王雪婷，胡國(guó)紳，朱一鳴，沈偉健，丁濤，高玲，劉蕓

(南京海關(guān)動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，南京 210019)

氯丙醇酯和縮水甘油酯是植物油精煉過程中產(chǎn)生的新型污染物[1-7]，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)已將3-氯丙醇酯的水解產(chǎn)物3-氯丙醇和縮水甘油酯分別定義為人類2B類和人類2A類致癌物。由于棕櫚油、大豆油等精煉植物油在嬰幼兒配方乳粉中的廣泛使用，導(dǎo)致嬰幼兒配方乳粉中也存在一定程度的氯丙醇酯及縮水甘油酯污染。歐盟、中國(guó)臺(tái)灣先后對(duì)嬰幼兒配方乳粉中3-氯丙醇酯和縮水甘油酯進(jìn)行了設(shè)限，但目前我國(guó)尚未建立相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)。嬰幼兒配方乳粉基質(zhì)復(fù)雜，氯丙醇酯和縮水甘油酯在其中的含量較低，因此建立準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)方法顯得尤為重要。

目前，食品中氯丙醇酯和縮水甘油酯的分析前樣品處理主要有索氏萃取法、超聲萃取法、加速溶劑萃取法[8]等，測(cè)定方法主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[9-11](直接法)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[12-20](間接法)，其中間接法只需一種單一的酯類標(biāo)準(zhǔn)品就可測(cè)得氯丙醇酯及縮水甘油酯總量，因而更適合于日常檢測(cè)。已發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.191—2016(第三法)和SN/T 5220—2019 均采用堿性酯交換間接法，此法具有反應(yīng)時(shí)間快、檢驗(yàn)周期短的特點(diǎn)，但由于在堿性介質(zhì)中3-氯丙醇，2-氯丙醇和3-溴丙醇很容易發(fā)生副反應(yīng)生成游離態(tài)的縮水甘油，樣品中3-氯丙醇酯，2-氯丙醇酯和縮水甘油酯的測(cè)定結(jié)果往往偏低[21-23]。

筆者在樣品制備過程中采用酸性酯交換反應(yīng)，有效避免了副反應(yīng)的發(fā)生，通過優(yōu)化樣品提取條件、儀器分析條件，建立了一種前處理簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于嬰幼兒乳粉中氯丙醇酯和縮水甘油酯分析方法，該法可更好地滿足實(shí)驗(yàn)室日常檢測(cè)需要。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Aglient 7890B-5977A型，安捷倫科技(中國(guó))有限公司。

快速溶劑萃取儀：Dionex ASE 350 型，美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

超聲波振蕩器：KH-500SP 型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

恒溫水浴搖床：BS-06 型，韓國(guó)jeiotech 公司。

電子分析天平：(1)SQP Quintix224-1CN 型，感量為1 mg，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；(2)MSE125P-1CE-DU 型，感量為0.01 mg，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

渦旋混合器：WH-3 型，上海滬西分析儀器廠。氮吹儀：Auto Vap S60 型，美國(guó)ATR 公司。

3-氯-1，2-丙二醇棕櫚酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為99.6%，英國(guó)LGC 公司。

D5-3-氯-1，2-丙二醇棕櫚酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)品、2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))均為98%，加拿大TRC 公司。

D5-2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為98.2%，北京曼哈格生物科技有限公司。

棕櫚酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為98.0%，北京曼哈格生物科技有限公司。

D5-棕櫚酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))96%，加拿大TRC 公司。

正己烷、丙酮、甲醇、四氫呋喃、甲苯：色譜純，美國(guó)飛世爾科技公司。

溴化鈉、碳酸氫鈉、硫酸鈉、硫酸：優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

苯基硼酸：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為97%，上海源葉生物科技有限公司。

嬰幼兒配方乳粉樣品：市售。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 快速溶劑萃取儀

萃取試劑：正己烷；萃取溫度：100 ℃；萃取時(shí)間：8 min；循環(huán)萃取次數(shù)：2 次。

1.2.2 氣相色譜儀

色譜柱：DB-5MS 型毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，1 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；柱升溫程序：初始溫度為80 ℃，保持0.5 min，然后以20 ℃/min的速率升至180 ℃，保持0.5 min，再以5 ℃/min 的速率升至200 ℃，保持4 min，最后以40 ℃/min 的速率升至300 ℃，保持4 min；載氣：氦氣，流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：280℃；進(jìn)樣體積：1.0 μL。

1.2.3 質(zhì)譜儀

質(zhì)譜接口溫度：300 ℃；離子源溫度：280 ℃；離子化方式：EI；離子化能量：70 eV；測(cè)定方式：選擇離子掃描模式；溶劑延遲：6 min；6 種衍生物的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 6 種衍生物的質(zhì)譜參數(shù)

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

3-氯-1，2-丙二醇棕櫚酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1 mg/mL(以3-氯丙醇計(jì))，準(zhǔn)確稱取3-氯-1，2-丙二醇棕櫚酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)品53.14 mg 于10 mL 棕色容量瓶中，加入甲苯定容至標(biāo)線，搖勻。

2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1 mg/mL(以2-氯丙醇計(jì))，準(zhǔn)確稱取2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)品58.21 mg 于10 mL 棕色容量瓶中，加入甲苯定容至標(biāo)線，搖勻。

棕櫚酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1 mg/mL(以縮水甘油計(jì))，準(zhǔn)確稱取棕櫚酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品42.18 mg 于10 mL 棕色容量瓶中，加入甲苯定容至標(biāo)線，搖勻。

D5-3-氯-1，2-丙二醇棕櫚酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1 mg/mL(以D5-3-氯丙醇計(jì))，準(zhǔn)確稱取D5-3-氯-1，2-丙二醇棕櫚酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)品51.27 mg 于10 mL 棕色容量瓶中，加入甲苯定容至標(biāo)線，搖勻。

D5-2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1 mg/mL(以D5-2-氯丙醇計(jì))，準(zhǔn)確稱取D5-2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸雙酯標(biāo)準(zhǔn)品56.13 mg 于10 mL 棕色容量瓶中，加入甲苯定容至標(biāo)線，搖勻。

D5-棕櫚酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：1 mg/mL(以縮水甘油計(jì))，準(zhǔn)確稱取D5-棕櫚酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品40.15 mg 于10 mL 棕色容量瓶中，加入甲苯定容至標(biāo)線，搖勻。

氯丙醇酯和縮水甘油酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：各組分質(zhì)量濃度均為0.01 mg/mL，使用甲苯逐級(jí)稀釋3-氯-1，2-丙二醇棕櫚酸雙酯(以3-氯丙醇計(jì))標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸雙酯(以2-氯丙醇計(jì))標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和棕櫚酸縮水甘油酯(以縮水甘油計(jì))標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液得到。

內(nèi)標(biāo)混合液：各組分質(zhì)量濃度均為0.01 mg/mL，使用甲苯逐級(jí)稀釋D5-3-氯-1，2-丙二醇棕櫚酸雙酯(以3-氯丙醇計(jì))標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，D5-2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸雙酯(以2-氯丙醇計(jì))標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和D5-棕櫚酸縮水甘油酯(以縮水甘油計(jì))標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液得到。

氯丙醇酯和縮水甘油酯系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確移取氯丙醇酯和縮水甘油酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和內(nèi)標(biāo)工作溶液適量于7 個(gè)22 mL 提取池中，按1.4 步驟與試樣同時(shí)處理。得到質(zhì)量濃度均分別為0.01、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 和1.60 mg/L 的氯丙醇酯和縮水甘油酯系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度均為0.25 mg/L。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 樣品溶液制備

準(zhǔn)確稱取嬰幼兒配方乳粉樣品2 g(精確至0.001 g)，置于22 mL 提取池中，加入25 μL 混合內(nèi)標(biāo)工作液，進(jìn)入快速溶劑萃取儀提取。將接收液轉(zhuǎn)移至玻璃離心管中，于40 ℃水浴旋蒸至近5 mL，將濃縮液轉(zhuǎn)移至試管中，于40 ℃條件下，氮?dú)鉂饪s至近干，再加入2 mL 四氫呋喃，渦旋溶解，作為待反應(yīng)液。

向待反應(yīng)液中加入30 μL 酸性溴化鈉溶液[溴化鈉3 mg/mL，硫酸溶液(體積分?jǐn)?shù)為5%)]，旋緊蓋子，混勻后于50 ℃水浴中反應(yīng)15 min，加入3 mL 6 g/L碳酸氫鈉溶液終止反應(yīng)。隨后加入2 mL正己烷，渦旋靜置后，取上清液于另一干凈螺口玻璃試管中，于40 ℃氮吹至近干，加入1 mL 四氫呋喃溶解殘?jiān)?，隨后加入1.8 mL體積分?jǐn)?shù)為1.8%的硫酸甲醇溶液，混勻，旋緊瓶蓋，置于40 ℃恒溫水浴中反應(yīng)16 h。加入0.5 mL 飽和碳酸氫鈉溶液終止反應(yīng)，氮吹除去有機(jī)溶劑，向剩余溶液中依次加入2 mL 0.2 g/mL 硫酸鈉溶液、2 mL 正己烷，渦旋靜置分層后，棄去上層正己烷相，再用正己烷重復(fù)萃取凈化1 次。向下層凈化液中加入300 μL 0.25 g/mL 苯基硼酸溶液(溶劑為體積比為19∶1 的丙酮-水)，混勻，于室溫下超聲5 min。取出后，采用正己烷提取2 次，每次用2 mL 提取上層液至另一潔凈的玻璃試管中，于40℃氮?dú)獯抵两?，? mL 正己烷溶解殘?jiān)瑴u旋10 s，經(jīng)0.45 μm 尼龍微孔濾膜過濾后進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 定量方法

樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油酯的測(cè)定結(jié)果分別以3-氯丙醇、2-氯丙醇和縮水甘油計(jì)，用色譜峰面積內(nèi)標(biāo)法定量。根據(jù)各自的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線分別可得到試樣溶液中3-氯丙醇、2-氯丙醇和縮水甘油的質(zhì)量濃度，結(jié)合試樣溶液的定容體積和樣品的稱取質(zhì)量，計(jì)算得到樣品中3-氯丙醇酯、2-氯丙醇酯和縮水甘油酯的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 氣相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

因分析物與色譜柱固定相具有相似化學(xué)性質(zhì)時(shí)才會(huì)產(chǎn)生相互作用，故選取的3 種目標(biāo)化合物宜采用弱極性色譜柱進(jìn)行分析。將2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸雙酯、3-氯-1，2-丙二醇棕櫚酸雙酯及棕櫚酸縮水甘油酯用甲苯分別配制成50 μg/mL 的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，相應(yīng)的3 種內(nèi)標(biāo)物分別用甲苯配制成25 μg/mL 的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，3 種目標(biāo)化合物及其內(nèi)標(biāo)物經(jīng)過鹵化、凈化、衍生后，用全掃描方式進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)目標(biāo)化合物色譜保留時(shí)間優(yōu)化氣相色譜-質(zhì)譜的升溫程序，得到最優(yōu)的色譜-質(zhì)譜條件。在優(yōu)化條件下，3 種目標(biāo)化合物及其內(nèi)標(biāo)物的總離子流圖見圖1。由圖1 可見，3 種目標(biāo)化合物及其內(nèi)標(biāo)物實(shí)現(xiàn)了有效分離，可以分別定量。

圖1 3 種目標(biāo)化合物及其內(nèi)標(biāo)物總離子流色譜圖

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

采用快速溶劑萃取法對(duì)嬰兒配方奶粉中氯丙醇酯和縮水甘油酯進(jìn)行提取，用單因素實(shí)驗(yàn)分別優(yōu)化提取試劑(正己烷、二氯甲烷、甲苯)、提取時(shí)間(4、6、8、10、12 min)、提取溫度(50、100、150、200 ℃)及提取循環(huán)次數(shù)(1、2、3 次)。準(zhǔn)備待測(cè)樣品45 份，加入50 μL 內(nèi)標(biāo)混合液，在不同提取試劑、提取時(shí)間、提取溫度和提取循環(huán)次數(shù)下，按照1.3.1 方法處理，重復(fù)3 次取平均值，內(nèi)標(biāo)物的峰面積圖見圖2。

圖2 不同提取條件下內(nèi)標(biāo)化合物峰面積圖

由圖2 可知，甲苯提取效率最高，但甲苯對(duì)操作人員和環(huán)境危害大，本著實(shí)驗(yàn)試劑對(duì)人與環(huán)境最友好、樣品提取效率最大化、試劑使用量最小化的原則，最終選取正己烷作為提取試劑，100 ℃提取8 min，循環(huán)提取2 次。

2.3 線性方程與檢出限

在優(yōu)化的色譜條件下測(cè)定氯丙醇酯和縮水甘油酯系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物濃度比值(x)對(duì)目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，以3 倍信噪比計(jì)算檢出限，以10 倍信噪比計(jì)算定量限，目標(biāo)化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2。由表2 可知，嬰幼兒配方乳粉中2-氯丙醇酯、3-氯丙醇酯和縮水甘油酯在0.01～1.60 mg/L 范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢出限均為10 μg/kg，定量限均為25 μg/kg，表明該方法靈敏度較高。

表2 目標(biāo)化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4 加標(biāo)回收率與精密度

在嬰幼兒配方乳粉空白樣品中分別添加62.5、125、250 μg/kg 3 個(gè)水平的2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸雙酯、3-氯-1，2-丙二醇棕櫚酸雙酯和25、50、100 μg/kg 的棕櫚酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)水平平行測(cè)定6 次，試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3 可知，平均回收率為84.3%～103.0%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于6.0%，表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，滿足實(shí)際樣品測(cè)定需要。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 比對(duì)試驗(yàn)

在嬰幼兒配方乳粉中添加50 μg/kg 3-氯-1，2-丙二醇棕櫚酸雙酯、2-氯-1，3-丙二醇硬脂酸雙酯和棕櫚酸縮水甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品，分別采用SN/T 5220—2019 《出口食品中3-氯丙醇酯及縮水甘油酯的測(cè)定 氣相色譜-質(zhì)譜法》提供的超聲提取法和本法(快速溶劑萃取法)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4 可知，采用快速溶劑萃取法提取效率更高。

表4 比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

建立了快速溶劑萃取-酸性酯交換-氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中氯丙醇酯和縮水甘油酯的分析方法。采用改進(jìn)的樣品前處理方法及優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜條件后，可對(duì)嬰幼兒配方乳粉中2-氯丙醇酯、3-氯丙醇酯和縮水甘油酯同時(shí)進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析。該方法簡(jiǎn)單、高效、靈敏、準(zhǔn)確，可為嬰幼兒配方乳粉中2-氯丙醇酯、3-氯丙醇酯和縮水甘油酯污染水平的日常監(jiān)測(cè)提供技術(shù)支持。