陳曉龍， 應(yīng)多， 包斐， 方瑞秋

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 玉米與特色旱糧研究所，浙江 東陽 322100)

甜玉米作為普通玉米育種改良后的產(chǎn)物，不僅營養(yǎng)豐富，而且由于其果皮薄、口感脆甜、皮渣率低等特點(diǎn)，能克服普通玉米的很多缺點(diǎn)，起到改善人們膳食結(jié)構(gòu)的作用，因此，越來越被大眾所喜愛，然而大部分的甜玉米自交系并沒有詳細(xì)系譜記載，極大地影響了后續(xù)種質(zhì)改良及其雜交組合組配，使其育種效率大大降低[1]。玉米的生產(chǎn)模式是雜種優(yōu)勢利用[2]，借助這種模式可以顯著提高鮮食玉米的品質(zhì)以及產(chǎn)量，同時(shí)，不同雜種優(yōu)勢群之間雜交后代表現(xiàn)出的雜種優(yōu)勢存在一定差異[3]，因此，合理充分地利用甜玉米的雜種優(yōu)勢就需要對雜種優(yōu)勢群進(jìn)行準(zhǔn)確劃分并建立對應(yīng)的雜種優(yōu)勢模式[4]。

傳統(tǒng)的育種方式依靠田間農(nóng)業(yè)性狀調(diào)查結(jié)果，對實(shí)驗(yàn)的自交系類群進(jìn)行表型聚類分析，其結(jié)果與系譜圖比較存在一定誤差，其可靠性仍值得商榷。但DNA分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，為種質(zhì)資源遺傳多樣性研究提供了新的手段。其中SSR標(biāo)記由于基因組中分布廣泛、標(biāo)記無功能、標(biāo)記序列兩側(cè)順序較保守、共顯性遺傳以及DNA質(zhì)量要求低等特性，已逐漸被育種家們廣泛使用[5]。在SSR引物的開發(fā)上，楊珊等[6]利用20份自交材料的24個(gè)SSR引物篩選出了4個(gè)對玉米耐鹽堿性相關(guān)的SSR引物。李余良等[7]從玉米基因數(shù)據(jù)庫中開發(fā)了251對SSR引物，電泳檢測出12對關(guān)于雌穗發(fā)育差異的高多態(tài)性SSR引物。在SSR引物的應(yīng)用上，張微微等[8]利用篩選出的40對SSR核心引物對213份背景模糊的鮮食玉米進(jìn)行遺傳多樣性分析，將213份鮮食玉米品系劃分為3大類群，其結(jié)果與自交系譜系及來源相符。

本研究利用北京農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心研發(fā)的針對中國玉米種質(zhì)開發(fā)的40對SSR核心引物對50份浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米與特色旱糧研究所搜集的甜玉米自交系進(jìn)行遺傳多樣性分析，并依據(jù)結(jié)果進(jìn)行針對性地組合配對實(shí)驗(yàn)，為合理挑選優(yōu)良甜玉米自交系和選育新品種提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選用的50份甜玉米自交系都來自于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米與特色旱糧研究所且都是通過多代自交純化而來，遺傳性狀良好穩(wěn)定。

1.2 DNA的提取與檢測

分別取50份甜玉米自交系的籽粒10顆，在恒溫光照培養(yǎng)箱里恒溫培養(yǎng)，待生長至3葉期時(shí)，同一自交系混合取樣，液氮磨成粉末，采用CTAB法抽提DNA[9-10]，并通過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)進(jìn)行檢測。

1.3 40對SSR核心引物的合成與多態(tài)性統(tǒng)計(jì)分析

選用的SSR引物為北京農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心針對中國玉米種質(zhì)開發(fā)的40對核心SSR標(biāo)記[11-12]，引物名稱及序列見表1，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。通過提取的50份甜玉米自交系DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用8.0%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，180 V恒壓電泳1.5～4.0 h，并利用銀染顯色[13]。擴(kuò)增產(chǎn)物以“0、1、2”統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)庫，在相同遷移位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，數(shù)據(jù)缺失記為“2”。標(biāo)記位點(diǎn)的多態(tài)性信息量(PIC)按公式PIC=1-∑fi2計(jì)算，其中，fi表示某標(biāo)記位點(diǎn)第i等位基因的基因頻率[14]。利用軟件NTsys 2.10e處理數(shù)據(jù)，并按UPGMA(unweight pair group method arithmetic averages)方法進(jìn)行聚類分析。

表1 40對核心SSR標(biāo)記的引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記結(jié)果分析

近年來，SSR分子標(biāo)記技術(shù)在B73、Mo17等骨干玉米自交系基因組序列的公布下得到了廣泛的應(yīng)用[15]，截至目前，已有2 000多對玉米SSR引物發(fā)布于MaizeGDB，對所獲得的SSR引物用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，再利用聚丙烯酰胺凝膠電泳，將所擴(kuò)增出來的微衛(wèi)星片段進(jìn)行觀察比較，可清晰且高效地應(yīng)用于甜玉米自交系的遺傳多樣性分析。如表2所示，40對SSR核心標(biāo)記引物在50份甜玉米自交系材料中進(jìn)行擴(kuò)增，共檢測到228個(gè)等位基因變異，不同的SSR標(biāo)記檢測到的等位基因變異為3～13個(gè)，平均為5.65個(gè)。40對SSR標(biāo)記引物位點(diǎn)的PIC值變化范圍在0.32～0.89，平均為0.59，其中，以擴(kuò)增SSR引物umc1125y3、umc1492y13和umc1231k4為例(圖1)，在聚丙烯凝膠圖中發(fā)現(xiàn)該SSR標(biāo)記可以擴(kuò)增出清晰穩(wěn)定的多態(tài)性條帶。以上結(jié)果證明，實(shí)驗(yàn)的SSR標(biāo)記具有高度的變異性，可以較好地滿足本實(shí)驗(yàn)的要求。

表2 40對核心SSR引物的等位基因與多態(tài)性信息量

A、B、C分別代表引物umc1125y3、umc1492y13和umc1231k4對部分甜玉米自交系的擴(kuò)增。

2.2 50份甜玉米自交系的聚類劃分

現(xiàn)階段面臨的現(xiàn)狀是新品種的選育遺傳基礎(chǔ)狹窄，國內(nèi)外種質(zhì)資源未進(jìn)行有效整理和分類，極大地抑制了種質(zhì)的擴(kuò)增、改良與創(chuàng)新[16]。因此，在育種中將擬組配用的甜玉米自交系材料先進(jìn)行遺傳多樣性分析，再結(jié)合雜交優(yōu)勢原理組配雜交組合，有助于更高效地選育出優(yōu)良玉米品種。本研究利用NTsys 2.10e軟件計(jì)算出50份甜玉米自交系材料的遺傳相似系數(shù)，并通過UPGMA法進(jìn)行聚類分析。由表3可知，在相似系數(shù)為0.57時(shí)，可將以上50份甜玉米自交系材料劃分為6大類，分別是包含33個(gè)親本的第Ⅰ大類、4個(gè)親本的第Ⅱ大類、3個(gè)親本的第Ⅲ大類、4個(gè)親本的第Ⅳ大類、5個(gè)親本的第Ⅴ大類和1個(gè)親本的第Ⅵ大類。

表3 50份甜玉米自交系聚類分析結(jié)果

2.3 優(yōu)良甜玉米自交系的組合配對實(shí)驗(yàn)

研究現(xiàn)有不同種質(zhì)(品種)的遺傳多樣性，對深入剖析及挖掘優(yōu)異品種的基因組成和提高育種效率具有重要的理論和實(shí)踐意義[17-18]。通過前期對實(shí)驗(yàn)材料的表型鑒定，篩選出具有代表性的優(yōu)質(zhì)甜玉米自交系，并結(jié)合聚類劃分結(jié)果選擇親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的自交系進(jìn)行組合配對實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖2，以57和59的雜交組合為例，相比于父本和母本，雜交組合F1植株更加高大、強(qiáng)壯，果穗籽粒數(shù)量顯著增加且更加飽滿。由表4可知，參與實(shí)驗(yàn)的10組雜交組合F1在株高、穗位高、穗行數(shù)、行粒數(shù)、穗長、穗粗、莖粗等農(nóng)藝性狀上都表現(xiàn)良好。這些結(jié)果暗示著聚類劃分能更好地輔助育種人員進(jìn)行甜玉米自交系材料的選配，并結(jié)合雜種優(yōu)勢在甜玉米品質(zhì)、產(chǎn)量、抗性方面的提升作用，能更好地用于選育性狀優(yōu)良的甜玉米品種。

圖2 甜玉米自交系F1雜交后代農(nóng)藝性狀

表4 甜玉米自交系F1雜交后代性狀調(diào)查

3 小結(jié)與討論

3.1 甜玉米遺傳多樣性分析的意義

遺傳多樣性分析可以輔助育種家更全面地了解甜玉米種質(zhì)資源的遺傳背景，是選育優(yōu)良甜玉米品種的重要前提。甜玉米作為甜質(zhì)型玉米亞種，籽粒含糖量高、口感脆甜，富含維生素、游離氨基酸和礦物質(zhì)，是一種深受廣大消費(fèi)者青睞的玉米類型。然而，我國在甜玉米育種上還存在較多問題，例如種質(zhì)資源匱乏、耐熱和耐寒品種較少等[19]，極大地抑制了優(yōu)質(zhì)甜玉米品種的開發(fā)和應(yīng)用。持續(xù)引進(jìn)和鑒定出與當(dāng)前主導(dǎo)種質(zhì)遺傳距離較遠(yuǎn)的優(yōu)良新種質(zhì)，是拓展種質(zhì)基礎(chǔ)和創(chuàng)新種質(zhì)的重要渠道[20]。因此，本研究通過40對SSR分子標(biāo)記對50份甜玉米自交系分別進(jìn)行了擴(kuò)增，并依次利用電泳進(jìn)行基因分型，然后利用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，最終將50份甜玉米自交系材料劃分為6大類，較好地劃分了供試甜玉米自交系的遺傳背景。結(jié)合聚類劃分結(jié)果進(jìn)行優(yōu)良甜玉米自交系的組合配對實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)雜交F1農(nóng)藝性狀都表現(xiàn)良好，說明本研究的甜玉米遺傳多樣性分析可以快速對實(shí)驗(yàn)種質(zhì)資源進(jìn)行歸類，確定雜交種為基礎(chǔ)的自交系與父母本的遺傳距離遠(yuǎn)近，將調(diào)控優(yōu)良性狀的基因高效地進(jìn)行集合，對遺傳基礎(chǔ)方向的探索和途徑的拓展帶來極大的幫助。

3.2 SSR標(biāo)記技術(shù)的特點(diǎn)及其存在的問題

前人研究結(jié)果表明，群體遺傳多樣性與PIC值緊密相關(guān)，即群體的平均PIC值越高，DNA標(biāo)記位點(diǎn)變異程度越高，群體的遺傳多樣性就越豐富[21]，而PIC值的提高可以通過選擇更多的均勻分布在各個(gè)染色體上的SSR引物來實(shí)現(xiàn)[22]。在本研究中，40對SSR核心標(biāo)記引物均勻地分布在玉米的10條染色體上，在50份甜玉米自交系材料中共檢測到228個(gè)等位基因變異，不同的SSR標(biāo)記檢測到的等位基因變異為3～13個(gè)，平均為5.65個(gè)，40對SSR標(biāo)記引物位點(diǎn)的PIC值變化范圍在0.32～0.89，平均為0.59，PIC值較高，可以較好地揭示50份甜玉米自交系的遺傳差異。分子標(biāo)記的出現(xiàn)為遺傳多樣性分析提供了新的方法。隨著玉米基因組學(xué)的迅猛發(fā)展及分子育種實(shí)踐的持續(xù)深入，SSR標(biāo)記技術(shù)將會得到快速發(fā)展與改進(jìn)[23-25]。SSR標(biāo)記技術(shù)的深入應(yīng)用，方便了育種者從分子層次上揭示表型性狀與基因之間的關(guān)系。但是，SSR標(biāo)記所面臨的問題是開發(fā)新的SSR引物投入高、難度相對較大并且在構(gòu)建玉米高密度遺傳圖譜時(shí)需要引入其他的標(biāo)記技術(shù)。但未來隨著科學(xué)家們對SSR標(biāo)記技術(shù)運(yùn)用程度的逐步加深，SSR標(biāo)記技術(shù)面臨的難題將會被逐一攻破。