林濤，李夢霞，郭瑾，陳靜，李茂萱，李彥剛，劉宏程

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，昆明 650205；2.云南工商管理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，昆明 650106；3.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，昆明 650205)

綠茶是中國的主產(chǎn)茶葉之一，具有抗氧化[1]、提高免疫力[2]、抗癌[3]、防輻射[4]、抗菌[5]等多種保健功效。近年來，健康保健食品日趨受到公眾青睞，綠茶消費量逐年上升。隨著綠茶需求量的增大，以往小規(guī)模的種植模式已遠遠不能滿足目前需求。隨著種植面積的擴大和產(chǎn)量的提高，化學(xué)農(nóng)藥在綠茶種植中的使用量也逐漸增大，綠茶中的部分農(nóng)藥殘留會對人體造成潛在的威脅[6-7]。

毒死蜱和唑蟲酰胺是兩種高效的殺蟲劑，在茶葉種植過程中使用較多，在綠茶產(chǎn)品中的檢出率也較高[8-9]。目前毒死蜱因其在蔬菜中超標(biāo)率較高且有中等毒性，在我國被禁止使用，而毒死蜱和唑蟲酰胺在茶葉中均可使用，但基于毒死蜱的中等毒性[10]和唑蟲酰胺對水生生物的強毒性[11]，我國食品中農(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(GB 2763—2021)[12]對茶葉中毒死蜱和唑蟲酰胺最大殘留限量進行了嚴格規(guī)定。

在GB 2763—2021 中，茶葉中毒死蜱的推薦測定方法為氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，唑蟲酰胺的推薦檢測方法為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。由于綠茶中的化學(xué)成分較多，基質(zhì)復(fù)雜，在農(nóng)藥測定過程中常出現(xiàn)較強的基質(zhì)效應(yīng)，導(dǎo)致綠茶中相關(guān)農(nóng)藥的準(zhǔn)確定量難度增大[13]。通常情況下，在樣品處理過程中，加入同位素內(nèi)標(biāo)可以減小基質(zhì)效應(yīng)[14]，但同位素內(nèi)標(biāo)通常價格較高且不常見；將提取液稀釋后測定也能在一定程度上降低基質(zhì)效應(yīng)，但是隨著稀釋倍數(shù)的增大，分析靈敏度隨之降低[15]。目前，較為有效的方法是在測定時，采用基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為質(zhì)量控制手段[16-17]，但是目前綠茶中毒死蜱和唑蟲酰胺的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制在國內(nèi)屬于空白?；诖?，筆者研制綠茶毒死蜱和唑蟲酰胺基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，為綠茶中農(nóng)藥含量測定、測定值溯源等提供技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：API4000 型，美國AB Sciex 公司。

超高效液相色譜儀：1290 型，美國安捷倫科技有限公司。

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 型，50 mm×1 mm，1.7 μm，美國Waters 公司。

氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀：7000D 型，美國安捷倫科技有限公司。

電子天平：XSR225DU/AC 型，感量為0.01 mg，梅特勒-托利多科技(中國)有限公司。

乙腈、乙酸乙酯、丙酮、甲醇：色譜純，德國默克公司。

無水MgSO4、乙酸鈉、NaCl、檸檬酸鈉二水合物、檸檬酸二鈉鹽倍半水合物：分析純，北京國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

乙酸、甲酸、乙酸銨：色譜純，迪馬科技（天津）有限公司。

陶瓷均質(zhì)子、ProElut C18、PSA、GCB 填料(Φ50 μm)：迪馬科技（天津）有限公司。

毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：100 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為GBW(E)082239，江蘇壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

唑蟲酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：100 μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為A17591500ME-100，德 國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

毒死蜱原藥：有效成分質(zhì)量分數(shù)為97%，批號為PD20121017，江蘇常隆農(nóng)化有限公司。

唑蟲酰胺原藥：有效成分質(zhì)量分數(shù)為98%，批號為PD20190042，山東海利爾化工有限公司。

實驗用水：純凈水，杭州娃哈哈公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠茶中毒死蜱、唑蟲酰胺基質(zhì)樣品的制備

選取健康的茶樹20 棵，將毒死蜱和唑蟲酰胺原藥用水稀釋后，按照有效成分質(zhì)量濃度為1 mg/L 進行噴灑，分別于采收前20 天和10 天各噴灑一次，采收鮮葉5 kg，按照綠茶的加工工藝，即經(jīng)過采青、萎凋、殺青、揉捻、干燥等步驟后制成成品茶，粉碎后過孔徑180 μm 篩(80 目)后，充分攪拌3 次以上使其混勻，即得。

1.2.2 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的分裝

采用50 mL 的HDPE 塑料小瓶進行分裝，每瓶分裝10 g，共分裝100 瓶，室溫下避光貯存。

1.2.3 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的均勻性檢驗

從分裝好的樣品中按照隨機取樣的原則抽取10 瓶，每瓶稱取3 份，每份2 g 進行測定，按照GB 23200.121—2021 中測定方法進行測定，測定結(jié)果用F檢驗進行均勻性檢驗。

1.2.4 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品短期穩(wěn)定性考察

將樣品分別置于4、20、40 ℃恒溫箱中(模擬運輸條件)保存，分別在第0、3、5、7、14 天進行監(jiān)測，每份樣品測定5 次，用測量平均值作為測定結(jié)果。用t檢驗對測量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.2.5 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品長期穩(wěn)定性考察

選取第0、1、3、6、12 個月取樣檢測。每次取兩瓶樣品，每個樣品稱取3 份，每份樣品測定5 次，以平均值為測定結(jié)果。用t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

1.2.6 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值

(1)定值方法。毒死蜱液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[19]定值；唑蟲酰胺分別采用文獻[19-20]樣品處理方法，利用氣相色譜-質(zhì)譜法[21]進行測定。

(2)實驗室聯(lián)合定值。選取代表性的相關(guān)檢測機構(gòu)8 家，采用標(biāo)準(zhǔn)方法[19]，分別對樣品中的毒死蜱和唑蟲酰胺的含量進行測定。隨機抽取24 瓶樣品，每個定值實驗室3 瓶，每瓶平行測定2 次。

2 結(jié)果與討論

2.1 均勻性檢驗結(jié)果

均勻性檢驗方法參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15000.3—2008[18]。利用F檢驗確定綠茶樣品的均勻性數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。綠茶中毒死蜱和唑蟲酰胺均勻性檢驗質(zhì)量分數(shù)及方差分析結(jié)果分別見表1、表2。

表1 綠茶中毒死蜱和唑蟲酰胺均勻性檢驗質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果 mg/kg

表2 綠茶中毒死蜱和唑蟲酰胺均勻性檢驗測定數(shù)據(jù)方差分析結(jié)果

由表2 可知，組間自由度υ1=9，組內(nèi)自由度υ2=20，查F界值表得F0.05(9，20)=2.39。經(jīng)計算，毒死蜱F=1.49，唑蟲酰胺F=1.22，F(xiàn)＜F0.05(9，20)，表明所制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品是均勻的。

2.2 短期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求[18]，按照1.2.4 方法進行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的短期穩(wěn)定性檢驗，并對檢驗數(shù)據(jù)進行t檢驗，毒死蜱和唑蟲酰胺含量測定值及統(tǒng)計結(jié)果分別見表3 和表4。由表4 可知，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品短期穩(wěn)定性良好。

表3 短期穩(wěn)定性檢驗質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果 mg/kg

表4 短期穩(wěn)定性檢驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果

2.3 長期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)[18]要求，按照1.2.5 方法進行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的長期穩(wěn)定性檢驗并對檢驗數(shù)據(jù)進行t檢驗，毒死蜱和唑蟲酰胺含量測定值及統(tǒng)計結(jié)果分別見表5、表6。由表6 可知，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品長期穩(wěn)定性良好。

表5 長期穩(wěn)定性檢驗質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果 mg/kg

表6 毒死蜱和唑蟲酰胺長期穩(wěn)定性檢驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果

2.4 定值結(jié)果

2.4.1 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品的定值結(jié)果

8 家實驗室對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品中毒死蜱和唑蟲酰胺的聯(lián)合定值結(jié)果見表7。

表7 毒死蜱和唑蟲酰胺聯(lián)合定值質(zhì)量分數(shù)測定結(jié)果 mg/kg

采用格拉布斯檢驗法對表7 測定結(jié)果進行檢驗，未發(fā)現(xiàn)異常值，測定結(jié)果呈正態(tài)分布，按照標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定進行結(jié)果計算[18]，毒死蜱和唑蟲酰胺聯(lián)合定值結(jié)果數(shù)據(jù)見表8。

表8 毒死蜱和唑蟲酰胺聯(lián)合定值結(jié)果

2.4.2 定值不確定度計算

使用的電子天平分辨率為0.000 01 g，最大允許誤差為0.000 10 g，按均勻分布，k= 3，儀器產(chǎn)生的不確定度：

依據(jù)測定結(jié)果，綠茶中毒死蜱的標(biāo)準(zhǔn)值為0.295 mg/kg，擴展不確定度為0.027 mg/kg(置信區(qū)間為95%，k=2)。

(2)唑蟲酰胺的定值不確定度。唑蟲酰胺均勻性檢驗的不確定度ubb=0.004 mg/kg，短期穩(wěn)定性檢驗引入的不確定度：

依據(jù)上述測定結(jié)果，綠茶中唑蟲酰胺的標(biāo)準(zhǔn)值為0.373 mg/kg，擴展不確定度為0.023 mg/kg(置信區(qū)間為95%，k=2)。

3 結(jié)語

研制了綠茶中毒死蜱和唑蟲酰胺基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其中毒死蜱的標(biāo)準(zhǔn)值為0.295 mg/kg，擴展不確定度為0.027，唑蟲酰胺的標(biāo)準(zhǔn)值為0.373 mg/kg，擴展不確定度為0.023(置信區(qū)間為95%，k=2)。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性較好，在4、20、40 ℃溫度下14 天內(nèi)短期穩(wěn)定性較好，室溫下12 個月的長期穩(wěn)定性較好，符合基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求。