權(quán)曉康， 陸宏園， 劉家豐， 丁焓赟， 宋博文， 劇佳華， 胡偉民*

(1.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310058； 2.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)試驗站，浙江 杭州 310058)

玉米是世界三大糧食作物之一，同時也是中國第一大糧食作物。雜草的影響是玉米生產(chǎn)和制種上必然存在同時危害較大的因素之一。一般在自然情況下，雜草會使玉米減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重的可達(dá)40%以上[1]。全球范圍內(nèi)主要通過使用除草劑來實現(xiàn)田間雜草的防除，但每年都有由于除草劑使用不當(dāng)而造成玉米減產(chǎn)的情況發(fā)生[2]。玉米是雜交優(yōu)勢明顯的作物，其親本自交系由于基因型相對純合，對生境的敏感度較大，生長勢一般劣于雜交種，其中又以甜、糯玉米自交系的敏感性更高，如果除草劑施用不當(dāng)，極易造成自交系幼苗黃化、根數(shù)減少或異常，特別是在干旱缺水的情況下影響更大，黃苗和死苗數(shù)明顯增加。因此，選擇合適的除草劑及正確的施用劑量和時間是當(dāng)前甜、糯玉米生產(chǎn)特別是制種上需要解決的問題，而目前有關(guān)除草劑對甜、糯玉米自交系種子萌發(fā)及出苗狀況影響的研究報道較少。

酰胺類、三氮苯類、硝基苯胺類除草劑是目前玉米田常用的3類除草劑，代表性單劑型除草劑分別為乙草胺、莠去津和二甲戊靈等，其作用機理和殺草譜有較大差異，并以此為基礎(chǔ)混配成了許多復(fù)劑，在生產(chǎn)上廣泛使用[3]。目前，一些商品化除草劑的作用機理還沒有被完全解釋，但是過去近40 a使用的除草劑中超過60%的化合物影響葉綠體的功能[4-5]。葉綠體中4個重要的除草劑靶標(biāo)部位在除草劑分子設(shè)計和抗除草劑農(nóng)作物育種基因工程中受到廣泛的重視，這4個重要的除草劑靶標(biāo)為光合色素及相關(guān)組分的合成和代謝、氨的代謝及氨基酸的生物合成、脂類的生物合成及光合電子傳遞系統(tǒng)[6-7]；此外，除草劑對植物細(xì)胞的細(xì)胞壁也有著較大的影響[8]。而選擇性除草劑殺死雜草的主要原因是利用形態(tài)學(xué)的不同(如苯氧乙酸類除草劑)或生理上的差異(如敵稗)，也可以利用時差(如除草劑5-氯酚鈉)和位差(如除草醚)來達(dá)到除去雜草的目的[9-10]。

本文選用玉米大田生產(chǎn)上播后苗前常用的乙草胺、莠去津和二甲戊靈等3類單一劑型除草劑，在糯玉米制種田進(jìn)行比較試驗，研究除草劑防除雜草的效果及對雜草生理生化等指標(biāo)的影響，從單劑型角度探究不同除草劑對雜草的抑制表現(xiàn)及雜草對除草劑的拮抗機制，同時分析除草劑對自交系種子出苗和幼苗生長的影響，為糯玉米制種和自交系繁種田除草劑的選用提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 參試糯玉米自交系及試驗用除草劑品種

1.1.1 參試糯玉米自交系

參試糯玉米制種親本為浙江大學(xué)選育的4個自交系，組合1：母本N27112，父本N67111；組合2：母本N329232，父本N203312。

1.1.2 供試除草劑

供試的除草劑為目前玉米大田生產(chǎn)上常用的播后苗前除草劑，分別為50%乙草胺、38%莠去津、0.33 g·mL-1二甲戊靈等3種除草劑，每667 m2噴施劑量分別為100 g、90 g和180 mL，以等量清水為對照(CK)。

1.2 玉米制種田種植及除草劑防效試驗

實驗田位于浙江大學(xué)紫金港校區(qū)農(nóng)業(yè)試驗站，田塊肥力均勻，地勢平坦。播種前對種植的田塊進(jìn)行人工除草，以避免田塊雜草的本底影響。除草劑的噴施濃度按每667 m2各類除草劑用量兌水45 L設(shè)定，以清水為對照。試驗采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，父母本行分別劃分小區(qū)，小區(qū)畦面寬0.9 m、長9 m，均勻單粒點播100粒種子，3次重復(fù)。2016年4月上旬選擇晴朗的天氣播種，播種后當(dāng)天土壤表面噴施除草劑，施藥時間為16：00后，施藥后覆蓋地膜以防雨天影響，5 d后除去地膜。同時，為了避免或減少其他化學(xué)物質(zhì)對試驗過程的干擾和影響，在種子萌發(fā)和幼苗生長過程中不噴施其他農(nóng)藥。播種后20 d，統(tǒng)計田間出苗情況，測量苗高。

1.3 田間雜草發(fā)生情況觀察及農(nóng)藝性狀統(tǒng)計

在噴施除草劑后，隨機截取小區(qū)中段3.6 m2進(jìn)行連續(xù)跟蹤觀察，觀察時間為噴藥后20、30和40 d，共3次；分別統(tǒng)計雜草的種類及數(shù)目。在40 d，統(tǒng)計不同處理小區(qū)均有存活的主要類型雜草的農(nóng)藝性狀，包括葉片數(shù)、高度、分枝數(shù)等。

1.4 光合作用及相對葉綠素含量的測定

使用SPAD-502葉綠素儀測定不同種類、不同處理雜草葉片的相對葉綠素含量；使用Li-6400光合作用測定儀(PAR=1 000 μmol·m-2·s-1，處理溫度20 ℃)測定雜草葉片凈光合速率。

1.5 還原型谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽硫-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的測定

1.5.1 GSH的含量測定

用硫酸緩沖液配制0.5 mg·mL-1GSH母液，分別取0、5、25、50、100、150、200、250 μL，各加入5%三氯乙酸(TCA)5 mL，分別向配好的系列標(biāo)準(zhǔn)液加入適量2-硝基苯甲酸(DTNB)顯色，20 ℃水浴5 min使其充分顯色，在412 nm下測定D值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[11]。

分別取樣品0.2 g，加入5 mL 5% TCA，在0～4 ℃下研磨，放入離心管中離心20 min(15 000g)，取部分離心后的上清液放入試管，加入pH 8.0磷酸緩沖液5 mL，再加入DTNB顯色，然后在412 nm下測定D值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得GSH濃度。

1.5.2 GST活性測定

參照郭玉蓮等[12]方法，分別取不同處理葉片各0.2 g，加入5 mL GST酶提取液及磷酸鉀緩沖液(pH 6.5)在0～4 ℃下研磨，15 000g離心20 min，上清液為待測酶液。

取2.5 mL 3.0 mmol·L-1GSH，加入0.05 mL上述待測酶液，最后加入0.45 mL溶于96%乙醇的CDNB，340 nm反應(yīng)5 min，通過計算機測定每分鐘光吸收的變化值，并通過以下公式計算GST活性。

GST活力(nmol·min-1)=(ΔD340V)/(εL)。式中ΔD340為每分鐘光吸收的變化值，V為酶促反應(yīng)體積(3.0 mL)，ε為產(chǎn)物的消光系數(shù)(0.009 6 L·μmol-1·cm-1)，L為比色杯的光程(1 cm)。

2 結(jié)果與分析

2.1 除草劑對糯玉米自交系種子田間出苗的影響

糯玉米自交系種子播后苗前噴施除草劑20 d，不同自交系對3個單劑型除草劑的敏感性存在較大差異。分析表1正常苗比例及株高等數(shù)據(jù)可以看出，乙草胺處理后，4個自交系正常苗比例均有明顯下降，除N27112外，其他3個自交系均顯著低于對照，其中N67111正常苗株高也顯著低于對照；與對照相比，莠去津處理后，除N67111正常苗比例有所增加外，其他3個自交系均有下降，但4個自交系的正常苗比例及株高均與對照無顯著差異；二甲戊靈處理后，4個自交系正常苗比例同樣有明顯下降，其中N27112顯著低于對照，而4個自交系的株高與對照均無顯著差異。

經(jīng)3種單劑型除草劑處理后，田間小區(qū)內(nèi)均有一定比例的畸形苗發(fā)生，其中乙草胺處理的畸形苗比例最高，4個自交系平均達(dá)到4.6%，除N329232外，其他3個自交系均顯著高于對照；其次為二甲戊靈處理，N27112和N67111小區(qū)畸形苗比例顯著高于對照，4個自交系平均為3.5%；而莠去津處理后，4個自交系畸形苗比例與對照相比均無顯著差異(表1)。

表1 不同除草劑處理對種子田間出苗的影響

此外，從藥劑噴施后玉米葉片顏色變化來看，莠去津處理后葉片色澤濃綠，幼苗長勢較好；其次為二甲戊靈處理，幼苗長勢一般；而乙草胺處理后玉米葉片顏色偏淡，幼苗長勢偏弱。綜上所述，莠去津處理對糯玉米自交系出苗及幼苗生長的影響相對較小。

2.2 除草劑處理對田間雜草種群密度的影響

試驗期間玉米田發(fā)現(xiàn)主要雜草類型有12種(表2)，以禾本科雜草和闊葉雜草為主，其中馬唐、牛筋草、天藍(lán)苜蓿和空心蓮子草等數(shù)量較多。

表2 制種田主要雜草種類

從表3可以看出，供試的乙草胺、莠去津和二甲戊靈等3種除草劑對雜草的防除效果明顯，均可減少雜草的種類和數(shù)量。與對照相比，3種除草劑處理后禾本科雜草數(shù)量均顯著減少，處理后20 d，禾本科雜草分別減少了61、49和59株·m-2；處理后40 d，禾本科雜草分別減少了152、153和153株·m-2。莠去津和二甲戊靈處理20 d后，闊葉雜草分別比對照減少了29和21株·m-2；40 d，分別減少了25和26 株·m-2，說明莠去津和二甲戊靈對2類雜草具有顯著的防除效果。而乙草胺對闊葉雜草的防除效果相對較差，處理后20 d和40 d，小區(qū)內(nèi)闊葉雜草數(shù)量與對照相比無顯著差異。此外，隨著時間的推移，對照小區(qū)內(nèi)禾本科雜草逐漸增加，而闊葉雜草數(shù)量不斷減少，可見禾本科雜草是本次試驗田間的優(yōu)勢雜草種類。

表3 田間不同類型雜草數(shù)量

表4統(tǒng)計了處理后田間5種主要雜草。所有處理均有空心蓮子草和碎米莎草的發(fā)生，說明空心蓮子草及碎米莎草對除草劑存在較好的抗性；另外，乙草胺處理的空心蓮子草株數(shù)顯著高于其他2個處理，因此，乙草胺在本次試驗中沒有防除空心蓮子草的效果。田間小區(qū)經(jīng)除草劑處理后，僅存在空心蓮子草及碎米莎草，因此，后續(xù)只針對這2種雜草進(jìn)行深入分析，以了解這2種雜草對除草劑的抗性機制。

表4 除草劑處理40 d后田間主要雜草種類及株數(shù)

2.3 除草劑處理對空心蓮子草和碎米莎草農(nóng)藝性狀的影響

田間小區(qū)經(jīng)莠去津與二甲戊靈處理后，空心蓮子草的一次枝梗分枝數(shù)、一次枝梗節(jié)點數(shù)、一次枝梗葉片數(shù)、一次枝梗長度均比對照顯著減少或縮短，表明這2種除草劑對空心蓮子草有較好的防除效果；而乙草胺處理與對照相比均無顯著差異，表明了乙草胺處理后對空心蓮子草的生長影響較小(表5)。

表5 不同處理小區(qū)空心蓮子草的生長情況

從表6可知，與對照相比，乙草胺能較好地抑制碎米莎草的葉齡和高度；莠去津能較好地抑制碎米莎草的高度，對碎米莎草的葉齡沒有顯著影響；二甲戊靈處理后，碎米莎草葉齡較大，但對其高度有顯著的抑制作用。

表6 不同處理小區(qū)碎米莎草的平均葉齡和高度

2.4 除草劑處理對雜草葉片光合作用及葉綠素含量的影響

2.4.1 除草劑處理對空心蓮子草光合作用的影響

與其他處理及對照相比，二甲戊靈處理后空心蓮子草凈光合速率顯著降低，說明二甲戊靈能一定程度上抑制空心蓮子草葉片的光合作用，從而影響空心蓮子草的生長；而乙草胺和莠去津處理與對照相比，凈光合效率沒有顯著差異(表5)。

2.4.2 除草劑處理對空心蓮子草和碎米莎草葉片葉綠素相對含量的影響

從表7可以看出，與其他2種除草劑相比，莠去津處理后空心蓮子草的葉綠素相對含量顯著降低，僅為20.90，比對照降低了22.40；同樣，碎米莎草的葉綠素相對含量也有明顯下降。因此，莠去津能抑制這2種雜草葉片葉綠素的合成，田間也可明顯地觀察到葉片黃化及紅化等現(xiàn)象，說明莠去津?qū)招纳徸硬蒿@著的防除效果可能與抑制葉片葉綠素合成有關(guān)。

表7 除草劑處理后空心蓮子草和碎米莎草葉片的葉綠素相對含量

2.5 除草劑處理對空心蓮子草和碎米莎草葉片GSH含量及GST活性的影響

從表8可以看出，與對照相比，乙草胺、莠去津和二甲戊靈處理后的空心蓮子草和碎米莎草葉片的GSH含量均有明顯下降，表明這3種除草劑均能有效地抑制GSH合成；其中莠去津和二甲戊靈處理的空心蓮子草和碎米莎草葉片GSH含量均顯著下降，抑制GSH合成作用較強；而乙草胺處理的空心蓮子草葉片GSH含量與對照相比雖有所下降，但無顯著差異。

3種除草劑處理后，空心蓮子草的GST活力與對照相比有所上升，但均無顯著差異；而3個處理的碎米莎草葉片GST活力顯著上升，表明在GST活性方面，碎米莎草對于除草劑的敏感性較強(表8)。

表8 除草劑處理后空心蓮子草和碎米莎草葉片GSH含量及GST活性

3 小結(jié)與討論

本研究表明，3個單劑型除草劑均會對糯玉米自交系的出苗和幼苗生長產(chǎn)生不同程度的影響，而不同自交系間的抗性也存在較大差異，因此，在制種和繁種時應(yīng)在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上謹(jǐn)慎選用。其中，莠去津處理對糯玉米自交系出苗及幼苗生長的影響相對較小，正常苗和畸形苗比例、株高等與對照相比均無顯著差異，處理后葉片色澤濃綠，幼苗長勢較好。

玉米田播后苗前噴施除草劑是一種主動性的保護(hù)措施，可以有效地減少苗期雜草危害，降低人工成本。從本次試驗結(jié)果來看，供試的乙草胺、莠去津和二甲戊靈等3種除草劑對雜草的防除效果顯著，均可減少雜草的種類和數(shù)量，并能抑制雜草的生長。其中，莠去津和二甲戊靈的防效持久性明顯優(yōu)于乙草胺，特別是乙草胺對空心蓮子草的防除效果較差。

為了從單劑型角度進(jìn)一步了解除草劑對雜草的防除機理及雜草對除草劑的拮抗機制，本試驗進(jìn)一步分析了各處理小區(qū)均存活的空心蓮子草和碎米莎草等2類雜草的農(nóng)藝性狀及相關(guān)生理生化指標(biāo)。結(jié)果表明，莠去津處理后，空心蓮子草葉片出現(xiàn)明顯的黃化和紅化現(xiàn)象，碎米莎草葉片同樣黃化明顯，特別是空心蓮子草葉片葉綠素含量相對顯著低于其他2種除草劑處理及對照，其除草機理可能與此有關(guān)。與對照相比，二甲戊靈處理能顯著降低空心蓮子草的光合速率，其除草機制可能與降低了葉片的光合作用有關(guān)。由于田間碎米莎草發(fā)生少，各處理小區(qū)樣本量較少，試驗結(jié)果可能會存在一定的誤差。

研究證實，雜草體內(nèi)除草劑作用位點發(fā)生改變、雜草代謝解毒能力增強、雜草的屏蔽作用或與作用位點的隔離作用是雜草對除草劑產(chǎn)生抗性的三大主要機制[13]。本試驗分析了2種雜草的GSH含量和GST活性，結(jié)果表明，與對照相比，3種除草劑處理后，空心蓮子草和碎米莎草葉片中GSH含量下降，GST活性明顯上升。推測3種除草劑處理能夠引起抗空心蓮子草和碎米莎草等雜草GST活性上升，而GST能誘導(dǎo)GSH與除草劑結(jié)合，從而完成除草劑在雜草體內(nèi)的降解代謝，這與前人研究結(jié)果一致[14-15]；同時也可能與GST-GSH偶聯(lián)參與除草劑解毒機制有關(guān)[16-18]。具體需要進(jìn)一步從分子水平探究，以解釋和確定其內(nèi)在的解毒機制。