孟思宇，李曉青，魏小星，劉文輝，張永超，鮑根生

（青海省青藏高原優(yōu)質(zhì)牧草種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院, 青海 西寧 810016）

近年來(lái)，由于全球氣候變暖和人類(lèi)活動(dòng)等因素的綜合作用造成青藏高原高寒濕地面積呈持續(xù)縮減[1-2]。同時(shí)，青藏高原特殊的地理環(huán)境和生態(tài)系統(tǒng)的脆弱性成為退化高寒濕地修復(fù)主要限制因素[3-4]，而適應(yīng)濕地環(huán)境的草種匱乏是現(xiàn)階段高寒濕地植被修復(fù)的瓶頸問(wèn)題[5-6]?？梢?jiàn)，從原濕地草地群落篩選出對(duì)高寒濕生環(huán)境適應(yīng)性較強(qiáng)的鄉(xiāng)土草種是實(shí)現(xiàn)高寒退化濕地植被修復(fù)的有效途徑。

發(fā)草(Deschampsia caespitosa)系禾本科發(fā)草屬多年生草本植物，是青藏高原高寒濕地和高寒沼澤重要的鄉(xiāng)土草種[7]，成為退化高寒沼澤濕地植被恢復(fù)的重要生態(tài)型草種[8]。國(guó)外有關(guān)發(fā)草研究起步較早，發(fā)現(xiàn)發(fā)草對(duì)非生物逆境(冷凍、干旱、貧瘠土壤、水淹、重金屬)表現(xiàn)出較強(qiáng)適應(yīng)性[9-11]；同時(shí)，發(fā)草也表現(xiàn)出耐牧、抗蟲(chóng)和抗病能力[12-13]。相比之下，國(guó)內(nèi)有關(guān)發(fā)草研究較少，主要集中于種子萌發(fā)特性、種子繁殖技術(shù)、栽培馴化和適生地植物群落特征等方面[7,14-17]。另外，國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)發(fā)草是一種表型可塑性較強(qiáng)的植物，這與發(fā)草植株形態(tài)、生理、生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖特性等相關(guān)[9-10,12,18]。表型可塑性是植物同一基因型在不同環(huán)境中表現(xiàn)出不同表型差異的特性，表型差異是植物應(yīng)對(duì)不同生物和非生物逆境的關(guān)鍵生存策略[19-20]。其中，土壤水分是植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)階段所經(jīng)歷的最普遍的環(huán)境脅迫之一，成為影響植物種群更新潛力和擴(kuò)張能力的外部關(guān)鍵限制因素[21-22]。

Evans 和Etherington[23]研究發(fā)現(xiàn)采自濕地環(huán)境的種子對(duì)水分脅迫非常敏感，而干旱區(qū)植物種子表現(xiàn)出較強(qiáng)的干旱適應(yīng)能力。Ludewig 等[24]研究也發(fā)現(xiàn)濕潤(rùn)區(qū)和干旱區(qū)生境的種子在水分脅迫條件下出現(xiàn)明顯差異?？梢?jiàn)，種子成熟環(huán)境的水分條件對(duì)植物種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)表現(xiàn)出較強(qiáng)的生態(tài)生理特性的可塑性。然而，有關(guān)不同采集地發(fā)草種子如何響應(yīng)水分脅迫及地理生境對(duì)發(fā)草種子萌發(fā)特性是否存在可塑性等方面的研究尚未開(kāi)展。

基于此，本研究以四川省和青海省5 個(gè)不同采集地的發(fā)草種子為研究對(duì)象，采用不同濃度PEG-6000模擬水分脅迫的方法研究水分脅迫對(duì)發(fā)草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)影響，旨在明晰水分脅迫對(duì)發(fā)草種子萌發(fā)和幼苗定植的影響，確定不同采集地發(fā)草種子萌發(fā)的基礎(chǔ)水勢(shì)，進(jìn)而為利用發(fā)草修復(fù)和治理青藏高原退化高寒濕地提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)種子來(lái)源

2014 年8 月至9 月中旬發(fā)草種子成熟季節(jié)在青海省西寧市大通縣水灘地、四川省松潘縣高寒灌叢及紅原縣高寒濕地采集發(fā)草種子(表1)，采集標(biāo)準(zhǔn)為發(fā)草是采集地草地群落優(yōu)勢(shì)種(蓋度高于50%)，每個(gè)種群隨機(jī)采集30 株單株。帶回實(shí)驗(yàn)室并置于4 ℃冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1種子處理

隨機(jī)挑選部分大小均勻、籽粒飽滿的不同采集地發(fā)草種子，用1%次氯酸鈉溶液消毒5 min，隨后用蒸餾水沖洗數(shù)次，晾干備用。

1.2.2不同滲透勢(shì)PEG-6000 溶液配制

參照Michel 和Kaufmann 方法[25]，將PEG-6000配制成滲透勢(shì)分別為-0.2、-0.4、-0.6、-0.8、-1.0 和-1.2 MPa 的處理液，以添加蒸餾水為對(duì)照，在直徑12 cm 滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)放置雙層定性濾紙[雙圈牌，通用電氣生物科技(杭州)有限公司]，然后在不同處理的培養(yǎng)皿中分別添加不同滲透勢(shì)處理液，對(duì)照組加入5 mL 蒸餾水。隨機(jī)挑選50 粒消毒的不同采集地發(fā)草種子擺放于培養(yǎng)皿內(nèi)，5 次重復(fù)，稱(chēng)量每皿的初始重量。將供試培養(yǎng)皿置于人工氣候箱(RTOP,杭州拓普儀器有限公司)內(nèi)，在25 ℃(前期試驗(yàn)中發(fā)草種子最適溫度)、相對(duì)濕度80%、10 h 光照/14 h黑暗條件下進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，每隔24 h 依據(jù)初始培養(yǎng)皿重量補(bǔ)充適量蒸餾水。每日定時(shí)觀察種子發(fā)芽情況，種子胚根長(zhǎng)2 mm 視為發(fā)芽種子，直至3 d 內(nèi)未出現(xiàn)發(fā)芽種子。統(tǒng)計(jì)不同采集地發(fā)草種子發(fā)芽數(shù)量，計(jì)算發(fā)芽率(germination rate, GR)和發(fā)芽勢(shì)(germination energy, GE)。同時(shí)，從每皿內(nèi)隨機(jī)挑選5 株幼苗測(cè)量幼苗高度和胚根長(zhǎng)度。其中，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)計(jì)算公式如下：

1.3 種子萌發(fā)水勢(shì)模型

種子萌發(fā)速率與滲透勢(shì)主要參照Bradford[26]方法：

式中：θH指特定種子種群水勢(shì)常數(shù)(MPa·h)，Ψ指發(fā)芽試驗(yàn)中設(shè)定水勢(shì)，Ψb(g)指達(dá)到發(fā)芽分?jǐn)?shù)g時(shí)所需的基本水勢(shì)或臨界閾值，tg指達(dá)到發(fā)芽分?jǐn)?shù)g所需時(shí)間。同種種子種群Ψb(g)值呈正態(tài)分布，其中，中位數(shù)Ψb(50)、標(biāo)準(zhǔn)偏差σΨb被認(rèn)為是該種子種群的特征值，上述特征值可通過(guò)重復(fù)概率分析方程計(jì)算[26-27]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用單因素方差分析方法檢測(cè)不同滲透勢(shì)對(duì)同一采集地發(fā)草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、幼苗高度和胚根長(zhǎng)度的影響。其中，不同滲透勢(shì)為固定變量，種子發(fā)芽(發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì))和幼苗形態(tài)(幼苗高度和胚根長(zhǎng)度)特性為響應(yīng)變量。為滿足變量方差齊性和正態(tài)分布要求，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)采用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化，幼苗高度和胚根長(zhǎng)度采用反正弦轉(zhuǎn)化。所有數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0 進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 滲透脅迫對(duì)不同采集地發(fā)草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響

滲透脅迫顯著影響發(fā)草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)(表2)。水分充足環(huán)境中發(fā)草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)最高；而隨著滲透脅迫增加，發(fā)草種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)快速降低；其中，QH1、QH2、QH3 和SC1 種子在-0.8 MPa 滲透環(huán)境中發(fā)芽率為0，SC2 種子發(fā)芽率僅為5.13%。隨滲透脅迫增加至-1.0 MPa，SC2 種子發(fā)芽率為0；滲透脅迫增加至-0.6 MPa 時(shí)，不同采集地發(fā)草種子發(fā)芽勢(shì)均為0 (圖1)。不同采集地發(fā)草種子在相同滲透脅迫環(huán)境中發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)存在顯著差異(表2) (P＜ 0.05)，水分充足條件下各采集地發(fā)草發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)均表現(xiàn)為QH1 ＞ SC2 ＞QH2 ＞ QH3 ＞ SC1，輕度滲透脅迫(-0.2、-0.4 MPa)環(huán)境下QH1 和SC2 發(fā)草發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)較高，發(fā)芽率顯著高于QH2、QH3 和SC1 發(fā)草(P＜ 0.05)；重度滲透脅迫(≥ -0.6 MPa)環(huán)境下不同采集地發(fā)草發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)差異不顯著(P＞ 0.05)。

圖1 不同采集地發(fā)草種子在不同滲透脅迫條件下發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的變化Figure 1 Effects of different values of osmotic potential on seed germination rate and germination energy of Deschampsia caespitosa collected from five provenances

表2 不同滲透勢(shì)對(duì)同一采集地發(fā)草種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、幼苗高度和胚根長(zhǎng)度影響的單因素方差分析Table 2 One-way analysis of variance results for seed germination rate, seed germination energy, seedling height, and radicle length of Deschampsia caespitosa collected from five provenances under different values of osmotic potential

2.2 滲透脅迫對(duì)不同采集地發(fā)草幼苗高度和胚根長(zhǎng)度的影響

不同滲透脅迫顯著影響發(fā)草幼苗高度和胚根長(zhǎng)度(表2)。水分充足條件下，SC2 發(fā)草幼苗高度最高，而QH2 發(fā)草幼苗高度顯著低于其他采集地發(fā)草幼苗高度(圖2) (P＜ 0.05)；隨滲透脅迫增加，SC1、SC2 和QH1 發(fā)草幼苗高度快速降低，而QH2 和QH3 發(fā)草幼苗高度緩慢降低。在水分充足環(huán)境中SC2 胚根最長(zhǎng)，而QH3 胚根最短；隨滲透脅迫程度增加，SC2 發(fā)草胚根長(zhǎng)度快速變短；在輕度脅迫環(huán)境中(≤ -0.4 MPa) QH1、SC1 和SC2 胚根長(zhǎng)度顯著大于QH2 和QH3 (P＜ 0.05)，而滲透水勢(shì)超過(guò)-0.4 MPa 后胚根長(zhǎng)度快速降低且在-0.8 MPa 水勢(shì)條件下胚根長(zhǎng)度為0。

圖2 不同采集地發(fā)草種子在不同滲透脅迫條件下幼苗高度和胚根長(zhǎng)度變化Figure 2 Effects of different values of osmotic potential on seedling height and radicle length of Deschampsia caespitosa collected from five provenances

2.3 不同滲透勢(shì)條件下發(fā)草種子萌發(fā)進(jìn)程模型

低滲透勢(shì)條件下(≤-0.6 MPa)，水分?jǐn)M合模型能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)SC1、QH1、QH2 和QH3 發(fā)草種子萌發(fā)進(jìn)程(圖3)；而滲透勢(shì)低于-0.8 MPa 時(shí)，水分模型能準(zhǔn)確擬合SC2 種子萌發(fā)進(jìn)程。另外，SC2 和QH1 發(fā)草種子Ψb(50)較低，分別為-0.44 和-0.51 MPa；而SC1 發(fā)草種子Ψb(50)最高(-0.05 MPa) (表3)。

表3 基于水勢(shì)模型估計(jì)不同采集地發(fā)草種子萌發(fā)的基礎(chǔ)水勢(shì)Table 3 Seed germination parameters for response of Deschampsia caespitosa collected from five provenances to water potential based on hydrotime model analysis

圖3 不同采集地發(fā)草種子在不同滲透勢(shì)條件下預(yù)測(cè)(線)和實(shí)測(cè)(點(diǎn))萌發(fā)進(jìn)程模擬Figure 3 Predicted (line) and observed (dot) germination time course of the response of Deschampsia caespitosa collected from five provenances to water potential

3 討論

水分是影響植物種子萌發(fā)和幼苗定植的最關(guān)鍵非生物因素之一，也是決定植物種群穩(wěn)定和擴(kuò)張的內(nèi)部驅(qū)動(dòng)力[28-29]。大量研究結(jié)果表明，隨著水分脅迫加劇，種子萌發(fā)數(shù)量會(huì)持續(xù)降低；同時(shí)，幼苗生長(zhǎng)和根系發(fā)育也會(huì)被嚴(yán)重抑制，并最終造成植物種群存活率快速降低[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著水分脅迫程度增加，供試發(fā)草種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、幼苗高度和胚根長(zhǎng)度快速降低。尤其滲透脅迫大于-0.4 MPa 條件下，發(fā)草種子發(fā)芽特性和幼苗生長(zhǎng)被嚴(yán)重抑制；當(dāng)滲透脅迫超過(guò)-1.0 MPa 時(shí)，種子不能萌發(fā)。上述結(jié)果說(shuō)明發(fā)草種子對(duì)水分脅迫較為敏感，輕度干旱易造成種子休眠，而重度干旱易造成發(fā)草種子永久休眠。造成這種現(xiàn)象原因主要為：發(fā)草生境主要為高寒草原、林地、河邊和沼澤地帶，生境內(nèi)土壤含水量充盈是發(fā)草種子成功萌發(fā)的主要條件[12]。另外，發(fā)草植株在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段保持較高的水分利用效率和較低的蒸騰速率，而這一過(guò)程將延續(xù)至生殖生長(zhǎng)階段，水分可能是影響發(fā)草成功形成種子的關(guān)鍵影響因子[31]。然而，雷舒涵等[32]對(duì)甘肅天祝地區(qū)采集發(fā)草種子水分脅迫研究發(fā)現(xiàn)，隨水分脅迫程度增加，發(fā)草種子萌發(fā)率呈先增加后降低變化；造成這種差異原因主要與水分脅迫設(shè)定梯度相關(guān)，兩個(gè)研究中輕度水分脅迫PEG 濃度分別為-0.1 和-0.2 MPa，從而推測(cè)發(fā)草抗旱能力較弱。另外，張睿昕等[14]研究發(fā)現(xiàn)在遭遇干旱和高溫條件下，發(fā)草發(fā)芽率快速降低；徐秀麗[33]研究也發(fā)現(xiàn)濱發(fā)草(Deschampsia littoralis)在低溫條件下能保持較高發(fā)芽率。這也為發(fā)草主要分布在高寒草甸、沼澤地和林地，而干旱草原和荒漠地帶未曾出現(xiàn)發(fā)草種群提供直接證據(jù)。同時(shí)，上述研究也證實(shí)中低溫度和水分充足是發(fā)草種子萌發(fā)的最適條件。

植物生長(zhǎng)和種子形成環(huán)境對(duì)種子萌發(fā)能力存在調(diào)控作用[34]，其中，土壤水分含量可調(diào)控種子萌發(fā)和決定幼苗存活能力[35-36]。Evans 和Etherington[23]研究發(fā)現(xiàn)種子萌發(fā)特性與種子形成環(huán)境的土壤含水量密切相關(guān)，干旱環(huán)境成熟的植物種子在土壤水分虧缺條件保持較高發(fā)芽率；而濕潤(rùn)環(huán)境成熟的種子在土壤水分虧缺條件下不能發(fā)芽。Lima 和Meiado[37]研究也發(fā)現(xiàn)土壤水分含量對(duì)仙人掌(Pilosocereus catingicola)種子發(fā)芽特性具有顯著影響，表現(xiàn)為濕潤(rùn)環(huán)境中形成種子對(duì)干旱脅迫更為敏感；進(jìn)一步證明不同生境對(duì)種子萌發(fā)特性具有較強(qiáng)的可塑性[38-39]。本研究發(fā)現(xiàn)四川省和青海省采集5 份發(fā)草種子發(fā)芽率存在明顯差異(圖1)，根據(jù)左大康[40]按照年降水量對(duì)全國(guó)干濕地區(qū)的劃分標(biāo)準(zhǔn)(年降水量 ＜ 200 mm為干旱地區(qū)，200～400 mm 為半干旱地區(qū)，400～800 mm 為半濕潤(rùn)地區(qū)，年降水量 ＞ 800 mm 為濕潤(rùn)地區(qū))，本研究結(jié)果表現(xiàn)為濕潤(rùn)區(qū)SC1 (降水量860 mm)和干旱區(qū)QH3 (降水量150 mm)發(fā)草種子發(fā)芽率最低，而半濕潤(rùn)區(qū)(降水量均值586 mm)種子發(fā)芽率較高。這表明采集地降水量過(guò)高或干旱條件均能抑制發(fā)草種子萌發(fā)，說(shuō)明土壤含水量是發(fā)草種子萌發(fā)關(guān)鍵影響因素，而適度土壤含水量卻能加速種子萌發(fā)進(jìn)程。由此可見(jiàn)，不同生境對(duì)種子萌發(fā)特性具有一定可塑性，但對(duì)種子發(fā)芽能力調(diào)控能力表現(xiàn)出種間異質(zhì)性[23,41]。

眾多研究證明水勢(shì)模型可準(zhǔn)確預(yù)測(cè)植物種子萌發(fā)進(jìn)程，已成為不同水分脅迫下種子萌發(fā)進(jìn)程預(yù)測(cè)的經(jīng)典方法[42-43]?；诓煌置{迫梯度，水勢(shì)模型可預(yù)測(cè)種子萌發(fā)Ψb(50)、水勢(shì)時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)偏差等關(guān)鍵種子萌發(fā)指標(biāo)，進(jìn)而預(yù)測(cè)不同采集地植物種子萌發(fā)必備的基本參數(shù)值[26]。本研究也證明水勢(shì)模型能較好地模擬不同采集地發(fā)草種子發(fā)芽進(jìn)程，這一研究結(jié)果與其他植物種子利用水勢(shì)模型預(yù)測(cè)種子萌發(fā)過(guò)程一致[36,44]。不同水分脅迫下發(fā)草種子萌發(fā)形成水勢(shì)模擬進(jìn)程與不同水勢(shì)條件種子萌發(fā)率變化結(jié)果高度相似。例如，采集于SC2 和QH1 發(fā)草種子在不同水分脅迫條件下維持較高發(fā)芽率，而這與SC2 和QH1 發(fā)草種子具有較低的Ψb(50)和較短發(fā)芽周期結(jié)果相吻合；說(shuō)明SC2 和QH1 發(fā)草種子萌發(fā)對(duì)水分要求不高，輕度干旱條件下種子能成功萌發(fā)。同時(shí)，SC1 發(fā)草種子發(fā)芽Ψb(50)較高且發(fā)芽周期較長(zhǎng)也與SC1 在不同水分脅迫下發(fā)芽率較低結(jié)論一致，說(shuō)明SC1 發(fā)草種子萌發(fā)對(duì)水分要求較高，充足水分條件下種子能快速萌發(fā)，而干旱條件下種子將進(jìn)入生理休眠狀態(tài)貯存于土壤，形成長(zhǎng)久性種子庫(kù)。另外，本研究初步通過(guò)構(gòu)建水勢(shì)模型來(lái)預(yù)測(cè)不同水分脅迫對(duì)發(fā)草種子萌發(fā)進(jìn)程的影響，通過(guò)分析水勢(shì)模型相關(guān)參數(shù)來(lái)預(yù)測(cè)種子萌發(fā)進(jìn)程，進(jìn)而深刻解讀種子萌發(fā)過(guò)程中所涵蓋的生態(tài)學(xué)和生物學(xué)意義[3,45]。這將進(jìn)一步深刻理解水分在發(fā)草種子萌發(fā)過(guò)程的關(guān)鍵作用和揭示采集地生境在發(fā)草種子進(jìn)程調(diào)控及萌發(fā)特性的可塑性。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)不同采集地發(fā)草種子萌發(fā)對(duì)水分脅迫敏感性存在差異。其中，水澇(SC1)或干旱環(huán)境(QH3)不利于發(fā)草種子萌發(fā)，而降水量介于400～800 mm 半濕潤(rùn)環(huán)境(SC2、QH1 和QH2)是發(fā)草種子萌發(fā)的理想生境；這一研究結(jié)果為發(fā)草主要分布區(qū)為高寒林地、沼澤等濕生環(huán)境提供直接證據(jù)。同時(shí)，也證明水分是影響發(fā)草種子成功萌發(fā)和種群快速建植的關(guān)鍵限制因子。另外，水勢(shì)模型預(yù)測(cè)不同采集地發(fā)草的基礎(chǔ)水勢(shì)也將為利用發(fā)草對(duì)不同退化濕生草地開(kāi)展植被恢復(fù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。