胡嘉莉，華琳

（首都醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京 100069）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性最常見的癌癥之一，也是西方男性癌癥死亡的第2 大原因。有資料顯示[1]，我國70 歲以上人群前列腺癌的發(fā)生率高達25%。早期前列腺癌不易被發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)前列腺癌患者初診時已經(jīng)發(fā)生癌細胞轉(zhuǎn)移，失去治愈的機會。在過去的幾十年中，雖然前列腺癌的診斷技術(shù)已經(jīng)得到了顯著提高，而且前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen，PSA）也被認為有助于提高前列腺癌的診斷率，但當(dāng)前也有很多研究認為應(yīng)用PSA 診斷前列腺癌并不完全成功。有研究表明，相比PSA，堿性磷酸酶（ALP）在評估治療反應(yīng)上的準確性更高[2]。miRNA（microRNA）是由18～25 個核苷酸組成的非編碼RNA，參與基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[3]。研究認為[4]，體液中miRNA 表達差異與前列腺癌患者的預(yù)后相關(guān)，可能成為評估前列腺癌患者預(yù)后的分子標(biāo)記物。本文通過對前列腺癌的mRNA 和miRNA的雙重表達譜的生物信息學(xué)分析，探討miRNA 和mRNA 在前列腺癌中的分子調(diào)控機制并構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，報道如下。

1 資料與方法

1.1 前列腺癌的miRNA 表達譜數(shù)據(jù)及差異表達分析通過GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲取前列腺癌的miRNA 表達譜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)平臺為GSE8126，該數(shù)據(jù)中包括60 個前列腺癌組織樣本和15 個正常前列腺組織樣本。通過對數(shù)據(jù)的預(yù)處理（中心化，對數(shù)變換和標(biāo)準化），獲得326 個miRNA的表達值。采用matlab 生物信息工具箱中的t檢驗篩選差異表達的miRNA，定義差異表達的miRNA為：P＜0.05 且FDR＜0.01，其中Fold_change＞1.5 認為該miRNA 是上調(diào)的，F(xiàn)old_change ＜1/1.5 認為該miRNA 是下調(diào)的。

1.2 前列腺癌的mRNA 表達譜數(shù)據(jù)及差異表達分析通過GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲取前列腺癌的mRNA 表達譜數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)平臺為GSE6956，該數(shù)據(jù)中包括60 個前列腺癌組織樣本和15 個正常前列腺組織樣本。通過對數(shù)據(jù)的預(yù)處理（中心化，對數(shù)變換和標(biāo)準化），獲得13 787 個mRNA的表達值。差異表達mRNA的篩選標(biāo)準為P＜0.05且FDR＜0.01；其中Fold_change＞1.5 認為該mRNA是上調(diào)的，F(xiàn)old_change＜1/1.5 認為該mRNA 是下調(diào)的。

1.3 miRNA 和mRNA的調(diào)控關(guān)系

1.3.1 基于Pearson 相關(guān)的miRNA-mRNA 反向調(diào)控從MicroCosm Targets 數(shù)據(jù)庫（http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/）下載篩選出的 Fold_change 最大的上調(diào)的 miRNA 和Fold_change 最小的下調(diào)的miRNA的靶基因，計算它們與靶基因的Person 相關(guān)系數(shù)并分析這兩個miRNA 和它們的靶基因的反向調(diào)控關(guān)系。

1.3.2 基于廣義典則相關(guān)分析的miRNA-mRNA 調(diào)控 采用改進的廣義典則相關(guān)分析篩選出所有上調(diào)和下調(diào)的miRNA 和mRNA，探討miRNA 和mRNA的調(diào)控關(guān)系并構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。提取前10 個miRNA和前20 個mRNA 作為前列腺癌的特征生物標(biāo)記，采用R 軟件的mixOmics 軟件包（http://r-project.org）進行分析。

1.3.3 miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 基于廣義典則相關(guān)分析，確定典則相關(guān)系數(shù)的cutoff 值并根據(jù)cutoff值，保留獲得的miRNA-mRNA 調(diào)控關(guān)系，根據(jù)該調(diào)控關(guān)系構(gòu)建相應(yīng)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中的miRNA 如果調(diào)控的mRNA的數(shù)目較多，稱為該miRNA 具有較高的度，為網(wǎng)絡(luò)中的hub miRNA，認為其是與前列腺癌相關(guān)的重要生物標(biāo)記。

2 結(jié)果

2.1 miRNA 表達譜數(shù)據(jù)的差異表達分析 共發(fā)現(xiàn)117 個差異表達的miRNA，其中有15 個差異表達的miRNA 是下調(diào)的，如miR-521 和miR-527 等；有20個差異表達的miRNA 是上調(diào)的，如miR-511 和miR-526a 等。將上調(diào)和下調(diào)的差異表達的miRNA進行雙向?qū)哟尉垲?，見圖1。

圖1 上調(diào)和下調(diào)的差異表達的miRNA

2.2 mRNA 表達譜數(shù)據(jù)的差異表達分析 共識別出9054 個差異表達的mRNA，其中有35 個差異表達的mRNA 是下調(diào)的，有36 個差異表達的mRNA 是上調(diào)的。雙向?qū)哟尉垲惤Y(jié)果見圖2，mRNA 表達譜能夠很好的區(qū)分不同組織起源的樣本。

圖2 上調(diào)和下調(diào)的差異表達的mRNA

2.3 miRNA 和mRNA的調(diào)控關(guān)系

2.3.1 基于Pearson 相關(guān)的miRNA-mRNA 反向調(diào)控Fold_change 最小的下調(diào)miRNA 為miR-137，在MicroCosm Targets 數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了其對應(yīng)的1991個靶向基因，其中上調(diào)的基因為HOXC4、NPIPL3 和WSB1。miR-137 和HOXC4的相關(guān)系數(shù)為r=-0.5566，P=2.15E-07；miR-137 和NPIPL3的相關(guān)系數(shù)為r=-0.7366，P=4.98E-04；miR-137 和WSB1的相關(guān)系數(shù)為r=-0.7959，P=1.44E-17；miR-137 和這3 個基因呈反向調(diào)控關(guān)系。Fold_change 最大的上調(diào)miRNA為miR-367，在MicroCosm Targets 數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)其對應(yīng)的2045 個靶向基因，其中下調(diào)的基因分別為MEFA 和TNFAIP6。miR-367 和MEFA的相關(guān)系數(shù)為r=-0.7840，P=8.99E-17，miR-367 和TNFAIP6的相關(guān)系數(shù)為r=-0.7627，P=1.85E-15；miR-367 和MEFA 及TNFAIP6 呈反向調(diào)控關(guān)系。

2.3.2 基于廣義典則相關(guān)的miRNA-mRNA 調(diào)控 對于提取出的全部差異表達的上調(diào)和下調(diào)的miRNAmRNA 雙重表達譜數(shù)據(jù)集采用改進的廣義典則相關(guān)分析，結(jié)果顯示，該法可以有效區(qū)分前列腺癌樣本和正常人群樣本，見圖3。根據(jù)第一主成分的權(quán)系數(shù)，提取出與前列腺癌相關(guān)度最高的前10 個miRNA 和前20 個mRNA，見圖4A、圖4B。在這些提取的miRNA 和mRNA 中，有些miRNA 和mRNA 被已有報道證實是與前列腺癌相關(guān)的，如發(fā)現(xiàn)MED13L的第一主成分權(quán)系數(shù)在前列腺癌患者中最高。有研究發(fā)現(xiàn)MED 家族的基因，如MED12的體細胞突變會導(dǎo)致前列腺癌的發(fā)生[5]。對于miRNA，其中miR-29b和miR-29b-1*的第一主成分權(quán)系數(shù)在正常人群中最高。此外，miR-488*的第一主成分權(quán)系數(shù)在前列腺癌患者中最高。按照典則相關(guān)系數(shù)的cutoff 為0.9的標(biāo)準，保留了所有典則相關(guān)系數(shù)大于0.9的miRNA-mRNA 調(diào)控關(guān)系，繪制miRNA 和mRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，其中miR-29b 和miR-29b-1*是網(wǎng)絡(luò)中度最高的兩個結(jié)點（度=21），這兩個miRNAs 在網(wǎng)絡(luò)中調(diào)控的基因數(shù)最多，見圖5。

圖3 基于廣義典則相關(guān)分析的樣本分類

圖4 基于第一主成分權(quán)系數(shù)提取的前列腺癌相關(guān)度最高的生物標(biāo)記

圖5 前列腺癌相關(guān)的miRNA-mRNA 分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

3 討論

前列腺癌是男性生殖系最常見的惡性腫瘤，研究表明分子調(diào)控機制在前列腺癌的預(yù)后和診斷中有著非常重要的作用。本研究對前列腺癌的mRNA 和miRNA的雙重表達譜進行了生物信息學(xué)分析，采用了差異表達分析提取了與前列腺癌相關(guān)的上調(diào)和下調(diào)的miRNA 和mRNA，并通過Pearson 相關(guān)分析和廣義典則相關(guān)分析探討了miRNA 和mRNA的分子調(diào)控機制。廣義典則相關(guān)分析可用于特征降維，特征融合和相關(guān)分析等。將廣義典則相關(guān)分析應(yīng)用于特征miRNA 和mRNA的提取，其中特別結(jié)合了miRNA 和mRNA的靶向失調(diào)關(guān)系作為預(yù)設(shè)矩陣，并根據(jù)miRNA 或mRNA 在第一個成分的權(quán)系數(shù)提取與前列腺癌相關(guān)的特征miRNA 和特征mRNA。

本研究發(fā)現(xiàn)，MED 家族基因MED13L的第一主成分權(quán)系數(shù)在前列腺癌患者中最高。有研究發(fā)現(xiàn)，在局限性前列腺癌患者的異質(zhì)性腫瘤病灶中檢測到體細胞腫瘤變異，發(fā)現(xiàn)cfDNA 突變負荷與疾病嚴重程度相關(guān)。在cfDNA 中發(fā)現(xiàn)了體細胞組織的改變，其中就包括MED 家族中MED12的非同義變異[6]。此外，TRRAP 是本次識別的與前列腺癌高度相關(guān)的基因。TRRAP 曾在陰莖鱗狀細胞癌[7]和卵巢癌中檢測到突變[8]。在通過外顯子測序及Sanger 測序探索66 個家族中140 例患有前列腺癌的日本患者的生殖系變異研究中，除了已知的易感基因BRCA2 和HOXB13 外，還發(fā)現(xiàn)了TRRAP 變體以及BRCA2、HOXB13 和TRRAP的共同變體[9]。

了解癌癥中miRNA的調(diào)控機制對于理解其生理作用以及癌癥相關(guān)功能障礙和失調(diào)的影響至關(guān)重要[10]。近年來的研究表明，miRNAs的異常表達與前列腺癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。雖然已經(jīng)報道了許多miRNAs 可作為前列腺癌治療的新生物標(biāo)記物，但報告的數(shù)據(jù)不一致，仍需進一步實驗[11]。因此，研究前列腺癌相關(guān)的miRNA 及其調(diào)控的靶向基因?qū)τ谧R別前列腺癌相關(guān)的生物標(biāo)記及這些生物標(biāo)記在前列腺癌的臨床應(yīng)用有著十分重要的價值。

本研究發(fā)現(xiàn)，miR-29b 與前列腺癌高度關(guān)聯(lián)，并在miRNA-mRNA 分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中調(diào)控的基因數(shù)最多。目前，已有文獻證實miR-29b 可以阻止前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展。Zhu C等[12]發(fā)現(xiàn)前列腺癌患者腫瘤組織中miR-29b的表達明顯低于癌旁組織，有望成為前列腺癌診斷的新生物標(biāo)志物。Ivanovic RF等[13]研究認為，恢復(fù)miR-29b 水平的治療可能是控制前列腺癌轉(zhuǎn)移的有效方案。Sur S等[14]在瘤內(nèi)注射模擬miR-29b，顯著抑制了裸鼠前列腺癌異種移植瘤的生長，表明miR-29b 可以作為前列腺癌治療的潛在分子，為未來開發(fā)前列腺癌的藥物靶向提供幫助。Vladimir AV等[15]在年輕男性前列腺癌患者的分子特征研究中發(fā)現(xiàn)，miR-29b的表達與老年男性前列腺癌患者顯著不同，這項研究為前列腺癌亞型的分子機制提供了參考。Kato M等[16]的研究表明，miR-29b 與其他五種miRNA 協(xié)同調(diào)節(jié)促進轉(zhuǎn)移的基因（LOXL2），揭示了前列腺癌發(fā)病機制的新分子機制。此外，miR-488 是本研究中發(fā)現(xiàn)的與前列腺癌相關(guān)度最高的前10 個miRNA。miR-488 在多種腫瘤中作為抑癌基因發(fā)揮作用，如乳腺癌、卵巢癌和結(jié)直腸癌等[17-19]。Wang J等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-488 在前列腺癌患者腫瘤組織中的表達低于正常組織，其通過靶向PFKFB3 可以抑制前列腺癌細胞的增殖和糖酵解，因此可能會作為潛在的前列腺癌新的治療靶點。本研究也存在一定的局限性。如數(shù)據(jù)庫中的前列腺癌相關(guān)的miRNA-mRNA 雙重表達譜數(shù)據(jù)集相對很少，因此不能保證分析結(jié)果的穩(wěn)定性；此外，本研究結(jié)果是基于miRNA-mRNA 雙重表達譜數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，識別出的特征miRNA 和mRNA 還需要應(yīng)用分子生物實驗進行驗證。

綜上所述，MED 家族基因MED13L的第一主成分權(quán)系數(shù)在前列腺癌患者中最高，TRRAP 是與前列腺癌高度相關(guān)的基因；miR-29b 與前列腺癌高度關(guān)聯(lián)，并在miRNA-mRNA 分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中調(diào)控的基因數(shù)最多，而miR-488 是與前列腺癌相關(guān)度最高的前10 個miRNA。