王 琪 劉茂玄 黃 明 許晨光* 萬曉春*

1(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

2(中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

3(廣東省免疫細(xì)胞治療工程技術(shù)研究中心 深圳 518055)

1 引 言

2020 年，乳腺癌成為全球發(fā)病人數(shù)最多的腫瘤[1]。乳腺癌具有高度的異質(zhì)性，在分子、組織和對(duì)治療的反應(yīng)等方面都有顯著的區(qū)別。隨著對(duì)其分子分型的認(rèn)知加深，三陰乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)作為其中一類獨(dú)立亞型，獲得的關(guān)注度不斷提升[2]。TNBC 是雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長因子三者均為陰性表達(dá)的乳腺癌，TNBC 患者的數(shù)量占全部乳腺癌的 15%～20%，TNBC 具有高侵襲性、易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和預(yù)后差等特點(diǎn)，其患者生存期的中位數(shù)為 9～13 個(gè)月，遠(yuǎn)低于非 TNBC 患者[3]。目前，TNBC 缺少明確的治療方案和有效藥物，臨床上主要依靠化療進(jìn)行治療。然而，化療藥物毒副作用大，且腫瘤細(xì)胞容易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥，導(dǎo)致化療失敗，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。因此，亟需開發(fā)新的治療 TNBC 的方法[4]。

CAR-T 細(xì)胞是通過基因工程改造的 T 細(xì)胞，表達(dá)腫瘤抗原特異性 CAR，通過將抗原抗體結(jié)合機(jī)制和 T 細(xì)胞的殺傷作用相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷，且不受人類白細(xì)胞抗原的限制[5]。CAR-T 在血液瘤上的巨大成功，增強(qiáng)了將其用于治療實(shí)體瘤的信心[6]。應(yīng)用 CAR-T 治療TNBC 已有初步探索，且顯示了積極的效果[7]。間皮素(Mesothelin)是一種腫瘤相關(guān)抗原，在大多數(shù)惡性胸膜間皮瘤、胰腺癌等實(shí)體腫瘤中高表達(dá)，在正常組織中幾乎不表達(dá)，是一個(gè)潛力巨大的 CAR-T 治療靶點(diǎn)[8]。Mesothelin 在 TNBC中高表達(dá)，且該高表達(dá)和 TNBC 的進(jìn)程呈正相關(guān)[9-10]，因此，Mesothelin CAR-T 用于治療 TNBC具有一定的前景和潛力。目前，兩個(gè) Mesothelin CAR-T 治療 TNBC 的臨床試驗(yàn)正在開展[7]。

抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域是賦予 CAR-T 特異性識(shí)別靶抗原的部分，直接影響 CAR-T 的功能。通?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域是通過一個(gè)柔性的 Linker，將單克隆抗體的可變重鏈(VH)和輕鏈(VL)連接而形成的 scFv。從已有的公開數(shù)據(jù)來看，在臨床領(lǐng)域開發(fā)的 Mesothelin CAR-T，大多使用小鼠單克隆抗體 SS1 來源的 scFv 作為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域[8]。在治療實(shí)體腫瘤病人的臨床試驗(yàn)中，Mesothelin CAR-T 雖然展現(xiàn)出良好的安全性，但是治療效果有限，原因可能是小鼠來源的 scFv 序列引起患者體內(nèi)產(chǎn)生抗 CAR 的抗體[11]。此外，scFv 在CAR-T 細(xì)胞上還存在不易正確折疊、容易聚集、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)[12]。羊駝來源的單域抗體 VHH是目前已知的最小抗原結(jié)合片段，作為 CAR-T 的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，VHH 具有分子量小、容易表達(dá)、穩(wěn)定性好、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)[13]。目前，在治療多發(fā)性骨髓瘤的臨床試驗(yàn)中，靶向 B 細(xì)胞成熟抗原的 VHH CAR-T 展現(xiàn)出優(yōu)異的治療效果，客觀緩解率高達(dá) 97%[14]，但尚無 VHH 來源的Mesothelin CAR-T 的相關(guān)報(bào)道，以 VHH 作為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的 Mesothelin CAR-T 是否具有靶向殺傷功能尚不明確，基于親和力相似的 scFv 和VHH 序列構(gòu)建的 Mesothelin CAR-T 殺傷功能是否有差異也未知。本研究分別以兩個(gè)親和力相似的靶向 Mesothelin 的抗體(scFv、VHH)序列作為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建相應(yīng)的 CAR-T 細(xì)胞，并對(duì)比兩種 CAR-T 細(xì)胞對(duì) TNBC 細(xì)胞系的殺傷效果，為后續(xù)治療 TNBC 的 Mesothelin CAR-T 的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 材料

本研究所用穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒均由中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院免疫治療研究室保存；人胚腎 293T 細(xì)胞系和 MDA-MB-231 細(xì)胞系來自美國菌種保藏中心(ATCC)；RPMI-1640 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、0.25% 胰蛋白酶和磷酸鹽緩沖液均購于美國 Hyclone 公司；KBM 581 培養(yǎng)基購于康寧公司；青霉素/鏈霉素雙抗購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；胎牛血清和 Opti-MEM 培養(yǎng)基均購于美國 Gibco 公司；PEIpro DNA 轉(zhuǎn)染試劑購于法國 Polyplus Transferion 公司；Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 購于美國 Thermo Fisher Scientific 公司；IL-2 購于近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；人 Cytometric Bead Array(CBA)Th1/Th2 細(xì)胞因子試劑盒購于美國BD 公司；6 孔板和 48 孔板均購于無錫耐思生物科技有限公司；10 mL、20 mL 一次性注射器購于上海雙鴿醫(yī)療器械有限公司；CD3、CD4、CD8 等流式抗體購于美國 Biolegend 公司；超濾柱和 0.45 μm 一次性針頭式過濾器購于英國頗爾公司；實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析儀購于美國安捷倫公司，型號(hào)為 xCELLigence RTCA SP；分析型流式細(xì)胞儀購于美國貝克曼公司，型號(hào)為CytoFLEX；分選型流式細(xì)胞儀購于美國 BD 公司，型號(hào)為 BD FACSAriaIII。

2.2 方法

2.2.1 靶向 Mesothelin 的 scFv CAR 與 VHH CAR載體的構(gòu)建

靶向 Mesothelin 的 scFv 序列來源于 SS1 抗體(US Patent: US7081518)，靶向 Mesothelin的 VHH 序列來源于 Nb-A1 抗體(US Patent：US20180002439A1)。CAR 片段由 scFv 序列或VHH 序列依次連接人源 CD8α、4-1BB 和 CD3ζ鏈組成，CAR 基因由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成，通過 T4 連接酶將 CAR 片段插入EcoR I 和 BamH I 限制性內(nèi)切酶剪切的慢病毒載體上。

2.2.2 慢病毒制備

第一天，將狀態(tài)良好的 293T 細(xì)胞平鋪于 6孔板中，每孔 5×105細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到 70%～80% 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)，首先利用 Opti-MEM 培養(yǎng)基配制包裝質(zhì)粒 psPAX2、包膜質(zhì)粒 pMD2.G 和穿梭質(zhì)?；旌弦?，然后將 PEIpro 加入混合液中靜置 15 min，最后將其滴加到前一天接種的細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)6～8 h 后更換新培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染 48 h 后，收集上清液，取 2 000 g 離心 5 min，0.45 μm 濾膜過濾得到病毒原液。將病毒原液加入分子量截?cái)嘀禐?100 kDa 的超濾柱中，在 4 ℃ 條件下，3 220 g 離心 30 min，收集濃縮 5～10 倍的病毒濃縮液。

2.2.3 CAR-T 細(xì)胞的制備和培養(yǎng)

抽取 20 mL 健康志愿者外周靜脈血，置于無菌的乙二胺四乙酸抗凝采血管中，按照 1∶1 的比例加入無菌磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Solution，PBS)，輕晃混勻，另取一個(gè) 50 mL 無菌離心管，加入 15 mL 外周血淋巴細(xì)胞分離液。將稀釋后的血液傾倒于淋巴細(xì)胞分離液的液面上，2 110 r/min 離心 30 min；用無菌移液管吸取中間白膜層至另一無菌 50 mL 離心管中，添加無菌 PBS 至 50 mL，1 800 r/min 離心 5 min，收集沉淀的外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC)。PBMC 計(jì)數(shù)后，按1∶1 的比例加入相應(yīng)數(shù)量的 CD3/CD28 磁珠，用含有 1% 胎牛血清和 200 U/mL IL-2 的 KBM 581培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于 5% CO2、37 ℃ 的培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)。激活 T 細(xì)胞 24～48 h 后，按照培養(yǎng)液與病毒濃縮液 1∶1 的比例加入病毒濃縮液，再補(bǔ)加相應(yīng)的 IL-2。病毒感染 24 h 后，300 g 離心3 min，更換新鮮培養(yǎng)基，之后根據(jù)細(xì)胞的生長密度，每隔 2～3 d 傳代擴(kuò)大培養(yǎng)，共培養(yǎng) 7～8 d。

2.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測 scFv CAR-T 與 VHH CAR-T 細(xì)胞陽性率

收集對(duì)照組 T 細(xì)胞(UTD)及兩種 CAR-T 細(xì)胞 1×105個(gè)/管，1 500 r/min 離心 5 min 后棄上清液，用 PBS 清洗后再用 100 μL PBS 重懸細(xì)胞。對(duì)于 scFv CAR-T 細(xì)胞，加入生物素標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG(Fab 段)抗體作為一抗進(jìn)行染色，對(duì)于 VHH CAR-T 細(xì)胞，加入生物素標(biāo)記的羊抗羊駝 IgG(Fab 段)抗體作為一抗進(jìn)行染色，同時(shí)以 UTD 細(xì)胞作為對(duì)照進(jìn)行同樣染色。在 4 ℃ 避光孵育一抗 30 min 后，用 PBS 清洗兩次，然后加入 APC-Streptavidin 抗體作為二抗，將二抗在 4 ℃避光孵育 30 min 后用 PBS 清洗兩次，最后利用200 μL PBS 重懸細(xì)胞，以 UTD 細(xì)胞作為對(duì)照，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測 CAR-T 的陽性率。

2.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測 CAR-T 細(xì)胞中 CD4＋和CD8＋細(xì)胞亞群

采用第 2.2.4 小節(jié)的方法收集 UTD 細(xì)胞和CAR-T 細(xì)胞，在每種細(xì)胞中加入 CD3(FITC)、CD4(BV510)和 CD8(APC-Cy7)抗體，于 4 ℃孵育 30 min 后用 PBS 清洗兩次，接著用 200 μL PBS 重懸細(xì)胞，最后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測 UTD和 CAR-T 細(xì)胞中 CD4＋和 CD8＋亞群的比例。

2.2.6 過表達(dá) Mesothelin 的 MDA-MB-231 靶細(xì)胞的構(gòu)建

采用第 2.2.2 小節(jié)的方法制備和濃縮慢病毒原液，然后感染 MDA-MB-231 細(xì)胞。感染24 h 后更換新鮮培養(yǎng)基，感染 72 h 后將細(xì)胞用Mesothelin(PE)的抗體染色，于 4 ℃ 孵育 30 min后用 PBS 清洗兩次，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)細(xì)胞系中 Mesothelin 的表達(dá)情況，利用分選型流式細(xì)胞儀分選出過表達(dá) Mesothelin 的 MDAMB-231 細(xì)胞(MDA-MB-231-Mesothelin)作為后續(xù)的靶細(xì)胞。

2.2.7 實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析技術(shù)(RTCA)檢測CAR-T 對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效果

第一天，取每 100 μL 含有 5×104個(gè) MDAMB-231 細(xì)胞和 MDA-MB-231-Mesothelin 細(xì)胞的混合物 100 μL 平鋪于 RTCA 板中；第二天，按 4∶1、 2∶1 和 1∶1 的效靶比，將 UTD 細(xì)胞和兩種 CAR-T 細(xì)胞依次加入第一天的 RTCA 板中，補(bǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基至 200 μL，每 15 min 監(jiān)測一次細(xì)胞生長指數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線。結(jié)束監(jiān)測后，取細(xì)胞上清液檢測細(xì)胞因子的分泌水平，收集殺傷后的各組 T 細(xì)胞染相應(yīng)的抗體，分析其CD69、CD107a 和 PD-1 的表達(dá)情況。

2.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測 CAR-T 殺傷上清液中細(xì)胞因子分泌水平

取殺傷 48 h 后的細(xì)胞培養(yǎng)液置于干凈的 EP管內(nèi)，在 4 ℃ 的條件下，300 g 離心 5 min，取上清液進(jìn)行檢測。根據(jù)試劑盒說明書，使用人Th1/Th2 細(xì)胞因子試劑盒檢測殺傷上清液中細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α)的含量。先將試劑盒里的 3 種微球(IFN-γ、IL-2、TNF-α)按所需量混合，室溫下與增強(qiáng)液避光孵育 30 min，然后分別加入待測樣品、微球和抗體檢測試劑進(jìn)行混合，室溫下避光孵育 3 h，最后用 PBS 清洗兩次，200 μL PBS 重懸細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞因子的含量。

2.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用 Flowjo 7.6 進(jìn)行流式結(jié)果分析，使用 GraphPad Prism 8 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用“”表示。兩組間參數(shù)的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間差異比較采用 ANOVA 單因素方差分析，以P＜0.05 或P＜0.01 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 成功構(gòu)建過表達(dá) Mesothelin 的 MDAMB-231 靶細(xì)胞

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，MDA-MB-231細(xì)胞系幾乎不表達(dá) Mesothelin(圖 1)，與其他文獻(xiàn)的結(jié)論一致[15]，因此，MDA-MB-231 細(xì)胞系可以作為 Mesothelin 靶點(diǎn)陰性細(xì)胞系用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)還包裝了過表達(dá) Mesothelin 的慢病毒，并成功感染了 MDA-MB-231 細(xì)胞系，通過流式分選成功獲得了過表達(dá) Mesothelin 的 MDAMB-231 靶細(xì)胞(MDA-MB-231-Mesothelin)，MDA-MB-231-Mesothelin 細(xì)胞中 Mesothelin 的表達(dá)水平如圖 1 所示。由圖 1 可知，該靶細(xì)胞系被成功構(gòu)建，其可作為靶向 Mesothelin CAR-T 的靶點(diǎn)陽性細(xì)胞，為后續(xù)體外殺傷實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。

圖1 MDA-MB-231 和 MDA-MB-231-Mesothelin 細(xì)胞Mesothelin 的表達(dá)情況Fig. 1 The expression of Mesothelin on MDA-MB-231 and MDA-MB-231-Mesothelin cells

3.2 成功構(gòu)建靶向 Mesothelin 的 scFv CAR-T和 VHH CAR-T 細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)基于經(jīng)典的二代 CAR 結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了靶向 Mesothelin 的 scFv CAR 和 VHH CAR 慢病毒載體。其中，scFv 序列來源于 SS1 抗體(US Patent: US7081518)，其平衡解離常數(shù)(KD)值為11 nM[16]，VHH 序列來源于 Nb-A1 抗體(US Patent: US20180002439A1)，其 KD 值為 15 nM。具體的 CAR 結(jié)構(gòu)如圖 2(a)所示，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域后，依次連接人源的 CD8α 作為鉸鏈區(qū)和跨膜段，4-1BB 作為共刺激分子，CD3ζ 鏈作為 T 細(xì)胞活化基序。經(jīng)過限制性內(nèi)切酶鑒定和蘇州金唯智有限公司測序驗(yàn)證，結(jié)果符合預(yù)期，表明成功構(gòu)建慢病毒質(zhì)粒。

使用上述質(zhì)粒包裝的慢病毒轉(zhuǎn)染健康志愿者T 細(xì)胞，分別制備 scFv CAR-T 和 VHH CAR-T 細(xì)胞，培養(yǎng)至第 6 天，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測 CAR-T細(xì)胞表面 CAR 的表達(dá)率，檢測結(jié)果如圖 2(b)所示。其中，scFv CAR-T 細(xì)胞陽性率約為 57%，VHH CAR-T 細(xì)胞陽性率約為 59%，表明 CAR-T細(xì)胞制備成功，scFv 和 VHH 來源的 CAR 均能夠在 T 細(xì)胞上良好表達(dá)。對(duì) UTD 和兩種 CAR-T 細(xì)胞中 CD4＋和 CD8＋亞群的比例情況進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖 3 所示。由圖 3 可知，與 UTD 細(xì)胞(P＜0.01)相比，兩種 CAR-T 細(xì)胞中 CD3＋CD8＋細(xì)胞的比例較高，而 CD3＋CD4＋細(xì)胞的比例較低。此外，制備的兩種 CAR-T 細(xì)胞中 CD3＋CD4＋和 CD3＋CD8＋亞群比例近似。這說明與未轉(zhuǎn)病毒的 UTD 細(xì)胞相比，制備的 CAR-T 的 CD8＋細(xì)胞的比例會(huì)顯著提高，CAR 結(jié)構(gòu)中抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(scFv 和 VHH)的不同，并未影響 CAR-T細(xì)胞中 CD4＋和 CD8＋亞群的比例情況。

圖2 scFv CAR-T 與 VHH CAR-T 細(xì)胞的構(gòu)建Fig. 2 Construction of scFv CAR-T and VHH CAR-T cells

圖3 CAR-T 細(xì)胞 CD4＋ 和 CD8＋亞群的比例Fig. 3 The proportion of CD4＋ and CD8＋ in CAR-T cells

3.3 CAR-T 細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的體外殺傷效果對(duì)比

利用 RTCA 監(jiān)測腫瘤細(xì)胞生長曲線的變化，檢測不同效靶比的 CAR-T 細(xì)胞和 UTD 細(xì)胞對(duì)靶點(diǎn)陽性的 MDA-MB-231-Mesothelin 細(xì)胞的殺傷效果。殺傷約 48 h 后，殺傷結(jié)果如圖 4(a)和4(b)所示，在不同效靶比的條件下，scFv CAR-T和 VHH CAR-T 均能夠有效殺傷靶細(xì)胞，當(dāng)效靶比為 2∶1 和 1∶1 時(shí)，VHH CAR-T 對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效果顯著優(yōu)于 scFv CAR-T(P＜0.05)。此外，還檢測了不同效靶比的 CAR-T 細(xì)胞和 UTD細(xì)胞對(duì)靶點(diǎn)陰性的 MDA-MB-231 細(xì)胞的殺傷效果。殺傷結(jié)果如圖 4(c)和 4(d)所示，當(dāng)效靶比相同時(shí)，CAR-T 細(xì)胞和 UTD 細(xì)胞對(duì)靶點(diǎn)陰性的 MDA-MB-231 細(xì)胞的殺傷效果幾乎沒有差別。這說明 scFv CAR-T 和 VHH CAR-T 不能殺傷靶點(diǎn)陰性的細(xì)胞系，其殺傷作用是靶點(diǎn)特異的。

圖4 CAR-T 對(duì)靶點(diǎn)陽性和陰性細(xì)胞系的體外殺傷Fig. 4 Cytotoxicity of CAR-T against target-negative and target-positive cells

3.4 CAR-T 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子情況

將 CAR-T 細(xì)胞和靶點(diǎn)陽性細(xì)胞以 2∶1 的效靶比共同孵育 48 h 后，收取培養(yǎng)液上清，使用 CBA 法對(duì) CAR-T 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子 IFN-γ、IL-2、TNF-α 進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果如圖 5 所示，scFv CAR-T 和 VHH CAR-T 均能分泌大量的IFN-γ、IL-2、TNF-α，較 UTD 組具有顯著差異(P＜0.05)，這表明兩種 CAR-T 均被靶點(diǎn)陽性細(xì)胞有效激活，進(jìn)一步證實(shí)了 CAR-T 的靶向殺傷功能。雖然 VHH CAR-T 比 scFv CAR-T 對(duì)靶細(xì)胞的殺傷能力更強(qiáng)，但兩者分泌的細(xì)胞因子的量無顯著性差異(P＞0.05)。

圖5 CAR-T 殺傷靶細(xì)胞后細(xì)胞因子分泌情況Fig. 5 Cytokine secretion of CAR-T cell after killing target cells

3.5 CAR-T 細(xì)胞表達(dá) CD69、CD107a 和 PD-1的情況

將 CAR-T 細(xì)胞和靶點(diǎn)陽性細(xì)胞以 2∶1 的效靶比共同孵育 24 h 后，收集 T 細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組 T 細(xì)胞的活化標(biāo)記物 CD69、脫顆粒標(biāo)記物 CD107a 以及免疫抑制分子 PD-1 的表達(dá)水平，觀察 CAR-T 細(xì)胞的活化情況。檢測結(jié)果如圖 6 所示，兩種 CAR-T 細(xì)胞中 CD69、CD107a 和 PD-1 的表達(dá)水平顯著高于 UTD 組(P＜0.01 或P＜0.05)。VHH CAR-T 組中CD69、CD107a 的表達(dá)水平顯著高于 scFv CAR-T 組(P＜0.01)，這表明 VHH CAR-T 在被靶細(xì)胞激活后的活化水平更高，同時(shí)也部分解釋了 VHH CAR-T 的殺傷效果優(yōu)于 scFv CAR-T。此外，VHH CAR-T 組中 PD-1 的表達(dá)水平略高于 scFv CAR-T 組，但是二者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖6 CAR-T 殺傷靶細(xì)胞后 CD69、CD107a 和 PD-1 的表達(dá)情況Fig. 6 CD69, CD107a and PD-1 expression on CAR-T cellafter killing target cells

4 討論與分析

目前，CAR-T 對(duì)于 TNBC 的臨床治療效果不佳，患者預(yù)后較差，迫切需要開發(fā)新型的TNBC 治療方法。而 CAR-T 免疫細(xì)胞療法，在血液系統(tǒng)腫瘤的治療中取得了革命性的成功，因此，針對(duì)多個(gè)不同靶點(diǎn)的 CAR-T 免疫細(xì)胞療法也被嘗試用于治療 TNBC，并取得了一定的進(jìn)展[17]。Mesothelin 靶點(diǎn)特異性地在 TNBC 中高表達(dá)，不在非 TNBC 中高表達(dá)，且該高表達(dá)和 TNBC 的進(jìn)程呈正相關(guān)[9]，因此，Mesothelin靶點(diǎn)作為一個(gè)治療 TNBC 的 CAR-T 靶點(diǎn)受到越來越多的關(guān)注。使用基于抗體和 CAR-T 的策略靶向 Mesothelin 過表達(dá)的腫瘤的臨床試驗(yàn)，已經(jīng)顯示出初步的安全性和潛在的效果，說明了該靶點(diǎn)的安全性較好[8,18]。在臨床前的研究中，賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院的 Tchou 等[9]曾證實(shí)靶向Mesothelin CAR-T 細(xì)胞能有效殺傷 Mesothelin高表達(dá)的原代 TNBC 細(xì)胞，因此，Mesothelin CAR-T 在治療 TNBC 方面具有較大的潛力。目前，有兩個(gè) Mesothelin CAR-T 治療 TNBC 的臨床試驗(yàn)正在開展中，結(jié)果未知[7]。Mesothelin CAR-T 在臨床治療 TNBC 病人方面的前景較好，但 Mesothelin CAR-T 也可能會(huì)面臨其他現(xiàn)有靶點(diǎn) CAR-T 治療 TNBC 遇到的一些問題[17]，如腫瘤抗原異質(zhì)性導(dǎo)致的腫瘤逃逸、腫瘤免疫抑制微環(huán)境導(dǎo)致的 CAR-T 細(xì)胞耗竭等。如遇到這些問題，可根據(jù) Mesothelin CAR-T 臨床試驗(yàn)的結(jié)果，在 Mesothelin CAR-T 的基礎(chǔ)上進(jìn)行相應(yīng)的設(shè)計(jì)和改造，如雙抗原或多抗原識(shí)別的CAR-T、“武裝”細(xì)胞因子的 CAR-T 等，以進(jìn)一步提高療效。

目前，用于開展臨床試驗(yàn)的 Mesothelin CAR-T 中的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，大多數(shù)來源于小鼠單克隆抗體 SS1[16]，但就 Mesothelin CAR-T治療實(shí)體腫瘤的臨床數(shù)據(jù)來看，SS1 來源的Mesothelin CAR-T 療效不佳。賓夕法尼亞大學(xué) Haas 等[11]進(jìn)行了 SS1 Mesothelin CAR-T 治療 15 名實(shí)體腫瘤患者的臨床 I 期試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示，患者的最佳療效為疾病穩(wěn)定(11/15)，14 名患者中，8 人的血液均檢測到抗 CAR 的抗體，這可能是該臨床試驗(yàn)效果不佳的原因之一。因此，他們準(zhǔn)備以人源化的抗體序列Mesothelin CAR-T 進(jìn)行臨床試驗(yàn)，對(duì)于人源化的 scFv CAR-T 是否會(huì)引起免疫原性，目前尚不清楚。單域抗體 VHH 因其分子量小、穩(wěn)定性好、免疫原性低等特點(diǎn)，比 scFv 更適合做 CAR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域[12-13]，已有多個(gè)針對(duì)不同腫瘤靶點(diǎn)的 VHH CAR-T 在臨床前或臨床開發(fā)階段，但尚未有 VHH 來源的 Mesothelin CAR-T 被報(bào)道[19-20]。

本研究尋找到一個(gè)與 SS1 抗體(KD＝11 nM)親和力相近的靶向 Mesothelin VHH 抗體(KD＝15 nM)，并將此 VHH 作為 CAR-T 的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與 SS1 抗體來源的 scFv 進(jìn)行對(duì)比。研究發(fā)現(xiàn)，制備的 VHH CAR-T 能夠靶向殺傷 Mesothelin 過表達(dá)的 TNBC 細(xì)胞，而對(duì)靶點(diǎn)Mesothelin 不表達(dá)的陰性細(xì)胞系無殺傷效果，證明該 VHH CAR-T 具有特異性殺傷功能，這是迄今為止，國內(nèi)外報(bào)道的第一個(gè) VHH 來源的靶向 Mesothelin 的 CAR-T，證實(shí)了 VHH 可以作為Mesothelin CAR-T 的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。與臨床上常用的 SS1 來源的 scFv CAR-T 相比，在體外殺傷 Mesothelin 陽性靶細(xì)胞的效果方面，VHH CAR-T 強(qiáng)于 scFv CAR-T，同時(shí)可表達(dá)更高水平的 CD69 和 CD107a，活化程度更高。在一定范圍內(nèi)，CAR 對(duì)靶點(diǎn)的親和力會(huì)影響 CAR-T 的殺傷功能[21]。當(dāng) VHH 和 scFv 對(duì)靶點(diǎn) Mesothelin的親和力相近時(shí)，VHH CAR-T 殺傷效果更好，可能是由于 VHH 和 scFv 靶向腫瘤抗原的表位不同，有研究發(fā)現(xiàn)，靶向 Mesothelin 膜近側(cè)區(qū)比遠(yuǎn)側(cè)區(qū)的 CAR-T 殺傷效果更好[15]。此外，VHH CAR-T 殺傷效果更好，可能與 VHH 在 CAR-T細(xì)胞上的表達(dá)更穩(wěn)定有關(guān)[13]。

CAR-T 療法的局限性之一是腫瘤細(xì)胞會(huì)發(fā)生抗原逃逸，從而對(duì)單抗原靶向的 CAR-T 產(chǎn)生耐藥。為降低 CAR-T 細(xì)胞治療腫瘤的復(fù)發(fā)率，提高治療效果，現(xiàn)有方法主要依賴于靶向多種抗原，如構(gòu)建串聯(lián)的雙 CAR (Tandem CAR)[22]。在臨床試驗(yàn)中，CD19/CD22 串聯(lián)雙 CAR 的 CAR-T表現(xiàn)出較好的療效[23]；在臨床前動(dòng)物模型中，靶向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的 HER2 和 IL13Ra2 的串聯(lián)雙 CAR 的效果得到驗(yàn)證[24]。在設(shè)計(jì)串聯(lián)雙CAR 時(shí)，兩個(gè) scFv 序列在同一個(gè) CAR 分子上表達(dá)，容易導(dǎo)致 VH鏈和 VL鏈的錯(cuò)配，以及蛋白聚集和錯(cuò)誤折疊等，嚴(yán)重影響 CAR-T 細(xì)胞發(fā)揮功能。與傳統(tǒng)的 scFv 相比，在構(gòu)建串聯(lián)雙 CAR時(shí)，單域抗體 VHH 具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)。VHH只有一條重鏈，具有所占空間較小、更容易表達(dá)、更穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)，更適用于串聯(lián)雙 CAR 的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域[13]。綜上所述，本研究為后續(xù)基于Mesothelin 靶點(diǎn)的雙靶向或多靶向 CAR-T 的設(shè)計(jì)和研究奠定了良好的研究基礎(chǔ)。

5 結(jié) 論

以靶向 Mesothelin 的 scFv 和 VHH 分別作為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，本研究構(gòu)建了 scFv CAR-T 和VHH CAR-T 細(xì)胞，并對(duì)兩種 CAR-T 細(xì)胞在體外殺傷 TNBC 細(xì)胞系的能力進(jìn)行測試。結(jié)果顯示，VHH CAR-T 體外殺傷效果優(yōu)于臨床試驗(yàn)常用的scFv CAR-T。這是目前報(bào)道的第一個(gè)基于 VHH序列構(gòu)建的 Mesothelin CAR-T，為 Mesothelin CAR-T 的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，具有重要意義。