孫衍，渠海，宋祺，申一凡，王儷娟，牛曉紅

（長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和濟(jì)醫(yī)院內(nèi)分泌科1，普通外科2，山西 長(zhǎng)治 046011）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是一種以持續(xù)性蛋白尿和進(jìn)行性腎功能下降為特征的臨床綜合征[1]。據(jù)報(bào)道[2]，DN 發(fā)生在糖尿病患者中的機(jī)率占20%～50%，并且是發(fā)生終末期腎臟疾病的常見(jiàn)原因。此外，DN 通常與動(dòng)脈高血壓和心血管疾病發(fā)病率和死亡率的增加有關(guān)，嚴(yán)重影響患者的生命安全及預(yù)后[3，4]。因此，探究治療DN的措施及手段顯得尤為重要。微小RNA（miRNA，miR）是一類(lèi)非編碼的單鏈小分子RNA[5]。最近，越來(lái)越多的證據(jù)表明miRNA 與DN的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[6，7]。在高糖（high glucose，HG）處理的腎小球系膜細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miR-141 可促進(jìn)細(xì)胞凋亡并加劇炎癥[8]。因此，miRNA 可能成為DN的診斷性生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。最近的一項(xiàng)研究表明，與2 型糖尿病相比，DN 患者中miR-320c的表達(dá)升高，這表明miR-320c的過(guò)表達(dá)可能對(duì)DN有害，但其潛在機(jī)制尚不清楚[9]。此外，另一項(xiàng)研究表明抑制miR-320c 可通過(guò)靶向KIF14 促進(jìn)nephrin及podocin 表達(dá)，抑制HG 誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷[10]?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，本研究以腎小管上皮細(xì)胞HK-2為研究對(duì)象，探索miR-320c 在HG 誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)DN 作用的可能分子機(jī)制，旨在為DN 診斷及靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人腎小管上皮細(xì)胞HK-2 購(gòu)自武漢普諾賽生物生命科技公司；葡萄糖購(gòu)自美國(guó)sigma公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；胰蛋白酶、Lipofectamine2000 購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；miR-320c inhibitor 及inhibitor NC 由廣州銳博生物科技公司合成；兔抗人的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 TGF-β1、p-Smad2/3 抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自上海艾博抗公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 公司；Ace－QqPCR SYBR Green Mix，高敏型ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒及RIPA 裂解液均購(gòu)自南京諾唯贊生物公司；6 孔及24 孔細(xì)胞板購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司；Transwell cell（孔徑8.0 μm）購(gòu)自美國(guó)Corning 公司；Matrigel 膠購(gòu)自美國(guó)BD 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 HK-2 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 完全培養(yǎng)基中，并置于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的HK-2細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，制備細(xì)胞懸液，按照1×104個(gè)/ml，100 μl 每孔的密度接種于6 孔板，正常對(duì)照組（control組）：用含有5.5 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；高糖組（HG組）：用含有45 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；HG+inhibitor NC 組：將inhibitor NC 轉(zhuǎn)染至HK-2 細(xì)胞，并用含有45 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；HG+miR-320c inhibitor組：將miR-320c inhibitor 轉(zhuǎn)染至HK-2 細(xì)胞，并用含有45 mmol/L 葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000 試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.2 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，采用Trizol 法裂解細(xì)胞，RNA 抽提試劑盒提取細(xì)胞的總RNA。立即用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，qRTPCR 試劑盒進(jìn)行miR-320c的檢測(cè)。反應(yīng)體系：cDNA 模板（50 ng/μl）1.5 μl，正反向引物（10 μmol/L）各0.6 μl，SYBR Green Mix 6 μl，單蒸水1.3 μl，共10 μl。反應(yīng)條件：95 ℃，3 min 30 s；95 ℃，10 s；60 ℃，15 s；72 ℃，20 s；共40 個(gè)循環(huán)。以U6 為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算定量miR-320c 表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察 高糖誘導(dǎo)24 h 后，收集4 組HK-2 細(xì)胞，制備細(xì)胞涂片，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察4 組HK-2 細(xì)胞的形態(tài)并拍照。

1.2.4 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel 和4 ℃預(yù)冷無(wú)血清培養(yǎng)基以1∶8的比例稀釋后，包被在Transwell小室底部聚碳酸酯膜的上室面，將Transwell 小室放入24 孔板中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中待Matrigel 凝固。將HK-2 細(xì)胞密度調(diào)至1×105個(gè)/ml，按每室200 μl接種于Transwell 小室上室中，24 孔板加入500 μl含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h 待細(xì)胞貼壁，按前述分組及處理法處理細(xì)胞，在24 孔板中培養(yǎng)24 h 后，取出Transwell 小室，擦去Matrigel 膠和小室內(nèi)的細(xì)胞，用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定小室外底面的細(xì)胞30 min，0.1%結(jié)晶紫染色15～20 min，在顯微鏡下隨機(jī)選取6 個(gè)視野計(jì)算穿膜細(xì)胞個(gè)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 取各組處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2 細(xì)胞，用含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度至2×105個(gè)/ml，并按2 ml/孔接種于6 孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，并使融合率達(dá)90%，用200 μl 移液槍頭在6 孔板內(nèi)劃線，用顯微鏡分別在0、24 h 對(duì)細(xì)胞愈合狀態(tài)觀察拍照，并用Image J 軟件測(cè)量各組細(xì)胞劃痕愈合面積，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，計(jì)算平均值。細(xì)胞遷移率（%）=[（0 h 劃痕距離-24 h 劃痕距離）/0 h 面積]×100%

1.2.6 Western blot 實(shí)驗(yàn) 收集前述各組細(xì)胞，用RIPA裂解液進(jìn)行裂解。用BCA 法測(cè)定其蛋白濃度，裂解液在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離，蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。然后，在室溫下用5%的脫脂牛奶封閉1 h，配置TGF-β1 和p-Smad2/3 蛋白一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。用PBST 洗膜后用二抗室溫孵育2 h。高敏型ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯色，并使用Image J 軟件分析各蛋白條帶灰度值，定量蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 9 軟件作圖，計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著，P＜0.001 表示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義極顯著。

2 結(jié)果

2.1 高糖誘導(dǎo)對(duì)HK-2 細(xì)胞中miR-320c 表達(dá)的影響 采用qRT-PCR 法檢測(cè)miR-320c 在HG 處理的HK-2 細(xì)胞中的表達(dá)特征。結(jié)果顯示，與control 組比較，HG 組中miR-320c 水平明顯升高（P＜0.001）。此外，與HG+inhibitor NC 組比較，HG+miR-320c inhibitor 組中miR-320c的表達(dá)顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)表1、圖1。

圖1 高糖誘導(dǎo)對(duì)HK-2 細(xì)胞中miR-320c 表達(dá)的影響

表1 高糖誘導(dǎo)對(duì)HK-2 細(xì)胞中miR-320c 表達(dá)的影響（n=3，±s）

表1 高糖誘導(dǎo)對(duì)HK-2 細(xì)胞中miR-320c 表達(dá)的影響（n=3，±s）

注：與control 組比較，***P＜0.001；與HG+inhibitor NC 組比較，##P＜0.01

2.2 抑制miR-320c 對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞形態(tài)變化的影響 control 組中，HK-2 細(xì)胞呈鵝卵石樣立方體形狀，排列緊密，為典型的上皮細(xì)胞形態(tài)；經(jīng)HG 處理后，HK-2 細(xì)胞變長(zhǎng)，與鄰近細(xì)胞解離，失去鵝卵石樣形態(tài)，呈現(xiàn)紡錘形；而與HG+inhibitor NC組比較，HG+miR-320c inhibitor 組中紡錘形細(xì)胞數(shù)量較少。結(jié)果表明，抑制miR-320c的表達(dá)可使HG誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞形態(tài)回歸正常，見(jiàn)圖2。

圖2 抑制miR-320c 對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2 細(xì)胞形態(tài)變化的影響

2.3 抑制miR-320c 對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞侵襲能力的影響 與control 組比較，HG 處理HK-2 細(xì)胞后，細(xì)胞侵襲能力明顯增強(qiáng)，侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增多（P＜0.001）；而與HG+inhibitor NC 組比較，HG+miR-320c inhibitor 組中細(xì)胞侵襲能力顯著降低，侵襲細(xì)胞數(shù)也明顯減少（P＜0.05），見(jiàn)圖3、表2。

表2 抑制miR-320c 對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞侵襲能力的影響（n=6，±s）

表2 抑制miR-320c 對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞侵襲能力的影響（n=6，±s）

注：與control 組比較，***P＜0.001；與HG+inhibitor NC 組比較，#P＜0.05

圖3 抑制miR-320c 對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞侵襲能力的影響（×200）

2.4 抑制miR-320c 對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞遷移能力的影響 與control 組比較，HG 處理HK-2 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)，遷移率明顯提高（P＜0.001）；而與HG+inhibitor NC 組比較，HG+miR-320c inhibitor 組中細(xì)胞遷移能力顯著降低，遷移率也明顯降低（P＜0.001），見(jiàn)圖4、表3。

表3 抑制miR-320c 對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞遷移能力的影響（±s，n=6）

表3 抑制miR-320c 對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞遷移能力的影響（±s，n=6）

注：與control 組比較，***P＜0.001；與HG+inhibitor NC 組比較，###P＜0.05

圖4 抑制miR-320c 對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞遷移能力的影響（×200）

2.5 抑制miR-320c 對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞TGFβ/Smad 通路的影響 與control 組比較，HG 處理HK-2 細(xì)胞后，TGF-β1 及p-Smad2/3的表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.001）；而與HG+inhibitor NC 組比較，HG+miR-320c inhibitor 組中TGF-β1（P＜0.05）及p-Smad2/3（P＜0.01）的表達(dá)顯著降低，見(jiàn)表4、圖5。

表4 抑制miR-320c 對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞TGF-β/Smad 通路的影響（n=3，±s）

表4 抑制miR-320c 對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞TGF-β/Smad 通路的影響（n=3，±s）

注：與control 組比較，***P＜0.001；與HG+inhibitor NC 組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

圖5 抑制miR-320c 對(duì)高糖誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞TGF-β/Smad 通路的影響

3 討論

目前，miRNA 作為基因表達(dá)關(guān)鍵調(diào)控因子，在各種疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要影響[11]。據(jù)報(bào)道[12]，miRNA的失衡與DN的發(fā)展密切相關(guān)。miR-21 inhibitor 可以抑制DN 中（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）及腎臟纖維化，同時(shí)改善腎臟的結(jié)構(gòu)和功能[13，14]。MiR-34a-5p 在HG 誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中上調(diào)，其過(guò)表達(dá)可能通過(guò)靶向SIRT1 加重腎小管間質(zhì)纖維化[15]。研究顯示[16，17]，miR-320c 在DN患者中明顯上調(diào)，表明miR-320c 可以作為治療DN的候選靶標(biāo)。此外，抑制miR-320c 可通過(guò)靶向KIF14 促進(jìn)nephrin 及podocin 表達(dá)，抑制HG 誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。本研究旨在闡明miR-320c 在DN 中的調(diào)控作用及其分子機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在HG 誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞中，miR-320c的水平明顯高于正常HK-2 細(xì)胞，之后還合成了miR-320c inhibitor以探索其功能。細(xì)胞形態(tài)結(jié)果顯示，抑制miR-320c下調(diào)miR-320c 表達(dá)水平，可以保留HK-2 細(xì)胞正常的鵝卵石立方體形狀，這表明miR-320c 可能對(duì)DN 有害。

EMT 被認(rèn)為是腎小管間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的起始因素之一[18]。目前，EMT的發(fā)生已經(jīng)在各種形式的慢性腎臟疾病中得到了證實(shí)，包括DN[19]。盡管腎小管間質(zhì)纖維化也可能在這些疾病早期階段出現(xiàn)，但物質(zhì)的積聚往往伴隨著疾病進(jìn)展，與腎功能逐漸下降有關(guān)[20]。因此，進(jìn)行性腎小管間質(zhì)纖維化通常是導(dǎo)致DN 腎衰竭的常見(jiàn)途徑。上皮細(xì)胞通過(guò)EMT 從上皮間室轉(zhuǎn)移到間質(zhì)，獲得完整的間質(zhì)表型，其特征是上皮細(xì)胞間黏附性鈣粘蛋白表達(dá)減少，α-平滑肌肌動(dòng)蛋白和波形蛋白表達(dá)增加[11，21]。這種向間充質(zhì)狀態(tài)的轉(zhuǎn)變促進(jìn)了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)并形成了新的膜突起。最后，增加的細(xì)胞突起和金屬蛋白酶的表達(dá)導(dǎo)致額外的細(xì)胞基質(zhì)降解，細(xì)胞遷移和侵襲行為[22，23]。即EMT的發(fā)展伴隨著細(xì)胞遷移和侵襲能力的增強(qiáng)[24]。在本研究中，Transwell 侵襲試驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)表明，用HG 處理的HK-2 細(xì)胞中侵襲細(xì)胞的數(shù)目和遷移率顯著增加，但是抑制miR-320c 可以顯著降低這些細(xì)胞的侵襲性和遷移能力。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步說(shuō)明了miR-320c inhibitor 可以抑制HG 誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞的侵襲性和遷移能力，從而可能發(fā)揮EMT 抑制作用。

TGF-β1 是DN的關(guān)鍵中介因子[25]。TGF-β1 通過(guò)與TGF-β 受體Ⅱ（TβRⅡ）結(jié)合啟動(dòng)其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活TGF-β 受體Ⅰ（TβRⅠ）激酶，導(dǎo)致受體調(diào)控的Smads 磷酸化，稱(chēng)為Smad2 和Smad3[26，27]。在DN 患者及1 型DN的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中，通過(guò)腎小球和小管間質(zhì)細(xì)胞中磷酸化的Smad2 和Smad3的核易位，TGF-β/Smad 信號(hào)被高度激活，TGF-β/Smad 信號(hào)的激活顯著促進(jìn)了腎小球和小管間質(zhì)纖維化[28，29]。在體外，高糖環(huán)境、年齡和血管緊張素Ⅱ可以激活Smad2 和Smad3，誘導(dǎo)系膜細(xì)胞、小管上皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞合成膠原基質(zhì)[30]。因此，TGF-β/Smad 信號(hào)通路在DN 中是過(guò)度激活且有害的。目前，有一些報(bào)道揭露了TGF-β/Smad 信號(hào)通路在DN 中的作用。比如，抑制miR-135a-5p 可通過(guò)靶向SIRT1 改善DN 中誘導(dǎo)的腎纖維化[31]；miR-346通過(guò)TGF-β/Smad 信號(hào)通路調(diào)控DN 相關(guān)基因表達(dá),在DN的發(fā)生和發(fā)展中起到非常重要的作用[32]；芪地糖腎顆粒通過(guò)TGF-β1-Smad2/3 通路下調(diào)TGF-β1的表達(dá)水平從而對(duì)DN的纖維化產(chǎn)生治療作用[33]。在本研究中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HG 處理HK-2細(xì)胞后，TGF-β/Smad 信號(hào)通路被高度激活，而加入miR-320c inhibitor 可抑制HG 誘導(dǎo)下HK-2 細(xì)胞TGF-β/Smad 通路的激活，表明抑制miR-320c的表達(dá)可通過(guò)抑制TGF-β/Smad 信號(hào)通路對(duì)DN產(chǎn)生治療作用。

綜上所述，本研究證明了與正常HK-2 細(xì)胞相比，HG 處理的HK-2 細(xì)胞中miR-320c 顯著上調(diào)。此外，抑制miR-320c的表達(dá)可以抑制HG 誘導(dǎo)的HK-2 細(xì)胞的侵襲和遷移，從而可能對(duì)EMT的發(fā)生起作用。最后，miR-320c 抑制劑對(duì)TGF-β/Smad 信號(hào)通路的表達(dá)具有負(fù)調(diào)控作用。