張 博，張浩

（佳木斯大學附屬第一醫(yī)院整形外科，黑龍江 佳木斯 154007）

燒傷（burn）是導致皮膚損傷的主要原因之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計[1]，全世界每年有近30 萬人死于燒傷。在嚴重燒傷過程中，細胞和血管均受到損傷，分子代謝出現(xiàn)異常調(diào)控，進一步導致各種非編碼RNA 和細胞因子等分子調(diào)控出現(xiàn)紊亂[2-5]。有研究表明[6-8]，微小RNA（microRNA）參與了皮膚燒傷后的分子調(diào)控代謝過程，其中microRNA-744 在皮膚燒傷具有重要調(diào)控作用。蛋白激酶cAMP 激活催化亞基α（PRKACA）是參與細胞信號轉(zhuǎn)導的重要分子之一[7，8]。成纖維細胞生長因子（FGF）是組織穩(wěn)態(tài)和癌癥中的關鍵有絲分裂原，F(xiàn)GF2 在皮膚燒傷愈后的分子機制中也具有重要作用[9]。本研究主要探討microRNA-744 調(diào)控PRKACA 和FGF2 對皮膚燒傷愈后疤痕形成的影響和分子間的相關性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑和動物 30 只健康新西蘭大白兔由騰新生物技術有限公司提供（許可證號：SCX2021-0004），體重2.0～2.5 kg，雌雄各半。清潔級動物室適應性飼養(yǎng)1 周，在制備燒傷動物模型前24 h 禁食不禁水，實驗方案獲佳木斯大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會審批通過。microRNA 提取分離試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；cDNA 第一鏈合成試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；qRT-PCR 檢測試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；microRNA 檢測引物U6（北京天根生化科技有限公司）；microRNA檢測引物miR-744（天根生化科技有限公司）；RNase-Free 雙蒸水（北京天根生化科技有限公司）等。

1.2 實驗儀器 實時熒光定量PCR（美國應用生物系統(tǒng)公司）、瓊脂糖凝膠電泳儀(美國Bio-Rad 公司)、反轉(zhuǎn)錄PCR（美國應用生物系統(tǒng)公司）、-80 ℃超低溫冰箱（美國Thermo Scientific 公司）、蛋白凝膠成像儀（美國Wealtec 公司）、超凈工作臺（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）、4 ℃低溫高速離心機（德國Eppendorf 公司）等。

1.3 方法

1.3.1 燒傷模型和組織樣本收集 提前24 h 由耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉，麻醉后行頸內(nèi)靜脈和頸動脈穿刺置管備用，將兔背部涂抹10%硫代鈉脫毛，燒傷面積為總體表面積的30%。體表面積公式：A（m2）=R×W2/3，A 為體表面積（m2），W 為體重（kg），經(jīng)計算燒傷面積約為514 cm2。根據(jù)燒傷時間和常用燒傷動物模型制作方法進行分組，分別為對照組、燒傷組、愈后組，每組10 例。組織樣本離體后迅速冷凍至液氮中，直至MicroRNA 提取。

1.3.2 血液樣本收集 用不含抗凝劑的試管釆集外周靜脈血0.5 ml，室溫下3000 r/min 離心15 min，去除血細胞，收集上層血清，然后將收集血清在4 ℃，3000 r/min 離心15 min，進一步除去殘留血細胞；小心吸取上層血清至新的離心管，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 qRT-PCR 檢測MicroRNA-744 表達 首先進行樣本microRNA 提取分離，合成microRNA cDNA第一鏈，再進行瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA（圖1），然后再進行反轉(zhuǎn)錄實驗，反轉(zhuǎn)錄程序包括：①RNA加尾反應和反轉(zhuǎn)錄反應42 ℃，60 min；②酶失活反應95 ℃，3 min。microRNA 熒光定量檢測：按實驗樣本數(shù)量計算各試劑總量，分裝到反應管中，然后加入引物和microRNA cDNA，再加入樣本的cDNA，混勻，離心，設置反應程序，進行檢測，然后觀察結果。樣本microRNA 使用核酸定量儀測定RNA 濃度和純度，光密度A260/A280 均在1.8～2.0 間表明RNA無降解。microRNA 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA 后，進行瓊脂糖凝膠電泳。運用qRT-PCR 檢測各組樣本時，如果溶解曲線分析未見雜峰，擴增產(chǎn)物單一，表明沒有非特異性擴增。用U6 為內(nèi)參，反應結束后計算Ct值。根據(jù)擴增曲線得到microRNA-744 和U6的Ct值，通過公式計算ΔCt（ΔCt=CtmicroRNA-744-CtU6），運用2-ΔΔCt法對各組樣本microRNA的表達水平。

圖1 cDNA 瓊脂糖凝膠電泳圖

1.3.4 ELISA 實驗檢測PRKACA 和FGF2 每孔加入100 μl 標準品、空白樣品或樣品；棄掉每個孔的液體，然后不要洗，向每孔加入100 μl 檢測試劑A 工作溶液；用微量加樣槍吸出每個孔并洗滌，重復3次，總共洗滌3 次；每孔加入100 μl Detection Reagent B 作溶液，蓋上一個新的密封板，在37 ℃孵育1 h；重復抽吸/洗滌5 次；每孔加入90 μl 底物溶液，蓋上新的Plate 密封劑，在37 ℃下孵育15～30 min，避光；每孔加入50 μl 終止液，如果顏色變化不均勻，輕輕敲打板確保充分混合；確定每個孔的光密度到450 nm，使用酶標儀一次測定；根據(jù)酶標儀的標準曲線進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.5 Western Blot 檢測組織PRKACA 和FGF2 蛋白表達 組織加入裂解液，4 ℃裂解1 h 后，12 000 g，4 ℃離心30 min，取上清，放于-80 ℃冰箱中，每次電泳之前進行蛋白測定，使用蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，然后進行一抗、二抗反應，最后再進行顯色反應和凝膠圖象分析。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料使用（±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，相關性采用Pearson 線性相關分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組microRNA-744 表達比較 燒傷組和愈后組microRNA-744表達量分別為（6.901±1.031）、（7.583±1.067），均高于對照組的（4.671±1.012），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 各組PRKACA 和FGF2 表達量比較 燒傷組和愈后組PRKACA 表達水平低于對照組，且愈后組低于燒傷組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；燒傷組和愈后組FGF2 表達水平高于對照組，且愈后組高于燒傷組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組PRKACA 和FGF2 表達量比較（±s，ng/ml）

表1 各組PRKACA 和FGF2 表達量比較（±s，ng/ml）

2.3 各組PRKACA 和FGF2 蛋白表達量比較 燒傷組和愈后組PRKACA 蛋白表達低于對照組，且愈后組低于燒傷組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；燒傷組和愈后組FGF2 蛋白表達高于對照組，且愈后組高于燒傷組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2、圖3、表2。

圖2 各組PRKACA 蛋白表達量比較（表達量范圍0.5～1.3）

圖3 各組FGF2 蛋白表達量比較（表達量范圍0.4～1.2）

表2 各組PRKACA 和FGF2 蛋白表達量比較（±s）

表2 各組PRKACA 和FGF2 蛋白表達量比較（±s）

2.4 MicroRNA -744 和 PRKACA、FGF2的關系Pearson 相關性分析顯示，microRNA-744 和PRKACA 呈負相關（r=-0.821，P＜0.05），與FGF2 呈正相關（r=0.773，P＜0.05）。

3 討論

MicroRNA 是參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控非常重要的非編碼RNA，且其可間接影響相關蛋白質(zhì)表達[10]。目前，已經(jīng)有很多研究表明[11]，microRNA 與燒傷的分子調(diào)控機制密切相關，大多數(shù)microRNA 有抑制相關蛋白質(zhì)表達的作用，但是microRNA-744 在皮膚燒傷愈后瘢痕形成中的具體分子機制仍尚未明確。

FGF2 是一種多功能蛋白，在傷口愈合、組織修復和再生中具有重要作用。這種治療性蛋白質(zhì)廣泛用于燒傷治療，因為其可刺激細胞增殖和分化、血管生成和細胞外基質(zhì)重塑[12]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，燒傷組和愈后組microRNA-744 表達量高于對照組（P＜0.05）；燒傷組和愈后組PRKACA 表達水平及蛋白表達低于對照組，且愈后組低于燒傷組（P＜0.05）；燒傷組和愈后組FGF2 表達水平及蛋白表達高于對照組，且愈后組高于燒傷組（P＜0.05）；Pearson 相關性分析顯示，microRNA-744 和PRKACA 呈負相關（P＜0.05），與FGF2 呈正相關（P＜0.05），提示microRNA-744 表達可以通過抑制PRKACA 間接促進FGF2的表達，且在燒傷及愈后的發(fā)生發(fā)展中，microRNA-744的先降低和再升高導致PRKACA、FGF2 表達量發(fā)生改變，因此在燒傷及愈后發(fā)生發(fā)展中，microRNA-744 可以調(diào)控PRKACA、FGF2 表達，進而可以作為預測燒傷輕重程度及愈后發(fā)展的分子指標。

綜上所述，microRNA-744 通過影響PRKACA和FGF2 含量變化，從而從分子水平實現(xiàn)影響調(diào)控燒傷及愈后發(fā)生發(fā)展的作用。