■張振東 劉 婷 范慧玉 張建軍 徐建風(fēng) 沈振峰 張 帆 鄭 琛

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

單寧是植物次生代謝過程中產(chǎn)生的多種酚類化合物，根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)分為縮合單寧和水解單寧[1]。高濃度的單寧在動(dòng)物口腔內(nèi)與唾液蛋白發(fā)生互作，引起口腔黏膜粗糙褶皺的干燥感，苦澀的味道，引起口腔內(nèi)組織的收斂性增加，降低飼料的適口性。單寧酸也稱鞣酸，是單寧代謝過程中的次級產(chǎn)物，且單寧酸分子內(nèi)的酯鍵能與蛋白質(zhì)、多糖和金屬離子結(jié)合降低養(yǎng)分的消化率[2]，但對于反芻動(dòng)物而言，適量的單寧酸能夠保護(hù)瘤胃蛋白質(zhì)，增加過瘤胃蛋白質(zhì)含量。目前對于反芻動(dòng)物飼糧中添加單寧酸的研究主要集中在提高飼料效率、影響瘤胃微生物菌群活性、減少瘤胃甲烷排放和增加十二指腸微生物蛋白和氨基酸流通率等問題上[3-7]，但對于飼糧添加單寧酸對綿羊瘤胃發(fā)酵過程的動(dòng)態(tài)變化卻鮮有報(bào)道?；诖耍囼?yàn)旨在研究飼糧中添加2%的單寧酸對湖羊血清抗氧化指標(biāo)、瘤胃pH和發(fā)酵參數(shù)動(dòng)態(tài)變化的影響，探討單寧酸對湖羊瘤胃發(fā)酵功能的調(diào)控作用，為單寧酸在反芻動(dòng)物中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及動(dòng)物

本試驗(yàn)采用交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇6只安裝永久瘺管的湖羊，隨機(jī)分成對照組（基礎(chǔ)日糧）和單寧酸組（基礎(chǔ)日糧+2%單寧酸），每組3 只羊。試驗(yàn)分為2 期進(jìn)行，每期15 d。

1.2 試驗(yàn)飼糧

參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 816—2004）配制單寧酸組和對照組的顆粒飼糧，飼糧組成及其營養(yǎng)水平見表1。所用飼糧均由甘肅潤牧生物工程有限責(zé)任公司生產(chǎn)加工。營養(yǎng)水平中除了消化能其余均為實(shí)測值，粗蛋白的測定采用凱氏定氮法，試驗(yàn)儀器包括粉碎機(jī)、分析天平、凱氏定氮儀、40目篩、電爐等；粗脂肪含量的測定采用索氏抽提法，試驗(yàn)儀器有索氏提取器、脫脂濾紙等；鈣含量的測定采用高錳酸鉀滴定法，磷含量的測定采用鉬黃比色法，試驗(yàn)儀器有分析天平、錐形瓶、滴定管、比色皿、分光光度計(jì)；酸性洗滌纖維（ADF）和中性洗滌纖維（NDF）的測定采用十二烷基硫酸鈉溶液（中性洗滌劑）和十二烷基三甲基溴化銨（酸性洗滌劑），試驗(yàn)儀器有電爐、錐形瓶等。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)開始前，對羊舍進(jìn)行全面消毒，并對所有羊進(jìn)行布魯氏桿菌檢測。試驗(yàn)期間所有羊只單籠飼養(yǎng)，每天在8：00和17：00分別飼喂一次，自由飲水和采食。過渡期試驗(yàn)開始時(shí)將6只瘺管羊隨機(jī)分成對照組和單寧酸組，每組3只，按相應(yīng)分組飼喂不同飼糧10 d，然后進(jìn)入正試期，進(jìn)行瘤胃動(dòng)態(tài)pH和樣品采集。

1.4 試驗(yàn)樣品采集

1.4.1 瘤胃動(dòng)態(tài)pH數(shù)據(jù)采集

參考胡紅蓮等[8]的方法測定瘤胃動(dòng)態(tài)pH。在正試期前2 d，采用動(dòng)態(tài)pH 監(jiān)測系統(tǒng)對試驗(yàn)羊瘤胃pH進(jìn)行24 h 動(dòng)態(tài)監(jiān)測。在每次進(jìn)行動(dòng)態(tài)pH 連續(xù)監(jiān)測時(shí)，用pH 4.00 和pH 6.86 標(biāo)準(zhǔn)液對電極進(jìn)行校準(zhǔn)，并記錄校準(zhǔn)值。待電極校準(zhǔn)完畢后，將電極通過瘤胃瘺管插入瘤胃內(nèi)，然后塞好塞子。電極通過導(dǎo)線與瘺管外的pH變送器信號輸入端相連，pH變送器的信號輸出端與記錄儀的信號輸入端相連接。本試驗(yàn)用3 個(gè)通道進(jìn)行實(shí)時(shí)顯示，每期6 只試驗(yàn)羊的pH 動(dòng)態(tài)變化分2 d完成，并設(shè)定每隔1 min記錄1次pH，選擇其中穩(wěn)定的一天進(jìn)行后續(xù)動(dòng)態(tài)pH的數(shù)據(jù)分析。

1.4.2 瘤胃液樣品和血清樣品采集

正試期結(jié)束前2 d分別采集食后0、1、3、5 h和7 h的瘤胃內(nèi)容物，用4層紗布過濾瘤胃食糜，將過濾后得到的瘤胃液裝入10 mL 離心管，隨后立即在-80 ℃保存，用于測定揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid, VFA）和氨氮濃度。同時(shí)，使用非抗凝管分別采集食后0、1、3、5 h 和7 h 的頸靜脈血液并制備血清。將血清轉(zhuǎn)入2 mL離心管后置-80 ℃保存，用于測定抗氧化指標(biāo)。

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1 瘤胃發(fā)酵參數(shù)測定

瘤胃液在5 000 r/min離心10 min后取1 mL上清液置于1.5 mL 離心管中，加入0.2 mL 25%的偏磷酸溶液（含內(nèi)標(biāo)物2-乙基丁酸），充分混勻后置于冰水浴30 min以上，然后在10 000 r/min離心10 min，取出離心管后用移液槍移取上清液于氣相小瓶中上機(jī)測定。

使用安捷倫6890N 氣相色譜儀和HP 19091N-213 色譜柱測定VFA。色譜分析條件為：進(jìn)樣口溫度為220 ℃，分流比為40∶1，氮?dú)饬髁繛?.0 mL/min。檢測器溫度為250 ℃，空氣流量為450 mL/min，尾吹氣流量為45 mL/min，氫氣流量為40 mL/min。程序升溫：初溫為120 ℃3 min，后以10 ℃/min 升溫至180 ℃，并保持1 min。進(jìn)樣量為0.6 μL。

參考孫康等[9]的方法測定瘤胃液中氨氮含量。瘤胃液5 000 r/min離心10 min后移取1 mL上清液轉(zhuǎn)入10 mL 離心管中，加入4 mL 0.2 mol/L 鹽酸后搖勻。然后吸取混合液0.2 mL，置于5 mL離心管內(nèi)，依次加入A液（含有0.08 g亞硝基鐵氰化鈉的100 mL 14%水楊酸鈉溶液）1 mL 和B 液（含有2 mL 次氯酸鈉溶液的100 mL 0.3 mol/L NaOH 溶液）1 mL，充分搖勻，靜置10 min。然后移取200 μL 混勻液置于96 孔板中，使用酶標(biāo)儀測定波長700 nm下的吸光度值。根據(jù)氨氮標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算瘤胃液中氨氮含量。

1.5.2 瘤胃動(dòng)態(tài)pH測定

將每只羊每天所采集的pH數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總，計(jì)算平均值、最大值、最小值，以及pH低于5.60和5.80的持續(xù)時(shí)間及曲線面積。并計(jì)算每小時(shí)平均pH，用于繪制24 h動(dòng)態(tài)pH變化圖。參考李飛等[10]方法計(jì)算以上參數(shù)。

1.5.3 血清抗氧化指標(biāo)的測定

使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）試劑盒測定血清中的谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）和總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 23.0軟件包對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行一般線性混合模型單變量方差分析，并對處理組間進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±SEM”表示，用P值作為衡量顯著性指標(biāo)，P≤0.05為差異顯著，P＞0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧中添加單寧酸對湖羊干物質(zhì)采食量的影響（見圖1）

圖1 飼糧中添加單寧酸對湖羊干物質(zhì)采食量的影響（n=6）

由圖1可知，飼糧中添加單寧酸對湖羊干物質(zhì)采食量無顯著性影響（P＞0.05）。

2.2 飼糧中添加單寧酸對湖羊瘤胃發(fā)酵動(dòng)態(tài)變化的影響（見表2）

表2 飼糧中添加單寧酸對湖羊瘤胃發(fā)酵動(dòng)態(tài)變化的影響（n=6）

表2（續(xù)） 飼糧中添加單寧酸對湖羊瘤胃發(fā)酵動(dòng)態(tài)變化的影響（n=6）

由表2可知，飼糧中添加單寧酸顯著提高湖羊瘤胃丁酸摩爾比和異戊酸摩爾比（P＜0.05），而顯著降低瘤胃氨氮濃度和總揮發(fā)性脂肪酸（total volatile fatty acid，TVFA）含量（P＜0.05）。湖羊采食含單寧酸的飼糧后瘤胃TVFA、丙酸摩爾比會隨時(shí)間的增加顯著升高（P＜0.05）；異戊酸摩爾比和乙丙比會隨時(shí)間的增加顯著降低（P＜0.05）；其中，湖羊采食試驗(yàn)飼料后瘤胃TVFA呈現(xiàn)先提高后降低的顯著變化。處理和時(shí)間對湖羊瘤胃TVFA 含量、異丁酸摩爾比、異戊酸摩爾比和乙丙比產(chǎn)生了顯著的交互作用（P＜0.05）。

2.3 飼糧中添加單寧酸對湖羊瘤胃pH 動(dòng)態(tài)變化的影響（見表3、圖2）

表3 飼糧中添加單寧酸對湖羊瘤胃pH動(dòng)態(tài)變化的影響（n=6）

雖然飼糧中添加單寧酸對瘤胃pH動(dòng)態(tài)指標(biāo)無顯著性影響（P＞0.05），并且單寧酸組與對照組湖羊采食飼糧后24 h 瘤胃pH 動(dòng)態(tài)變化相似，見圖2；但7 h 時(shí)單寧酸組湖羊瘤胃pH顯著高于對照組（P＜0.05）。

圖2 湖羊采食添加單寧酸飼料瘤胃pH24 h動(dòng)態(tài)變化（n=6）

2.4 飼糧中添加單寧酸對湖羊血清抗氧化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化的影響（見表4）

由表4 可知，飼糧中添加單寧酸顯著提高湖羊血清MDA 含量和GSH-Px 活性（P＜0.05），顯著降低T-SOD 活性（P＜0.05）。湖羊采食含單寧酸飼糧后血清中T-AOC 呈現(xiàn)先降低后升高的變化。但處理與時(shí)間對羊血清抗氧化動(dòng)態(tài)變化沒有產(chǎn)生顯著的交互作用（P＞0.05）。

表4 飼糧中添加單寧酸對湖羊血清抗氧化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化的影響（n=6）

表4（續(xù)） 飼糧中添加單寧酸對湖羊血清抗氧化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化的影響（n=6）

3 討論

3.1 飼糧中添加單寧酸對湖羊瘤胃發(fā)酵動(dòng)態(tài)變化的影響

飼糧組成是影響反芻動(dòng)物干物質(zhì)采食量的重要因素，本試驗(yàn)中湖羊飼喂含2%單寧酸的飼糧，就干物質(zhì)采食量而言沒有和對照組產(chǎn)生顯著差異，這與Hatami 等[11]的試驗(yàn)結(jié)果一致，可能原因是低濃度單寧酸對適口性沒有顯著影響。反芻動(dòng)物對飼料來源的蛋白質(zhì)沉積率很低，主要是因?yàn)檫@些蛋白質(zhì)大部分以氨氮的形式在瘤胃中損失。本試驗(yàn)中，飼糧中添加單寧酸顯著降低湖羊瘤胃氨氮濃度，表明單寧酸有效降低了瘤胃蛋白質(zhì)降解率。這主要是因?yàn)橛坞x單寧能夠與飼糧中可溶性蛋白結(jié)合，從而降低瘤胃內(nèi)氨氮濃度[12]。此外，瘤胃內(nèi)氨氮濃度也會隨著瘤胃微生物數(shù)量的減少而降低，可能是因?yàn)閱螌幩崮軌蛞种屏鑫肝⑸锞簲?shù)量所致[13]。

本試驗(yàn)中，飼糧添加單寧酸顯著降低湖羊瘤胃TVFA 濃度，表明單寧酸抑制了瘤胃內(nèi)碳水化合物的降解。這可能是因?yàn)閱螌幩崤c碳水化合物結(jié)合后抑制了某些瘤胃微生物菌群所引起的[14]。前期研究發(fā)現(xiàn)添加單寧酸能夠顯著提高湖羊瘤胃內(nèi)丙酸和丁酸的比例，從而改變乙酸與丙酸比例，但并未對纖維類碳水化合物的降解造成影響，這可能是因?yàn)轱暭Z中添加單寧酸能夠顯著影響非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的發(fā)酵[15]。本試驗(yàn)中單寧酸顯著提高了湖羊瘤胃內(nèi)丁酸比例，而顯著降低了丙酸比例，Geerkens 等[16]也得到了相同的試驗(yàn)結(jié)果。飼糧中碳水化合物的結(jié)構(gòu)和組成是影響瘤胃內(nèi)VFA含量和比例的主要因素，這可能是本試驗(yàn)和前期研究結(jié)果之間存在差異的原因。

3.2 飼糧中添加單寧酸對湖羊瘤胃pH 動(dòng)態(tài)變化的影響

瘤胃pH是反映瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和發(fā)酵程度的重要指標(biāo)。瘤胃緩沖物（堿性物質(zhì)，如氨氮）、VFA 濃度和食糜流通速率都是引起瘤胃pH 變化的主要因素。前期研究發(fā)現(xiàn)瘤胃pH 的最適范圍在5.5～7.5 之間[17]，一般在飼喂2～6 h內(nèi)達(dá)到最低值，然后逐漸回升，最后瘤胃內(nèi)趨于穩(wěn)定[18]，這與本試驗(yàn)結(jié)果相似。本試驗(yàn)中，7 h時(shí)單寧酸組湖羊瘤胃pH顯著高于對照組，李曉鵬[19]在體外發(fā)酵試驗(yàn)中也得到了相似的試驗(yàn)結(jié)果。但其他時(shí)間點(diǎn)，兩處理組湖羊瘤胃pH 均無顯著性差異?？赡茉蚴菃螌幩釋α鑫肝⑸镉幸种谱饔茫梢允刮⑸锏陌l(fā)酵性能受到影響，降低了有機(jī)物在瘤胃內(nèi)的降解，減少了TVFA 的含量，從而引起采食后瘤胃pH的升高。

3.3 飼糧中添加單寧酸對湖羊血清抗氧化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化的影響

動(dòng)物體內(nèi)含有大量的超氧陰離子自由基。在正常情況下，這些超氧陰離子自由基處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。但在動(dòng)物生長發(fā)育過程中，可由外部和自身等原因引發(fā)氧化應(yīng)激，動(dòng)物在代謝過程中會在體內(nèi)產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基，其超強(qiáng)的氧化性降低機(jī)體抗氧化能力[20]，從而導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體出現(xiàn)疾病[21]。但是機(jī)體內(nèi)也會產(chǎn)生大量的抗氧化酶（SOD、GSH-Px），它們可以清除機(jī)體內(nèi)因?yàn)閼?yīng)激而產(chǎn)生的大量自由基，從而使機(jī)體恢復(fù)到正常狀態(tài)。前期研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加單寧酸對動(dòng)物具有保健功能[22-23]，劉華偉[24]研究表明單寧酸可以提高肉兔血清中的SOD含量，魏海峰[25]報(bào)道單寧酸可以降低湖羊血清中的MDA 含量，提高SOD含量，本試驗(yàn)也得到了相同的結(jié)果。動(dòng)物可以通過抗氧化作用清除體內(nèi)自由基等物質(zhì)來提高機(jī)體免疫能力，本試驗(yàn)中添加單寧酸顯著提高了抗氧化酶的含量，這就暗示著單寧酸可以提高了機(jī)體的抗氧化能力。但單寧酸在湖羊瘤胃內(nèi)經(jīng)過瘤胃微生物降解和酸性水解后釋放多種酚類物質(zhì)（如沒食子酸、焦棓酸和間苯二酚等）[26-27]，這些單寧酸有毒分解產(chǎn)物通過毛細(xì)血管到達(dá)肝臟，經(jīng)過肝臟的解毒作用來減少有毒分解產(chǎn)物對機(jī)體的危害，當(dāng)超過肝臟的解毒能力時(shí)，動(dòng)物就會出現(xiàn)中毒癥狀。因此，如何正確合理地在湖羊飼糧中添加單寧酸，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

湖羊飼糧中添加2%的單寧酸會降低瘤胃TVFA和氨氮含量，但能夠提高丁酸比例和維持瘤胃pH 穩(wěn)定，具有保持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和提高血清抗氧化能力的作用。