■王永俠 薛雅婕 楊劍峰 陸紅新 汪新標(biāo) 劉金松 張小東

(1.浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院動物醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 311300；2.桐鄉(xiāng)市宏盛禽業(yè)有限公司，浙江嘉興 314501；3.桐鄉(xiāng)市烏鎮(zhèn)鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)服務(wù)中心，浙江嘉興 314501；4.浙江惠嘉生物科技股份有限公司，浙江湖州 313300）

蛋雞產(chǎn)蛋后期，卵巢加速衰老，造成蛋雞產(chǎn)蛋性能降低和平均產(chǎn)蛋間隔增加[1]。因此，延緩蛋雞產(chǎn)蛋后期卵巢老化以提高生產(chǎn)性能是家禽生產(chǎn)中首要解決的問題。

硒是人和動物生命中必需的微量元素，具有抗氧化、抗衰老、抗應(yīng)激和提高免疫力的功能[2]。家禽飼用硒源主要分為無機(jī)硒和有機(jī)硒，常用無機(jī)硒源為亞硒酸鈉（sodium selenite, SS），有機(jī)硒源為酵母硒（selenium yeast, SY）[3]。SY的主效成分為硒代蛋氨酸（selenomethionine, SM），但含量不穩(wěn)定，且成分復(fù)雜[4]。因此，近年來化工合成的SM產(chǎn)品逐漸被應(yīng)用到飼料中。與SS相比，SY和SM在動物體內(nèi)具有吸收率高、生物活性強(qiáng)、毒性低、抗氧化功能強(qiáng)和環(huán)境污染小等特點[5]。有研究表明，飼糧中添加SY較SS可顯著提高43周齡星雜（Shaver）579蛋雞[6]和30周齡羅曼蛋雞[7]的產(chǎn)蛋量。但目前國內(nèi)外關(guān)于SM對蛋雞產(chǎn)蛋后期產(chǎn)蛋性能影響的研究相對較少。另一方面，特別是近年來，為了更好地利用雞舍設(shè)備和降低生產(chǎn)成本，家禽養(yǎng)殖業(yè)提出延長蛋雞和種雞（包括肉種雞和蛋種雞）淘汰周齡的方案，即將淘汰周齡從傳統(tǒng)意義上的72 周齡延長至80 周齡，甚至延長至100周齡。因此，本試驗擬以70周齡海蘭褐蛋雞為研究對象，以化工合成的SM為有機(jī)硒源，無機(jī)硒SS為對照，比較研究SM和SS對產(chǎn)蛋后期蛋雞硒沉積、抗氧化、免疫、生產(chǎn)性能和蛋品質(zhì)的影響，以期為SM的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)及在食品、醫(yī)藥和飼料中的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

試驗過程得到了浙江農(nóng)林大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)，該委員會使用《動物護(hù)理和使用指南》來管理試驗過程中所有動物的使用。

1.1 試驗材料、設(shè)計與飼糧

亞硒酸鈉（貨號10102-18-8）和硒代蛋氨酸（貨號：259，960，000）分別購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司和北京伊諾凱科技有限公司，在基礎(chǔ)飼糧中的添加量均為0.30 mg/kg（以硒計）。

試驗選用同一批次68 周齡海蘭褐商品蛋雞，預(yù)試期2 周后開始試驗，按照產(chǎn)蛋率基本一致的原則，將試驗蛋雞隨機(jī)分為2組，分別為SS組和SM組，每組含6個重復(fù)，每重復(fù)12只，共計144只，正試期10周。

采用玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧，營養(yǎng)水平參考美國NRC（1994）[8]建議配制。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 飼養(yǎng)管理

蛋雞采用立體3層籠養(yǎng)，每個籠子2只雞，每重復(fù)間隔開1 個籠位。每日喂料3 次，自由采食和飲水，16 h光照。其他均按養(yǎng)殖場常規(guī)管理方式進(jìn)行。

1.3 雞蛋樣品采集與相關(guān)指標(biāo)測定

1.3.1 生產(chǎn)性能的測定

每日以重復(fù)為單位記錄死雞數(shù)、產(chǎn)蛋個數(shù)（包括破蛋和軟殼蛋數(shù)），準(zhǔn)確稱量總蛋重（包括破蛋和軟殼蛋；破蛋蛋黃流出的，不計在內(nèi)），同時統(tǒng)計蛋雞采食量，試驗結(jié)束后以重復(fù)為單位計算產(chǎn)蛋率、軟破蛋率、平均蛋重、平均日采食量和料蛋比。

產(chǎn)蛋率（%）=總產(chǎn)蛋數(shù)/雞只數(shù)×試驗天數(shù)×100

軟破蛋率（%）=軟殼蛋和破蛋總數(shù)/總產(chǎn)蛋數(shù)×100

平均蛋重（g/個）=總蛋重/總產(chǎn)蛋數(shù)

平均日采食量[g/（d·只）]=總耗料量/雞只數(shù)×試驗天數(shù)

料蛋比=總耗料量/總蛋重

1.3.2 蛋品質(zhì)的測定

分別于正試期第5周末和第10周末，采集雞蛋樣品各1次，每個重復(fù)選取6枚接近平均蛋重的雞蛋，用于測定蛋品質(zhì)。

蛋形指數(shù)：利用蛋形指數(shù)測定儀（以色列，NFN385）進(jìn)行測定，測量雞蛋最大縱徑和橫徑，取縱徑與橫徑之比為蛋形指數(shù)。

蛋殼厚度：采用日本三豐數(shù)顯厚度表（型號547-301）進(jìn)行測定，采用三點法測量，測量雞蛋的尖端、中部和鈍端（精確到0.01 mm），最后取其平均值。

蛋殼強(qiáng)度、蛋白高度、哈夫單位和蛋黃顏色的檢測：采用高精度蛋品質(zhì)分析儀（型號DET-6000）進(jìn)行檢測。

1.4 屠宰試驗與相關(guān)指標(biāo)測定

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，每重復(fù)隨機(jī)選取2只接近平均體重的雞，每組12只，共24只，提前12 h禁食但不禁水，稱量并記錄體重后，進(jìn)行翅靜脈采血10 mL于促凝管中，以3 500 r/min離心10 min分離血清。采血后，用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉雞并剖檢，完整取出卵巢，將不同等級卵泡分離，然后取部分卵巢基質(zhì)。血清和卵巢基質(zhì)樣品于-80 ℃凍存，用于后續(xù)相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.4.1 硒含量測定

每個重復(fù)選取2枚具有代表性的雞蛋，分離蛋黃和蛋清進(jìn)行硒含量測定。蛋黃和蛋清在LGJ-18S 凍干機(jī)（北京松源華星科技發(fā)展有限公司）中凍干72 h。分別取0.2 mL 血清和0.2 g 蛋清、蛋黃及卵巢基質(zhì)放于微波消解罐中，隨后加入1 mL H2O2，于密閉微波消解系統(tǒng)內(nèi)消解7 min，直至液體呈無色透明狀。待液體冷卻后取出，加超純水定容至10 mL。將過濾后的2 mL消化液、1 mL 50%（V/V）鹽酸溶液及1 mL 5%的硫脲-抗壞血酸混合液加到10 mL試管中反應(yīng)15 min，再經(jīng)超純水定容后混勻。使用AF-610A 型原子熒光光譜儀上機(jī)測定不同樣品的硒含量。將超純水和硒標(biāo)準(zhǔn)參照物（GBW 08551 豬肝，國家商業(yè)局食品檢測科學(xué)院）當(dāng)做空白及標(biāo)準(zhǔn)參照物對照。

1.4.2 抗氧化指標(biāo)測定

血清和卵巢基質(zhì)谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GPX）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、過氧化氫酶（catalase, CAT）活性和總抗氧化能力（total antioxidant capacity, T-AOC）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）水平測定均按南京建成生物工程研究所有限公司提供的試劑盒說明書操作，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行測定。

卵巢基質(zhì)蛋白含量測定采用南京建成生物工程研究所有限公司試劑盒，以考馬斯亮蘭法測定。

1.4.3 血清免疫指標(biāo)測定

免疫指標(biāo)：免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM）測定均按北京方程生物科技有限公司提供的試劑盒說明書操作，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0中的獨立t檢驗對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硒源對血清、卵巢基質(zhì)、蛋黃和蛋清中硒含量的影響（見表2）

表2 不同硒源對血清、卵巢基質(zhì)、蛋黃和蛋清中硒含量的影響

由表2可知，相較于SS組，飼糧中添加SM可顯著提高血清、卵巢基質(zhì)、蛋黃和蛋清中硒含量（P＜0.05）。

2.2 不同硒源對血清和卵巢基質(zhì)抗氧化指標(biāo)的影響（見表3）

表3 不同硒源對血清和卵巢基質(zhì)抗氧化指標(biāo)的影響

由表3可知，與SS組相比，SM組血清和卵巢基質(zhì)T-AOC水平和CAT、卵巢基質(zhì)SOD活性顯著提高（P＜0.05），而MDA 含量顯著降低（P＜0.05）。不同硒源對血清和卵巢基質(zhì)GPX 活性及血清SOD 活性無顯著影響（P＞0.05）。

2.3 不同硒源對血清免疫指標(biāo)的影響（見表4）

表4 不同硒源對血清免疫指標(biāo)的影響(μg/mL)

由表4可知，與SS組相比，SM組可顯著增加血清IgA和IgG的含量（P＜0.05），但對IgM水平無顯著影響（P＞0.05）。

2.4 不同硒源對生產(chǎn)性能的影響（見表5）

表5 不同硒源對生產(chǎn)性能的影響

由表5可知，與添加SS相比，飼糧中添加SM顯著提高了蛋雞全期產(chǎn)蛋率（P＜0.05）。平均蛋重、平均日采食量、料蛋比及軟破蛋率均不受飼糧中添加不同硒源的影響（P＞0.05）。

2.5 不同硒源對蛋品質(zhì)的影響（見表6）

表6 不同硒源對蛋品質(zhì)的影響

由表6可知，與SS組相比，飼糧中添加SM可顯著提高試驗第10周雞蛋的蛋殼強(qiáng)度和蛋白高度（P＜0.05），但對第10周蛋形指數(shù)、蛋殼厚度、哈夫單位和蛋黃顏色及第5周的各項蛋品質(zhì)指標(biāo)均無顯著影響（P＞0.05）。

3 討論

3.1 硒沉積

飼糧中硒可直接影響血清、組織和器官的硒含量。本試驗結(jié)果顯示，與SS組相比，SM組顯著提高了血清、卵巢基質(zhì)、蛋黃和蛋清中硒含量。Wang等[9]研究表明，SM較SS顯著提高了49周齡海蘭褐蛋雞蛋黃硒含量。Delezie 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在不同添加水平（0.3 mg/kg 和0.5 mg/kg）下，與SS相比，SM可顯著提高55周齡海蘭褐蛋雞全蛋中硒含量。蘇曉菲[5]研究顯示，SM提高50周齡海蘭褐蛋雞血清硒含量的能力明顯高于SS。上述研究與本試驗結(jié)果一致，造成這一現(xiàn)象的主要原因在于SM和SS在機(jī)體內(nèi)吸收機(jī)制的不同。亞硒酸鈉是通過被動轉(zhuǎn)運(yùn)的方式經(jīng)小腸進(jìn)入血液循環(huán)，而SM是通過主動吸收方式進(jìn)入；另一方面，蛋氨酸（Met）-tRNA無法區(qū)分SM和Met化學(xué)結(jié)構(gòu)上的不同，使得SM可直接替代Met用于機(jī)體蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而促進(jìn)機(jī)體內(nèi)硒沉積[11]。

3.2 抗氧化功能

硒是GPX 的必需元素和組成部分，而GPX 可通過清除代謝活動中產(chǎn)生的過氧化氫發(fā)揮抗氧化作用。飼糧中補(bǔ)硒通常會導(dǎo)致血清和組織GPX 活性的增加[12-14]。

氧化應(yīng)激是蛋雞產(chǎn)蛋后期卵巢機(jī)能衰退的主要誘因[15]。丙二醛是活性氧自由基（ROS）攻擊不飽和脂肪酸產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物的最終分解產(chǎn)物，其在機(jī)體中的含量可反映機(jī)體氧化應(yīng)激的程度[16]。SOD 可清除超氧陰離子自由基，CAT 可清除過氧化氫，從而顯著減少MDA 含量，提高機(jī)體抗氧化能力[14，17-18]?？偪寡趸芰t是待測樣品中所有抗氧化劑的抗氧化能力總和，可反映機(jī)體清除ROS的總能力[1]。

占秀安等[19]對39 周齡嶺南黃羽肉種雞的研究表明，與SS 相比，SM 可顯著提高肝臟和肌肉T-AOC 水平及血清、肝臟、腎臟和胰臟SOD活性，并顯著降低血清MDA 含量。另有研究發(fā)現(xiàn)，55 周齡海蘭褐蛋雞[10]和48 周齡羅曼蛋雞[12]血清中GPX 活性均不受飼糧添加不同硒源的影響。本試驗研究結(jié)果顯示，與SS 組相比，SM組顯著提高了血清和卵巢基質(zhì)T-AOC 水平和CAT活性及卵巢基質(zhì)SOD活性，并顯著降低了血清和卵巢基質(zhì)MDA 含量，但在提高血清和卵巢基質(zhì)GPX 活性方面，并未達(dá)到顯著水平，與上述研究結(jié)果基本一致。本試驗結(jié)果表明，SM 較SS可有效提高產(chǎn)蛋后期蛋雞卵巢基質(zhì)抗氧化能力，這可能是由于SM較SS 顯著增加了卵巢基質(zhì)硒沉積，進(jìn)而提高了多種抗氧化酶活性，最終提高了總抗氧化能力。但在提高血清和卵巢基質(zhì)GPX活性方面，不同硒源并未達(dá)到差異顯著水平，具體的作用機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

3.3 免疫功能

免疫力的提高對維持家禽健康具有重要作用，硒主要通過多種硒蛋白進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)以增強(qiáng)機(jī)體特異性與非特異性免疫功能[20]。在本研究中，與SS組相比，SM組血清IgA和IgG的含量顯著升高，這說明在本試驗條件下，SM提高蛋雞免疫功能的能力優(yōu)于SS，推測與其提高機(jī)體硒沉積的能力優(yōu)于SS有關(guān)，因免疫細(xì)胞（如T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）的活化導(dǎo)致ROS的增加，而硒能通過直接和間接的方式清除ROS[21]，從而保護(hù)細(xì)胞膜免受過氧化物的損害，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。

3.4 生產(chǎn)性能

本研究結(jié)果表明，與SS 組相比，SM 組顯著提高了試驗全期產(chǎn)蛋率，而平均蛋重、平均日采食量、料蛋比和軟破蛋率均不受飼糧中添加SM 和SS 的影響。齊香萍等[22]研究表明，酵母硒較SS 可顯著提高43 周齡海蘭褐蛋雞的產(chǎn)蛋率，與本研究結(jié)果大體一致。造成此結(jié)果的可能原因在于SM組比SS組顯著提高了卵巢基質(zhì)硒沉積，進(jìn)而提高了卵巢基質(zhì)的抗氧化能力，由此減輕了ROS造成的卵巢基質(zhì)氧化損傷，最終促進(jìn)卵泡的發(fā)育，提高了產(chǎn)蛋率。另一方面，SM組機(jī)體免疫功能的提高，可增強(qiáng)蛋雞健康水平，對提高產(chǎn)蛋率也有促進(jìn)作用。

3.5 蛋品質(zhì)

蛋品質(zhì)主要通過蛋形指數(shù)、蛋殼強(qiáng)度、蛋殼厚度、蛋白高度、哈夫單位和蛋黃顏色等指標(biāo)來綜合判斷。蛋殼強(qiáng)度和蛋殼厚度主要反映蛋殼質(zhì)量，蛋白高度則反映雞蛋新鮮度[23]。本試驗結(jié)果表明：飼添SM較SS可顯著提高試驗第10周的蛋殼強(qiáng)度和蛋白高度，但對試驗第5周的各項蛋品質(zhì)指標(biāo)均無顯著影響，這說明SM較SS發(fā)揮優(yōu)勢作用是一個時間累積過程。崔國強(qiáng)等[24]研究發(fā)現(xiàn)，酵母硒較SS可顯著增加23周齡蛋雞（北京油雞和羅曼粉蛋雞雜交一代）的蛋殼強(qiáng)度，這與本試驗結(jié)果大體一致。造成此現(xiàn)象的原因可能是由于SM較SS顯著提高了蛋殼腺硒沉積和抗氧化能力，進(jìn)而增強(qiáng)了蛋殼腺Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平[25-26]，最終提高了蛋殼鈣含量和蛋殼強(qiáng)度，但具體的作用機(jī)制還有待近一步研究。硒代蛋氨酸較SS可顯著提高蛋白高度的可能原因在于：①SM與SS相比更能顯著提高輸卵管膨大部的硒沉積和抗氧化能力，從而促進(jìn)濃厚蛋白的分泌，提高了蛋白高度；②SM較SS顯著提高了蛋清硒含量，進(jìn)而提高了蛋清抗氧化能力，最終促使蛋白高度的提高；但具體的作用機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

與SS相比，飼糧添加SM可顯著增加產(chǎn)蛋后期蛋雞血清、卵巢基質(zhì)、蛋黃和蛋清硒含量，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體抗氧化和免疫功能，最終提高產(chǎn)蛋性能和蛋品質(zhì)。