宋 崟，張科

（天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院藥劑科，天津 300052）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以結(jié)直腸黏膜連續(xù)性、彌漫性炎癥表現(xiàn)為特點(diǎn)的慢性非特異性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床很難根治。UC 主要癥狀為腹痛、腹瀉、黏液膿血便等，癥狀輕重不等，但多為反復(fù)發(fā)作的慢性病程，嚴(yán)重影響患者的心理、經(jīng)濟(jì)狀況和生活質(zhì)量[1-3]。目前UC 以藥物治療為主，常用藥物有氨基水楊酸類、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等，但這些藥物存在一定的不良反應(yīng)，患者依從性低，治療效果也不理想[4，5]。因此，尋求新的藥物治療靶點(diǎn)，開發(fā)新的高效、低毒的UC 治療藥物成為研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序平臺(tái)及研究方法在疾病基因表達(dá)分析的應(yīng)用，各種疾病的相關(guān)機(jī)制逐漸從基因和分子層面被闡明[6]。本研究采用基于Affymetrix 芯片平臺(tái)的GSE42911 數(shù)據(jù)集，探究潰瘍性結(jié)腸炎（UC）的發(fā)病機(jī)制，為其早期診斷和治療藥物的開發(fā)提供新思路。

1 資料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)獲取 以“Ulcerative Colitis”為關(guān)鍵詞，在Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索與UC 相關(guān)的表達(dá)譜數(shù)據(jù)。選擇GSE42911 芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，該研究是基于GPL15207 平臺(tái)（affymetrix human gene expression array）的芯片，由Kellermayer R 提交。由10 個(gè)樣本構(gòu)成，分別為GSM1053271、GSM1053272、GSM1053273、GSM1053274、GSM1053277、GSM1053268、GSM1053269、GSM1053270、GSM1053275、GSM1053276。其中，前5 個(gè)樣本來(lái)自5 例潰瘍性結(jié)腸炎患者，后5 個(gè)樣本來(lái)自5 名正常人。

1.2 篩選差異基因 GEO2R 是GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中以R語(yǔ)言為基礎(chǔ)的交互式在線分析工具，借助R 語(yǔ)言及Limma 包對(duì)GEO 樣品數(shù)據(jù)行基因差異表達(dá)分析[7]。本研究利用該工具篩選UC 患者和正常人大腸組織的差異基因（DEGs）。以基因倍數(shù)改變（fold change，F(xiàn)C）大于1.5，即|logFC|＞1.5 作為DEGs的篩選標(biāo)準(zhǔn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，除去重復(fù)和無(wú)效基因，得到本芯片的DEGs[8]。采用R 語(yǔ)言繪制DEGs的熱圖和火山圖。

1.3 核心DEGs 篩選與生物學(xué)過(guò)程及信號(hào)通路分析將DEGs 導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)：combined score＞0.4，將分析數(shù)據(jù)以TSV 格式導(dǎo)出，再導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1 軟件中，然后使用軟件的NetworkAnalyzer 進(jìn)行分析。在網(wǎng)絡(luò)中，度值（Degree）表示某一節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)連接邊的數(shù)量[9]；中介中心度（betweenness centrality，BC）表示一個(gè)節(jié)點(diǎn)擔(dān)任其它兩個(gè)結(jié)點(diǎn)之間最短路的橋梁的次數(shù)。BC 值越大，表示節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中的樞紐程度越重要[10]。目前，網(wǎng)絡(luò)分析的主要方法是選擇節(jié)點(diǎn)Degree 值及BC 值高的作為網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[9]。本研究也采用該分析方法，篩選BC＞0.01，Degree＞30的作為UC的核心DEGs。對(duì)大規(guī)?；蜻M(jìn)行功能注釋，包括基因功能富集分析（GO 基因本體論）和基因通路富集分析（KEGG）。GO 分析包括分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular components，CC）和生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）[11，12]。接著將核心DEGs 導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，并限定物種為人，進(jìn)行基因功能注釋分析和功能富集分析，然后導(dǎo)出數(shù)據(jù)，對(duì)生物過(guò)程（P＜0.01）和信號(hào)通路（P＜0.05）進(jìn)行篩選，用R 語(yǔ)言對(duì)GO 和KEGG 富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將得到的核心DEGs 導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)繪制蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（protein-protein interaction，PPI），將分析數(shù)據(jù)以TSV 格式導(dǎo)出，導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1 軟件，繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析；再利用“Generate style from statistics”工具對(duì)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的大小和顏色進(jìn)行設(shè)置。網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)的大小、顏色及其深淺變化代表Degree 值的大小，邊的粗細(xì)反映了Combine Score的大小，從中篩選出Degree 值和接近中心度排名靠前的靶點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選結(jié)果 共篩選出487 個(gè)差異基因，其中上調(diào)465 個(gè)，下調(diào)22 個(gè)。采用R 語(yǔ)言繪制火山圖，見圖1A；繪制前30 位上調(diào)基因和下調(diào)基因的熱圖，見圖1B。

圖1 差異基因篩選結(jié)果

2.2 核心DEGs 篩選與生物學(xué)過(guò)程及信號(hào)通路分析共得到36 個(gè)UC的核心DEGs，包括：UBB、CYCS、GNB2L1、APP、CDC42、SOD1、ACTG1、ISG15、RHOA、ACTR2、B2M、CANX、ATP5B、TXN、ATP5A1、CCT8、PFDN5、RAB11A、RAB7A、HNRNPA2B1、NEDD8、HSPD1、PARK7、TFRC、SDHB、RPL7、PSMA6、PCBP1、ATP5O、ANXA2、RPS27、GDI2、RAC1、CFL1、FAU、PTGES3。功能注釋結(jié)果顯示：36 個(gè)UC 核心DEGs共在53 個(gè)（P＜0.01）GO term 上富集，其中BP18 個(gè)，CC24 個(gè)，MF11 個(gè)。BP 主要富集在Gtpase 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞或亞細(xì)胞成分的運(yùn)動(dòng)、線粒體ATP 合成耦合質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)、ATP 合成耦合質(zhì)子運(yùn)輸、線粒體膜電位的調(diào)節(jié)等；CC 主要富集在胞外外體、胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞外間質(zhì)、局部粘連等；MF 主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、多聚RNA 結(jié)合、質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP 合成酶活性、谷胱甘肽酶活性、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性等，BP、CC、MF的COUNT 得分排名前5的結(jié)果見表1、圖2。KEGG 通路分析顯示：36 個(gè)UC 核心DEGs 共富集在25 條通路上，主要包括：吞噬體、黏著小帶、細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞、沙門氏菌感染、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、白細(xì)胞內(nèi)皮移動(dòng)等，見表2、圖3。

圖3 核心DEGs的KEGG 富集分析

表2 核心DEGs的KEGG 通路分析

圖2 核心DEGs的GO 富集分析圖

表1 核心DEGs的GO 富集分析結(jié)果

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 將核心DEGs 上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，PPI 網(wǎng)絡(luò)圖包含35 個(gè)節(jié)點(diǎn)和171條邊，平均節(jié)點(diǎn)Degree 值為9.77，富集P＜1.0E-16。將網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)以TSV 格式從STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)中導(dǎo)出，然后導(dǎo)入Cytoscape 3.2.1 軟件中，繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，Degree 排名前10的靶點(diǎn)包括RACK1、ACTG1、UBB、CCT8、HSPD1、SOD1、CDC42、PSMA6、CFL1、RPL7，見圖4。

圖4 核心DEGs的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

隨著高通量芯片技術(shù)發(fā)展，利用生物信息學(xué)方法可以更加快速、經(jīng)濟(jì)、高效地篩選出參與疾病發(fā)病機(jī)制的重要基因，為疾病的診斷、治療及藥物設(shè)計(jì)提供依據(jù)。本研究基于生物信息學(xué)分析篩選出UC的487 個(gè)DEGs，上調(diào)基因465 個(gè)，下調(diào)基因22 個(gè)，然后篩選得到36 個(gè)UC 核心DEGs。進(jìn)一步探究了核心DEGs的生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組成，發(fā)現(xiàn)涉及的生物過(guò)程包括：GTP 酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞或亞細(xì)胞成分的運(yùn)動(dòng)、線粒體ATP 合成耦合質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)、ATP 合成耦合質(zhì)子運(yùn)輸、線粒體膜電位的調(diào)節(jié)、胞外外體、胞質(zhì)溶膠、細(xì)胞外間質(zhì)、局部粘連、蛋白質(zhì)結(jié)合、多聚RNA 結(jié)合、質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP 合成酶活性、谷胱甘肽酶活性、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性等，這些與UC的發(fā)生和發(fā)展都有一定的聯(lián)系。KEGG 通路分析顯示主要通路包括：吞噬體、黏著小帶、細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞、沙門氏菌感染、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、白細(xì)胞內(nèi)皮移動(dòng)等。

PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，RACK1、ACTG1、UBB、CCT8、HSPD1、SOD1、CDC42、PSMA6、CFL1、RPL7等靶點(diǎn)是網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點(diǎn)，推測(cè)它們是UC 發(fā)病的關(guān)鍵基因。目前研究顯示，RACK1 通過(guò)控制蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）介導(dǎo)的信號(hào)通路將蛋白錨定在特定亞細(xì)胞位置并調(diào)節(jié)活性，導(dǎo)致下游激酶的激活或失活，從而控制細(xì)胞極性，從動(dòng)力學(xué)角度調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的動(dòng)力。此外，RACK1 基因的過(guò)表達(dá)，調(diào)節(jié)某些癌癥的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)多種不同腫瘤細(xì)胞的侵襲和擴(kuò)散[13]。研究顯示[14]，UC 患者結(jié)腸黏膜中CDC42 水平較正常人顯著升高。CDC42是RhoGTP 酶蛋白家族中的一員，與GTP 結(jié)合后活化的CDC42 可以調(diào)控細(xì)胞黏附、細(xì)胞骨架重排、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移、細(xì)胞膜蛋白物質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷喾N生物學(xué)活動(dòng)[15]。在T 細(xì)胞中，CDC42 過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞骨架的肌動(dòng)蛋白和微管蛋白分極和遷移、分化均有影響[16]。CDC42 還會(huì)使癌細(xì)胞依附于血管壁上，從而使它們通過(guò)血液擴(kuò)散到身體的其他部位。因此，理論上抑制CDC42 蛋白可以使癌細(xì)胞無(wú)法依附于血管內(nèi)壁的內(nèi)皮細(xì)胞上，從而減少其擴(kuò)散的機(jī)會(huì)，這在未來(lái)極有可能成為新的預(yù)防癌細(xì)胞擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)。

綜上所述，RACK1、ACTG1、UBB、CCT8 等基因可能通過(guò)調(diào)控吞噬體、黏著小帶、細(xì)菌侵襲上皮細(xì)胞、沙門氏菌感染、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、白細(xì)胞內(nèi)皮移動(dòng)等信號(hào)通路參與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生發(fā)展。