劉鳳林，郭金雙，2，柴 謙，楊 陽(yáng)，孫秋艷

（1.山東省食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250022；2.中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所結(jié)構(gòu)化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002 ；3. 山東省菏澤市單縣中心醫(yī)院，山東 菏澤 274399）

胸苷激酶1（thymidine kinase 1, TK1）是細(xì)胞增殖周期中嘧啶補(bǔ)救合成途徑的關(guān)鍵酶之一，是一種新的細(xì)胞增殖特異性標(biāo)志物，可用于評(píng)估細(xì)胞分裂增殖周期，在腫瘤的早期篩查、腫瘤分期評(píng)估、治療效果監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)價(jià)中的作用日益受到關(guān)注[1-2]。TK1 水平檢測(cè)在乳腺癌、肺癌、胃癌等惡性實(shí)體瘤監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用價(jià)值較高[3-4]。作為一種優(yōu)選評(píng)估腫瘤細(xì)胞增殖速率的標(biāo)志物，TK1 在健康人血清中的含量極微或檢測(cè)不到，但其在惡性腫瘤患者體內(nèi)會(huì)隨著腫瘤細(xì)胞的急劇增殖而升高[5-7]。因此，建立一種高效靈敏、簡(jiǎn)便快捷的TK1 檢測(cè)方法具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。

化 學(xué) 發(fā) 光 免 疫 分 析( Chemiluminescence immunoassay，CLIA) 是將化學(xué)發(fā)光技術(shù)與免疫分析方法相結(jié)合的一種新型分析方法，其具有高靈敏度、強(qiáng)特異性、操作簡(jiǎn)便快捷等優(yōu)點(diǎn)，在多個(gè)檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[8-9]。目前，尚未有TK1 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)方法的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)使用TK1 抗體-磁微粒偶聯(lián)物結(jié)合并分離TK1 蛋白，TK1 配對(duì)抗體- 吖啶酯發(fā)光劑發(fā)光，建立了一種TK1 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，為TK1 的高靈敏度、強(qiáng)特異性、準(zhǔn)確檢測(cè)提供一種新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羧基磁微粒（貨號(hào)MS04C）購(gòu)自南京瑞貝西生物科技有限公司；TK1 抗體對(duì)（CABT-16288MH&CABT-L869） 購(gòu) 于 美 國(guó)Creative Diagnostics（CD）公司；重組人胸苷激酶1 抗原（8180-TK）購(gòu)自美國(guó)R&D 公司；吖啶酯（貨號(hào)A690047）購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；1- 乙基-（3- 二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，貨號(hào)22980）、N- 羥基磺基琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)儀購(gòu)自重慶科斯邁生物科技有限公司（型號(hào)：SMART500S）。發(fā)光底物（含激發(fā)液和預(yù)激發(fā)液，貨號(hào)：6E23-82 和6C55-82）購(gòu)自雅培公司。

1.2 抗TK1 包被抗體-磁微粒偶聯(lián)物的制備

羧基磁微粒采用EDC/sulfo-NHS 方法活化，然后與抗TK1 抗體偶聯(lián)。具體步驟為：將羧基磁微粒用磁微粒緩沖液（0.05 M 嗎啉磺酸，pH 6.0）洗滌3 次（200 μL/ 次），加入等量的EDC 和sulfo-NHS，37℃條件下振蕩活化25 min ；借助磁力架用磁微粒緩沖液洗滌2 次后（200 μL/ 次），加入抗TK1 抗體（用磁微粒緩沖液稀釋至0.5 mg/mL），抗體與磁珠的質(zhì)量比為1:10，室溫振蕩偶聯(lián)5 h。用封閉緩沖液（0.05 M Tris、0.5% 酪 蛋 白、0.05% Triton X-100、0.5%Proclin300）于37℃封閉磁微粒1.5 h 后，用磁微粒緩 沖 液 洗 滌2 次（200 μL/ 次）。將TK1 抗 體- 磁微粒偶聯(lián)物用磁微粒稀釋液（0.05 M Tris、1% 氯化鈉、2%BSA、4% 海藻糖、0.05% Triton X-100、0.5%Proclin300）稀釋至0.5 mg/mL（抗體濃度），儲(chǔ)存在4℃冰箱中。

1.3 抗TK1 標(biāo)記抗體-吖啶酯發(fā)光劑的制備

選擇TK1 配對(duì)抗體與吖啶酯偶聯(lián)，制備TK1 配對(duì)抗體- 吖啶酯發(fā)光劑。具體步驟：按照3:1 的質(zhì)量比，將TK1 配對(duì)抗體與吖啶酯混合，在37℃條件下振蕩反應(yīng)30 min，加入終濃度0.5% 賴氨酸終止反應(yīng)。用0.1 M PBS 進(jìn)行透析，以去除未結(jié)合的吖啶酯。經(jīng)Sephadex G50 凝膠層析純化后，收集具有高發(fā)光強(qiáng)度的產(chǎn)物。將純化的TK1 配對(duì)抗體-吖啶酯發(fā)光劑用發(fā)光物稀釋液（0.01 M PBS、1%氯化鈉、0.5%酪蛋白、4%海藻糖、0.05% Triton X-100、0.5% Proclin300）稀釋至0.05 mg/mL（抗體濃度），儲(chǔ)存于4℃冰箱中備用。

1.4 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)步驟

取50 μL TK1 抗體-磁微粒（20 μg/mL），加入50 μL 的TK1 標(biāo)準(zhǔn)品或血清樣本和100 μL TK1 配對(duì)抗體-吖啶酯發(fā)光劑，在37℃下溫育反應(yīng)20 min，用磁鐵吸引磁微粒及其磁微粒偶聯(lián)物至試管底部，使用洗滌緩沖液（PBS+0.05% Tween 20）輕輕洗滌試管以去除游離物質(zhì)。然后分別加入100 μL 的發(fā)光底物，檢測(cè)發(fā)光值。上述檢測(cè)步驟均在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀中全自動(dòng)化進(jìn)行，無(wú)需人工操作，發(fā)光值與樣本中的TK1濃度呈正相關(guān)。

1.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 本研究設(shè)計(jì)的TK1 檢測(cè)試劑盒溯源程序采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法，目前TK1 暫無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，故校準(zhǔn)品溯源到使用校準(zhǔn)品稀釋液（0.01 M PBS、2% 海藻糖、0.2% 酪蛋白、0.5% 組氨酸、0.5%Proclin300）稀釋TK1 抗原，通過(guò)溯源到對(duì)比試劑盒（已獲證發(fā)光試劑）一級(jí)校準(zhǔn)品，偏差控制在±10% 以內(nèi)。通過(guò)多次反復(fù)實(shí)驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制為：制備重組TK1蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的系列濃度（0 pmol/L、1.25 pmol/L、2.5 pmol/L、5 pmol/L、10 pmol/L、20 pmol/L、40 pmol/L），采用本方法檢測(cè)各標(biāo)曲濃度對(duì)應(yīng)的發(fā)光光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)濃度測(cè)定3 個(gè)復(fù)孔，采用雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型（Log-Logit）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合。

1.5.2 稀釋線性檢測(cè) 按照CLSI EP6-A2，將接近標(biāo)曲線性范圍上限的高值樣本稀釋不低于5 個(gè)梯度至接近該方法的線性下限，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定三次。用最小二乘法將測(cè)定的結(jié)果和對(duì)應(yīng)稀釋比例進(jìn)行線性擬合，并計(jì)算兩者之間的相互關(guān)系，得出線性相關(guān)系數(shù)R。

1.5.3 靈敏度評(píng)估 根據(jù)CLSI EP17-A2，準(zhǔn)備五份接近0 值的臨床樣本或健康人血清樣本，用本研究的試劑進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3 次，連續(xù)檢測(cè)4 d，得到所有樣本的發(fā)光均值和標(biāo)準(zhǔn)差；準(zhǔn)備五份濃度范圍在LoB 1 ～4 倍之間的血清樣本，每天檢測(cè)4 次，間隔超過(guò)2 h，每次檢測(cè)重復(fù)進(jìn)行3 次，共進(jìn)行5 d ；依據(jù)EP17-A2 文件的方法和公式進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，計(jì)算得到空白限（LoB）、檢測(cè)限（LoD）、功能靈敏度（FS）。

1.5.4 準(zhǔn)確度評(píng)估 根據(jù)EP09 文件對(duì)檢測(cè)試劑的加標(biāo)回收率進(jìn)行評(píng)估，方法是：將已知濃度的TK1 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品加入基質(zhì)血清中，且加入的高值樣本體積占比不超過(guò)總體積的10%，制備成加標(biāo)濃度的血清樣本，使用本方法重復(fù)檢測(cè)3 次，計(jì)算高濃度樣本、加標(biāo)濃度樣本和基質(zhì)濃度樣本這3 個(gè)樣本的測(cè)定平均值、SD、變異系數(shù)（CV）、加標(biāo)回收率，以評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確度和重復(fù)性。根據(jù)公式〔加標(biāo)回收率=（測(cè)定濃度-基質(zhì)濃度）/ 加標(biāo)濃度×100%）〕計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.5.5 精密度（重復(fù)性）評(píng)估 采用TK1 的試劑，按照CLSI EP05-A3，檢測(cè)高、中、低三個(gè)濃度水平的TK1 校準(zhǔn)品，不同濃度標(biāo)本每天上午和下午各檢測(cè)2次，每次檢測(cè)重復(fù)進(jìn)行2 次，兩次檢測(cè)的時(shí)間間隔不低于2 h，連續(xù)測(cè)定20 d，分別計(jì)算各濃度樣本的分析內(nèi)精密度、分析間精密度及總不精密度。

1.6 干擾實(shí)驗(yàn)

本次評(píng)估采用了三種常見的血清干擾物質(zhì)，分別是血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素，將一定濃度的干擾物分別加入高濃度TK1 和低濃度TK1 的血清待測(cè)樣本中，設(shè)為干擾物質(zhì)樣本，加入的干擾物的體積不超過(guò)總體積的5%，對(duì)照組同時(shí)添加相同體積的PBS 作為對(duì)照樣本，然后對(duì)兩組樣本分別進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)濃度檢測(cè)3 次，并根據(jù)公式〔干擾率=（干擾物質(zhì)樣本的測(cè)定濃度- 對(duì)照組樣本的測(cè)定濃度）/ 對(duì)照組樣本的測(cè)定濃度×100%〕計(jì)算得到干擾率。

1.7 特異性評(píng)估

用本方法同時(shí)檢測(cè)TK1 標(biāo)準(zhǔn)品（30 pmol/L）、人血清白蛋白（100 ng/mL）、纖維蛋白原（100 ng/mL）、癌胚抗原（CEA）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α），以評(píng)估本方法的特異性。上述幾個(gè)蛋白均為人血清中常見的蛋白。

1.8 穩(wěn)定性評(píng)估

將制備的試劑盒置于37℃下7 d，進(jìn)行加速穩(wěn)定性試驗(yàn)。觀察試劑盒的物理外觀，對(duì)其檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、特異性等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，以評(píng)估該檢測(cè)方法的穩(wěn)定性。靈敏度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、特異性檢測(cè)方法同上。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果以mean±SD 表示，采用GraphPad Prism 5 軟件計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

2 結(jié)果

2.1 方法建立的條件優(yōu)化

采用單因素測(cè)試及多因素交叉測(cè)試篩選得到了最優(yōu)的抗體對(duì)、重組抗原、磁珠與抗體最優(yōu)標(biāo)記比例、吖啶酯與抗體最優(yōu)標(biāo)記比例、基礎(chǔ)緩沖液、校準(zhǔn)品、反應(yīng)體系以及篩選不同需求對(duì)應(yīng)的血清樣本。反復(fù)優(yōu)化及驗(yàn)證得到的反應(yīng)體系是：樣本上樣量50 μL，磁珠標(biāo)記抗體上樣量50 μL，吖啶酯標(biāo)記抗體上樣量100 μL；反應(yīng)步驟為一步法，反應(yīng)時(shí)間為20 min；相應(yīng)最優(yōu)緩沖液配方為：磁微粒稀釋液：0.05 M Tris、1% 氯化鈉、2%BSA、4% 海藻糖、0.05% Triton X-100、0.5%Proclin300 ；發(fā)光物稀釋液：0.01 M PBS、1% 氯化鈉、0.5% 酪蛋白、4% 海藻糖、0.05% Triton X-100、0.5% Proclin300 ；校準(zhǔn)品或質(zhì)控品稀釋液：0.01 M PBS、2% 海藻糖、0.2% 酪蛋白、0.5% 組氨酸、0.5%Proclin300。

2.2 方法學(xué)性能評(píng)估

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以TK1 標(biāo)準(zhǔn)品系列濃度的Log10 值為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)的化學(xué)發(fā)光值的Log10 值為縱坐標(biāo)，建立四參數(shù)擬合數(shù)學(xué)模型，其擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=（6.77662-3.45135）/ ﹝ 1+（X/1.63798)(-1.37946）﹞ +3.45135，R=0.99869，如圖1 所示。TK1 濃度在1.25 ～40 pmol/L 范圍內(nèi)時(shí)，本檢測(cè)方法具有良好的劑量-反應(yīng)效應(yīng)。

圖1 TK1 的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 線性范圍評(píng)估 將45 pmol/L（接近線性上限）濃度水平的血清樣本逐級(jí)稀釋至接近線性下限的濃度1.4 pmol/L，對(duì)所得三次結(jié)果取均值，并與理論值以最小二乘法進(jìn)行線性擬合，得出對(duì)應(yīng)的線性相關(guān)系數(shù)R（如表1 結(jié)果所示）。在1.5 ～45 pmol/L 范圍內(nèi)，得出相關(guān)系數(shù)R 為0.997（不低于0.9900），故本研究建立的方法設(shè)定的線性范圍1.25 ～40 pmol/L 是符合要求的。

表1 TK1 稀釋線性檢測(cè)數(shù)據(jù)（pmol/L）

2.2.3 靈敏度評(píng)估 依據(jù)CLSI EP17-A2 的要求，本方法的靈敏度測(cè)試評(píng)估的結(jié)果為：LOB 0.70 pmol/L；LOD 1.02 pmol/L；FS 1.50 pmol/L。

2.2.4 準(zhǔn)確度評(píng)估 在線性范圍內(nèi)，選擇高、中、低5個(gè)濃度系列的血清樣本，用較低含量的陰性血清作為基質(zhì)濃度，按照比例1:9 進(jìn)行稀釋，制備成加標(biāo)回收樣品，回收率在90% ～110% 視為符合要求。如表2所示，五個(gè)濃度覆蓋從低到高的濃度，數(shù)據(jù)顯示：加標(biāo)回收率在99.24%～106.91%之間，均在10%以內(nèi)，說(shuō)明該TK1 磁微粒化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清樣本中TK1的濃度具有較高的準(zhǔn)確度。

表2 TK1 磁微粒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑加標(biāo)回收率檢測(cè)結(jié)果

2.2.5 精密度評(píng)估 根據(jù)CLSI EP05-A3 文件，對(duì)高濃度水平、中濃度水平和低濃度水平的三個(gè)標(biāo)本的各80份檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（結(jié)果如表3 所示）。三個(gè)濃度水平的分析內(nèi)精密度在1.02% ～2.82% 范圍內(nèi)，分析間精密度在3.12% ～5.35% 范圍內(nèi)，總不精密度在6.30% ～8.12% 范圍內(nèi)?？梢?，分析內(nèi)和分析間精密度均低于6%，總不精密度低于9%。

表3 TK1 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光試劑精密度測(cè)試結(jié)果分析

2.3 干擾實(shí)驗(yàn)

分別將不同濃度的膽紅素、甘油三酯、血紅蛋白加入2 份待測(cè)標(biāo)本中作為干擾標(biāo)本，同時(shí)以添加相同體積的體系緩沖液作為基礎(chǔ)標(biāo)本，根據(jù)公式計(jì)算得到干擾率，根據(jù)表4 的結(jié)果分析可以看出，三種干擾物質(zhì)（膽紅素、甘油三酯和血紅蛋白）在不同濃度情況下對(duì)高濃度TK1 水平和低濃度TK1 水平兩份樣本影響效果不一致，膽紅素、甘油三酯、血紅蛋白濃度分別不高于30 Umol/L、1.5 mmol/L、2.5 g/L 時(shí)，各濃度干擾率均不超過(guò)10%，即干擾物在上述三個(gè)濃度的情況下，未見明顯干擾。

表4 干擾試劑對(duì)TK1 磁微粒化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)影響的測(cè)試結(jié)果

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

用本方法制備的試劑盒重復(fù)檢測(cè)30 pmol/L TK1 標(biāo)準(zhǔn)品3 次，得到的平均濃度為31.54 pmol/L；人血清白蛋白、纖維蛋白原、CEA、IL-6 和TNF-α 的檢測(cè)值分別為1.49 pmol/L、1.31 pmol/L、1.20 pmol/L，1.45 pmol/L和1.14 pmol/L，交叉反應(yīng)率均不大于2%，如表5 所示，表明該檢測(cè)方法對(duì)TK1 檢測(cè)的特異性較好。

表5 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將本方法制備的試劑盒置于37 ℃下7 d，進(jìn)行加速熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。7 d 后，使用TK1 標(biāo)準(zhǔn)品、基質(zhì)血清等進(jìn)行靈敏度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性和特異性等檢測(cè)，靈敏度、加標(biāo)回收率、批內(nèi)CV、批間CV 和交叉反應(yīng)率均未有顯著性改變，表明該方法制備的試劑盒穩(wěn)定性較好，可長(zhǎng)期保存使用。

3 討論

化學(xué)發(fā)光作為一種檢測(cè)技術(shù)經(jīng)歷了不斷的演變。傳統(tǒng)的化學(xué)發(fā)光免疫分析方法雖然能夠滿足一般需求，但是對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜或濃度極低的樣本，存在著特異性不足、背景干擾、檢測(cè)靈敏度不夠等問題。因此，降低背景干擾值、提高檢測(cè)靈敏度和特異性一直是眾多實(shí)驗(yàn)室研究的重點(diǎn)[10]。近幾年，基于磁性微粒子及金納米粒子的化學(xué)發(fā)光免疫分析的研究越來(lái)越多，在快速分離與高靈敏度上有了很大的突破[11-12]。本方法選擇磁微粒作為反應(yīng)載體，實(shí)現(xiàn)了降低背景干擾、增強(qiáng)檢測(cè)靈敏度的目的。本TK1 化學(xué)發(fā)光免疫反應(yīng)的原理：將TK1 抗體偶聯(lián)在磁微粒表面，在待測(cè)抗原與固定在磁微粒表面上的抗體發(fā)生免疫反應(yīng)后，在外加磁場(chǎng)的作用下免疫復(fù)合物被分離出來(lái)，然后加入發(fā)光底物TK1 配對(duì)抗體- 吖啶脂發(fā)光劑，通過(guò)檢測(cè)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)弱來(lái)計(jì)算TK1 的濃度。磁微粒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法已有文獻(xiàn)報(bào)告。鄭國(guó)金等[13]建立了一種管式磁性微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定人尿液中的雌三醇的方法，該方法具有很高的靈敏度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。葉春蕾等[14]建立了一種基于微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析的人血清脂聯(lián)素檢測(cè)方法。多種磁微粒化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法的建立，說(shuō)明了此方法在基質(zhì)復(fù)雜的血清樣本檢測(cè)中具有明顯優(yōu)勢(shì)，發(fā)展前景較好。

TK1 是細(xì)胞增殖周期依賴性標(biāo)志物，定位于染色體17q23.2 q25 上，其活性在G1/S 期增加，在S 期/G2 期達(dá)到峰值，在G2/ 有絲分裂期開始下降，在處于非有絲分裂期的細(xì)胞中幾乎不存在[1,15]。在過(guò)度無(wú)序增殖的惡性腫瘤細(xì)胞中，TK1 水平極高并大量釋放到血液中。因此，組織或血清中TK1 的活性或含量可直觀地反映細(xì)胞的增殖水平。研究發(fā)現(xiàn)，TK1 在血液中比較穩(wěn)定，在-20℃以下環(huán)境中可穩(wěn)定保存5 年以上，檢測(cè)血清中TK1 活性/ 含量可準(zhǔn)確地反映其在細(xì)胞中的真實(shí)水平[16-18]。TK1 臨床檢測(cè)的演變經(jīng)歷了一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。上世紀(jì)80 年代，血清TK1 活性檢測(cè)方法被建立，主要用于白血病、霍奇金/ 非霍奇金淋巴瘤的治療評(píng)價(jià)和預(yù)后監(jiān)測(cè)。但有研究發(fā)現(xiàn)，TK1 活性檢測(cè)并不適用于實(shí)體瘤患者的監(jiān)測(cè)評(píng)估，僅對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤的評(píng)估效果較好[19]。后來(lái)，血清TK1 水平的檢測(cè)得到了醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。有研究發(fā)現(xiàn)，不僅在血液系統(tǒng)腫瘤（白血病、淋巴癌等）的評(píng)估中，在實(shí)體瘤如乳腺癌、胃癌、肺癌等監(jiān)測(cè)評(píng)估方面，TK1 水平檢測(cè)均明顯優(yōu)于其活性的檢測(cè)，這個(gè)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)大大促進(jìn)了血清TK1 水平檢測(cè)的發(fā)展，提高了TK1 檢測(cè)方法研究的熱度[3,4,20]。目前，免疫印跡增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法廣泛應(yīng)用于臨床血清TK1 水平的測(cè)定，其具有高靈敏度、高特異性等優(yōu)勢(shì)。隨著磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法在臨床血清樣本檢測(cè)中獲得廣泛認(rèn)可，將這種新型的檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于血清TK1 水平的檢測(cè)中引起了本文研究者的興趣。

本研究建立了一種管式磁性微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析法，用來(lái)測(cè)定人血清中TK1 的水平，通過(guò)分別制備TK1 抗體- 磁微粒偶聯(lián)物和TK1 配對(duì)抗體- 吖啶脂偶聯(lián)物，建立了定量檢測(cè)TK1 的新方法。該方法對(duì)血清中TK1 的檢測(cè)靈敏度為：LOB 0.70 pmol/L；LOD 1.02 pmol/L；FS 1.50 pmol/L，線性范圍為1.25 ～40 pmol/L，可以滿足臨床樣本中對(duì)TK1 的定量檢測(cè)需要，無(wú)須稀釋；加標(biāo)回收率為99.24% ～106.91%，在-10% ～10% 范圍內(nèi)，符合要求；方法精密度：分析內(nèi)精密度為1.02% ～2.82%，分析間精密度為3.12% ～5.35%，總不精密度為6.30% ～8.12%，分析內(nèi)和分析間精密度均低于6%，總不精密度低于9%。樣本中三種干擾物在膽紅素、甘油三酯、血紅蛋白濃度 分 別 不 高 于30 Umol/L、1.5 mmol/L、2.5 g/L 時(shí)，干擾率均低于10%，未見明顯干擾，基本不影響檢測(cè)結(jié)果。該檢測(cè)方法的特異性較好（與血清中常見蛋白的交叉反應(yīng)率均低于2%），試劑在37℃下可穩(wěn)定保存7 d 以上（等同于4℃下可穩(wěn)定保存12 個(gè)月以上）。對(duì)該檢測(cè)試劑的靈敏度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、特異性、穩(wěn)定性等性能進(jìn)行評(píng)價(jià)可知，其可滿足臨床對(duì)血清TK1 水平檢測(cè)的需求。

綜上所述，TK1 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)作為一種全自動(dòng)快速的檢測(cè)方法，具有高靈敏度、高準(zhǔn)確度、高精密度、強(qiáng)特異性、強(qiáng)穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，可為臨床TK1水平的檢測(cè)提供一種新的技術(shù)手段，在惡性腫瘤的早期診斷、療效評(píng)估以及預(yù)后監(jiān)控等方面可發(fā)揮重要的作用。