jìn)作用，但是植物不同，其最適SA 濃度也存在差異。李穎等[31]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度0.1～10 μmol·L-1的SA 對(duì)扁蓿豆種子萌發(fā)、根長(zhǎng)和芽長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，大于20 μmol·L-1高濃度的SA 顯著抑制了種子萌發(fā)及根和芽的伸長(zhǎng)，即表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)高濃度抑制的效果。姜云天等[32]研究表明，1.5 mmol·L-1SA 對(duì)100 mmol·L-1鹽 脅 迫 茶 花 鳳仙(Impatiens balsamina)種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的綜合調(diào)控效果較好，而2 mmol·L-1SA 的效果相比于1.5 mmol·L-1則出現(xiàn)下降趨勢(shì)。說明不同植物對(duì)SA 的敏感程度不同，其最適濃度也不同，但關(guān)于SA 提高鹽脅迫下種子耐鹽性的具體機(jī)理還需進(jìn)一步研究。

本研究采用模糊隸屬函數(shù)和主成分分析綜合評(píng)定SA 對(duì)鹽脅迫下醉馬草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的緩解效果。隸屬函數(shù)值排序顯示，不同SA 濃度對(duì)E+醉馬草在鹽脅迫下的緩解作用為0.10 mmol·L-1組 ＞0.25 mmol·L-1組 ＞ 0.05 mmol·L-1組 ＞ 0.50 mmol·L-1組 ＞ 1.00 mmol·L-1組，對(duì)E-醉馬草的緩解作用為0.05 mmol·L-1組 ＞ 0.10 mmol·L-1組 ＞ 0.25 mmol·L-1組 ＞ 0.50 mmol·L-1組 ＞ 1.00 mmol·L-1組。且除0.10 mmol·L-1SA，其余SA 濃度下，E-醉馬草隸屬函數(shù)值均大于E+，SA 對(duì)E-醉馬草的緩解作用較大，即E-醉馬草對(duì)SA 較為敏感，這可能是內(nèi)生真菌提高了醉馬草對(duì)外界環(huán)境的抗性，這與前文觀點(diǎn)一致。另外，主成分分析結(jié)果表明，評(píng)價(jià)SA 緩解E+醉馬草鹽害作用的主要指標(biāo)為胚根長(zhǎng)、活力指數(shù)、干重、發(fā)芽率，評(píng)價(jià)SA 緩解E-醉馬草鹽害作用的主要指標(biāo)為發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、鮮重、幼苗含水量。