楊 彬，扈友莊，黃志文

(廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院老年醫(yī)學科，湛江 524000；*通訊作者,E-mail:Huangzw1978@126.com)

糖尿病是一種全球范圍內高發(fā)的代謝障礙疾病[1]，其中2型糖尿病(type 2 diabetes, T2DM)占糖尿病病例的95%[1-3]。研究顯示，治療T2DM的一種胰高血糖素樣肽-1受體激動劑利拉魯肽(liraglutide, LIR)，可改善糖尿病大鼠β細胞損傷和骨代謝失衡[4,5]。然而其內在機制并不清楚。

骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchyml stem cell, BMSC)來源的外泌體(Exosome, Exo)(BMSC-Exo)在治療和改善糖尿病和代謝調節(jié)中發(fā)揮關鍵作用[6-8]。研究表明BMSC-Exo中miR-31a-5p/E2F2信號軸是骨代謝失衡的關鍵調節(jié)信號[9-12]。另外，LIR可改變切除卵巢的T2DM大鼠BMSC-Exo攜帶的miRNA[13]。然而，BMSC-Exo中miR-31a-5p/E2F2信號軸是否在LIR治療T2DM的過程中發(fā)揮作用并不清楚。因此，本研究探討LIR對T2DM大鼠體內BMSC外泌體中miR-31a-5p/E2F2的影響，以及miR-31a-5p/E2F2參與治療或改善T2DM的β細胞損傷和骨代謝失衡的效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific)；超高速離心機(德國Herolab公司)；透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)。LIR(諾和諾德(中國)制藥有限公司，國藥準字J20110026)；鏈脲佐菌素STZ(美國Sigma)，DispaseⅡ酶(上海翊圣生物科技有限公司)；聚偏二氟乙烯膜(美國Millipore Corporation)；ALP活性測定試劑盒，兔抗CD9、CD63、RANK、E2F2、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP-2)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的第一抗體(英國Abcam公司)；SuperSignal West Pico化學發(fā)光底物和Dounce勻漿器(美國Thermo Fisher Scientific)。miRNA擬似物(miR-mimic)(上海吉凱基因科技有限公司)，qPCR引物(北京天根生物化學有限公司)。蛋白抽提試劑盒、化學發(fā)光試劑盒(美國賽默飛公司)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)、蛋白濃度測定試劑盒、TUNEL試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；反轉錄試劑盒(日本TaKaRa公司)。

1.2 動物和分組

50只6周齡SD雄性大鼠來源于廣東醫(yī)學院實驗動物中心(合格證書編號：(粵)2002A013號)。動物飼養(yǎng)于23～25 ℃的光照/黑暗周期為12 h的環(huán)境中，每2只動物飼養(yǎng)于1個籠子，活動不受限制，且可以自由采食和飲水(生產許可證：SCXK(粵)2009-0039，飼養(yǎng)設施許可證號：SSXK(粵)2019-2029)。本研究中的所有動物操作程序均經我院動物倫理委員會批準(審批號：2020092號)。

將50只大鼠數字隨機表法分為5組：LIR+miR-mimic+T2DM組、LIR+T2DM組、T2DM組、control組、LIR組，每組10只。LIR+miR-mimic+T2DM組給予高脂高糖飲食(20%蔗糖，15%黃油，10%的蛋黃粉，2%的膽固醇和73%的基礎食品)，高脂高糖飲食開始的同時，靜脈注射0.2 mg/kg的LIR，2次/d，并且同時靜脈注射2 μmol/L的miR-mimic，1次/7 d，LIR和miR-mimic注射均持續(xù)2個月，高糖飲食2個月后，向大鼠腹膜內注射35 mg/kg的STZ 2次(間隔3 d)。LIR+T2DM組不注射miR-mimic，而T2DM組不注射miR-mimic和LIR，其余操作方法同LIR+miR-mimic+T2DM組。control組接受標準實驗動物飲食(脂肪3%，蛋白質20%，碳水化合物55%)，不進行任何藥物和誘導的干預。LIR組接受標準實驗動物飲食，其余操作同LIR+T2DM組。LIR+miR-mimic+T2DM組、LIR+T2DM組、T2DM組高脂高糖飲食開始后3 d檢測大鼠尾靜脈血糖，隨機血糖<16.7 mmol/L的大鼠剔除實驗。以下所提到的實驗方法均是按此分組進行。

1.3 骨髓的分離

誘導和給藥結束后，將5組大鼠吸入2%異氟烷3 h進行安樂死。經過酒精徹底消毒全身后在雙側股骨下端皮膚開小口，充分暴露股骨及脛骨；用鑷子提起并剪下雙側股骨，在無菌磷酸鹽緩沖鹽水中沖洗雙側股骨，去除附著的脂肪組織、結締組織和骨膜，進行骨髓提取。解剖附骨后，用裝有2 ml無菌PBS溶液的注射器沖洗每個股骨的骨髓，反復打成均勻的懸浮液，然后將懸浮液轉移至無RNase的離心EP管中，并保存在-80 ℃。

1.4 BMSC-外泌體的制備與鑒定

1.4.1 BMSC-外泌體的制備 取4 ml 1.3中5組的懸浮液于15 ml離心管中，于4 ℃下以2 000g離心5 min后，轉移上清至新的15 ml離心管。重復該步驟，依次以3 500g離心15 min、10 000g離心30 min、120 000g離心140 min。最后一次離心完成后，棄去上清，用4 ml無菌PBS將沉淀重新懸浮，用0.22 μmol/L無菌過濾器過濾，轉入5 ml離心管中，在4 ℃下以120 000g離心70 min。離心后棄去上清，離心管底部殘留的微量沉淀即為BMSC-外泌體。加入100 μl的無菌PBS懸浮液，放置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 外泌體的鑒定 取10 μl外泌體懸液，滴入載樣銅網中，保留1.5 min，滴加2%醋酸雙氧乙鈾溶液染色1 min后，用濾紙吸干，再在室溫下晾1 min。將載樣銅網置于樣品室，使用透射電子顯微鏡觀察和拍照，并測量外泌體直徑。

1.4.3 外泌體表面標記蛋白分析 分別取各組等體積的BMSC-外泌體，使用蛋白抽提試劑盒提取總蛋白，并采用BCA法測定蛋白濃度。采用蛋白免疫印跡法檢測BMSC-外泌體的表面標記蛋白CD9和CD63，取BMSC蛋白和BMSC-外泌體蛋白進行SDS-PAGE，每個樣品設置6個復孔，每孔加入的總蛋白量相同；將凝膠上的蛋白濕轉到硝酸纖維素膜上，加入2%牛血清白蛋白于室溫下封閉2 h，然后加入兔抗鼠CD9、CD63一抗，于4 ℃孵育過夜，抗體使用比例分別為1 ∶800、1 ∶500；使用TBST溶液漂洗后加入辣根過氧化物酶標記IgG二抗，抗體使用比例為1 ∶1 000，于室溫下孵育1 h，再次用TBST溶液漂洗，根據化學發(fā)光試劑盒說明進行顯色。拍照后采用Image-J圖像處理軟件處理圖片。

1.5 分離胰腺β細胞

誘導和給藥結束后，將5組大鼠麻醉并在無菌條件下安樂死。用無菌磷酸鹽緩沖鹽水沖洗胰腺，取3只新鮮胰島組織用于標志物檢測。剩余組織用剪刀剪碎后加入以DispaseⅡ酶進行消化，使用新鮮配制的無菌D-Hanks液清洗，用PBS液調整細胞密度為5×103/100 μl，作為胰腺β細胞凋亡實驗的準備。

1.6 TUNEL實驗檢測β細胞的凋亡

用TUNEL檢測試劑盒檢測β細胞的凋亡。細胞統(tǒng)計TUNEL陽性細胞核的數量和總細胞核數。每組3個載玻片中隨機選擇5個高倍視野(×200)來評估細胞凋亡率。

1.7 破骨細胞標記物RANK的免疫組化檢測

將1.3中分離的骨髓組織制作石蠟塊。切片后取石蠟切片，加入抗原修復液進行抗原修復。加入兔抗鼠的RANK一抗(抗體使用比例分別為1 ∶800)孵育20 min，用PBS洗滌3次，加入生物素標記山羊抗兔IgG二抗(抗體使用比例為1 ∶2 000)孵育2 h。根據DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒說明進行顯色。顯色后用蒸餾水沖洗，再使用蘇木精復染，于顯微鏡下觀察，拍照后采用Image-Pro plus 6.0圖像分析軟件標記并統(tǒng)計的陽性表達RANK的細胞數，陽性標記為黃色、棕黃色、棕色。

1.8 實時熒光定量PCR檢測miR-31a-5p和Bax mRNA、Bcl-2 mRNA的表達

用Trizol試劑提取分離5組β細胞和BMSC-Exo的總RNA。檢測260 nm的吸光度來定量RNA的濃度。提取的總RNA(0.84 μg)用PrimeScript RT試劑盒在PCR儀上反轉錄合成cDNA。反轉錄PCR反應條件：16 ℃ 0.5 h，41 ℃ 0.5 h，85 ℃ 5 min，4 ℃循環(huán)。cDNA保存于4 ℃。qPCR反應體系為20 μl，其中引物10 μl、SYBR Green酶反應體系10 μl。擴增程序為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性，60 ℃退火2 min，45個循環(huán)，75 ℃下延伸1 min。胰島組織中的Bax和Bcl-2基因使用內參基因為GAPDH，外泌體中的miR-31a-5p使用內參基因為U6。計算Ct值，用2-ΔΔCt計算相對表達量。實驗設置6個復孔，并且重復3次。引物見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

1.9 蛋白免疫印跡檢測E2F2和BMP-2蛋白表達

將5組大鼠的骨髓懸浮液進行充分勻漿。樣品經過與上樣緩沖液混合，在沸水浴中煮5 min，-20 ℃保存。用12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質，并轉移至聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂奶粉封閉2 h后，將膜與兔抗E2F2(1 ∶500)、BMP-2(1 ∶600)、GAPDH(1 ∶5 000)蛋白第一抗體在4 ℃孵育過夜，在25 ℃下與辣根過氧化物酶偶聯的二抗(1 ∶20 000)孵育2 h。使用SuperSignal West Pico化學發(fā)光底物對膜上的蛋白進行顯色，通過Geliance 200顯色系統(tǒng)進行拍照。使用Image J軟件分析條帶灰度值。GAPDH作為內參蛋白。實驗重復3次。

1.10 ALP活性檢測

根據ALP活性測定試劑盒提供的說明檢查了1.3中分離的骨髓懸浮液中ALP的活性。將50 μl冷PBS與上清液混合并勻漿。隨后在4 ℃微量離心機中13 000g離心15 min，上清液用20 μl終止液終止樣品中的ALP活性，加入50 μl pNPP溶液(5 mmol/L)和10 μl ALP酶溶液，避光25 ℃孵育60 min。加入20 μl終止液終止反應，用酶標儀測450 nm處吸光度。

1.11 雙熒光素酶基因報告實驗

通過PCR擴增含有miR-31a-5p結合位點的E2F2 3′ UTR cDNA片段。將擴增產物克隆到熒光素酶基因終止密碼子下游的PGL3載體中。E2F2的突變體(MUT)使用TaKaRa MutanBEST試劑盒(日本TaKaRa)構建。對于在BMSC細胞中進行的熒光素酶測定，使用Lipofectamine 2000將24孔板中的細胞與200 ng/孔熒光素酶報告基因構建體、400 ng/孔miR-mimic或其陰性對照(negative control, NC)共轉染。5 ng/孔的海腎熒光素酶質粒作為內部對照。在轉染后24 h收獲細胞，根據制造商的說明用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(上海碧云天)檢測熒光素酶活性。

1.12 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 BMSC-Exo的鑒定結果

BMSC-Exo的粒徑分布是91～113 nm。CD9和CD63在BMSC-Exo表面均有表達；BMSC-Exo的結構是圓盤形囊泡狀膜結構(見圖1)。

2.2 T2DM大鼠的β細胞凋亡變化

與control組比，T2DM組大鼠體內β細胞的凋亡細胞數明顯增加(P<0.01)；大鼠胰島組織中Bax mRNA表達量增加，而Bcl-2 mRNA表達量減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而與control組比，LIR組的上述指標的變化均差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與T2DM組比，LIR+T2DM組大鼠β細胞凋亡率明顯降低(P<0.01)，且胰島組織中Bax mRNA表達量減少，而Bcl-2 mRNA增加(P<0.01)。與LIR+T2DM組比，與LIR+miR-mimic+T2DM組大鼠β細胞凋亡率明顯增加(P<0.01)，Bax mRNA表達量增加，而Bcl-2 mRNA減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見圖2和表2)。

圖1 骨髓間充質干細胞外泌體的鑒定Figure 1 Verification of bone marrow mesenchymal stem cell exosomes

2.3 T2DM大鼠的骨代謝變化

與control組比較，LIR組的破骨細胞數目(RANK標記)、成骨細胞標記物ALP活性、BMP-2的表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。T2DM組造模后大鼠骨髓中破骨細胞數目(RANK標記)增加，而成骨細胞標記物ALP活性和BMP-2的表達減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與T2DM組比，LIR+T2DM組骨髓中破骨細胞數(RANK標記)減少，而成骨細胞標記物ALP活性和BMP-2的表達增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與LIR+T2DM組比，與LIR+miR-mimic+T2DM組大鼠骨髓中破骨細胞數(RANK標記)增加，而成骨細胞標記物ALP活性和BMP-2的表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見圖3、圖4和表3)。

綠色熒光為TUNEL染色的凋亡細胞，藍色熒光為DAPI染色的細胞核圖2 大鼠胰腺β細胞TUNEL染色 (×200)Figure 2 TUNEL staining of β cells in pancreas of rats (×200)

表2 T2DM大鼠細胞凋亡率及凋亡相關mRNA的表達變化

RANK染色以標記破骨細胞，其中黃色、黃棕色、黃褐色均為破骨細胞陽性，藍色為破骨細胞陰性圖3 破骨細胞標志物RANK的免疫組化染色檢測結果 (×200)Figure 3 Immunohistochemical staining results of osteoclast marker RANK (×200)

圖4 利拉魯肽對2型糖尿病大鼠成骨細胞標志物BMP-2表達的影響Figure 4 Effect of LIR on the expression of osteoblast marker BMP-2 in type 2 diabetic rats

2.4 T2DM大鼠miR-31a-5p的表達

與control組比，T2DM組造模后外泌體中miR-31a-5p上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與T2DM組比，LIR+T2DM組外泌體中miR-31a-5p下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與LIR+T2DM組比，與LIR+miR-mimic+T2DM組外泌體中miR-31a-5p上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。另外，LIR組與control組比，miR-31a-5p的表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.479，見圖5)。

表3 T2DM大鼠體內破骨細胞數、ALP活性以及BMP-2的表達變化

與control比較，*P<0.05；與T2DM比較，#P<0.05；與LIR+T2DM比較，&P<0.05圖5 miR-31a-5p在外泌體中的相對表達水平Figure 5 The relative expression levels of miR-31a-5p in exosomes

2.5 E2F2是miR-31a-5p的靶基因

生物信息學分析預測miR-31a-5p的靶基因是否為E2F2。蛋白免疫印跡結果顯示，與control組比，T2DM組造模后外泌體中E2F2下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與T2DM組比，LIR+T2DM組外泌體中E2F2上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與LIR+T2DM組比，LIR+miR-mimic+T2DM組外泌體中E2F2下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。另外，LIR組與control組間比較，E2F2的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見圖6)。

為確定miR-31a-5p是否直接與E2F2的3'UTR結合并引起翻譯抑制，我們在293T細胞中采用了雙熒光素酶報告基因檢測，結果顯示，miR-31a-5p直接與E2F2的3'UTR結合(見圖7A)。而且，與E2F2突變組相比，E2F2野生組的報告基因在mimic處理后熒光素酶活性顯著降低(P=0.003)，但與E2F2突變組相比，E2F2野生組的報告基因在NC處理后熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義(P=0.732，見圖7B)。

3 討論

本研究發(fā)現，T2DM大鼠的BMSC來源外泌體中miR-31a-5p表達明顯上調，而E2F2的蛋白水平明顯下調；同時發(fā)現LIR治療T2DM組中miR-31a-5p的水平被抑制，而E2F2被上調。但是，單獨使用LIR注射健康大鼠，并未觀察到miR-31a-5p和E2F2的表達改變。我們在進一步的研究中發(fā)現，在BMSC中E2F2是miR-31a-5p的靶基因。使用miR-31a-5p的擬似物miR-mimic上調miR-31a-5p，觀察到LIR對T2DM大鼠β細胞和骨代謝的改善作用被減弱，同時E2F2的表達明顯下調。本研究表明，LIR通過調節(jié)T2DM體內BMSC來源外泌體的miR-31a-5p/E2F2從而改善T2DM大鼠β細胞損傷和骨代謝失衡。本研究為利拉魯肽治療T2DM的機制研究及BMSC-Exo在T2DM的臨床治療提供實驗依據，本研究為T2DM的預防和治療提供新的思路。

與control比較，*P<0.05；與T2DM比較，#P<0.05；與LIR+T2DM比較，&P<0.05圖6 利拉魯肽對2型糖尿病大鼠E2F2表達的影響Figure 6 Effect of LIR on the expression of E2F2 in type 2 diabetic rats

圖7 miR-31a-5p靶向E2F2基因Figure 7 miR-31a-5p targets E2F2 gene

從目前的已發(fā)表的證據可知，LIR治療對T2DM大鼠的β細胞損傷和骨代謝失衡均有明顯的改善作用[4,14]。Li等[13]在觀察了T2DM大鼠的骨髓外泌體的miRNA譜后發(fā)現，LIR治療可導致miRNA譜發(fā)生明顯改變。經生物信息學分析，這種miRNA的改變可直接靶向胰島素分泌和胰島素信號通路[13]。表明LIR可能通過改變骨髓外泌體miRNA的表達調節(jié)胰島β細胞的功能。另外，證據顯示，在衰老且骨代謝失衡的骨髓組織中BMSC來源外泌體中攜帶的miR-31a-5p表達增加，而且miR-31a-5p通過促進細胞衰老形成并損害BMSC的功能導致成骨細胞的減少并進一步抑制轉錄因子E2F2[12]。本研究在T2DM模型中觀察到了類似的結果，T2DM大鼠造模后14 d和21 d的BMSC外泌體中miR-31a-5p的表達均增加，而外泌體中的E2F2的蛋白水平明顯下調。結合上面miRNA表達譜的證據，我們假設LIR可以改變T2DM中的miR-31a-5p的表達和E2F2的蛋白水平。本研究的結果與假設的一致，T2DM大鼠在給予LIR后，我們觀察到BMSC外泌體中miR-31a-5p的表達均明顯下調以及E2F2明顯上調。以上研究表明，LIR可以抑制T2DM大鼠BMSC外泌體中的miR-31a-5p并上調E2F2。

另外，本研究得到一個關鍵的證據，LIR通過調節(jié)BMSC外泌體中的miR-31a-5p/E2F2信號軸改善了T2DM大鼠β細胞損傷和骨代謝失衡。外泌體參與微環(huán)境內遺傳信息的交換。特別是，miRNA在外泌體介導的信息運輸中起著至關重要的作用[15]。這些發(fā)現有助于理解LIR的骨保護機制和β細胞調節(jié)機制[15]。研究發(fā)現，E2F2轉錄因子缺陷的小鼠可發(fā)展出非自身免疫性，胰島素依賴型糖尿病。而且，野生型骨髓的移植可以預防或挽救E2f2-/-小鼠的糖尿病[16]。在本研究中LIR明顯恢復了T2DM大鼠BMSC中外泌體E2F2的表達。而且我們的研究表明LIR很可能通過抑制miR-31a-5p從而促進E2F2蛋白水平的增高，其原因是我們通過熒光素酶報告基因法證實E2F2在BMSC中是miR-31a-5p的靶基因。

在過去的10多年中，miRNA通過影響mRNA的翻譯和穩(wěn)定性迅速成為基因表達的重要調節(jié)劑[17]。本研究證實了E2F2是miR-31a-5p在BMSC中的靶基因。而且miRNA可以通過調節(jié)靶基因誘導多種細胞過程的變化，包括細胞增殖、細胞分化和細胞衰老[18,19]。但是，它們在細胞外環(huán)境中的不穩(wěn)定性限制了它們的應用。外泌體是一種具有磷脂雙分子層膜的囊泡，可保護miRNA免受降解，并在細胞之間轉移它們，從而調節(jié)細胞間的通訊。本研究表明，T2DM大鼠BMSC外泌體的miR-31a-5p被明顯上調。已有報道顯示外泌體中的miR-31a-5p與骨髓微環(huán)境中的骨生成和骨吸收有密切關系，其中抑制BMSC外泌體中的miR-31a-5p可以減少破骨細胞的生成，增加成骨細胞的生成，這種雙重調節(jié)表明，miR-31a-5p在骨骼形成和骨骼吸收中均起著至關重要的調節(jié)作用[12]。本研究觀察到T2DM大鼠給予LIR后，BMSC外泌體中的miR-31a-5p的水平明顯下降，并伴隨破骨細胞數目減少以及β細胞的凋亡率下降，而使用miR-mimic恢復miR-31a-5p的表達后，骨髓中破骨細胞數目和β細胞的凋亡率均增加。這些結果表明LIR可通過抑制BMSC外泌體的miR-31a-5p水平改善β細胞損傷和骨代謝失衡。

本研究仍存在一定局限性，首先，樣本量不足，仍需要進一步擴大動物的樣本量和種類進行驗證，并且在多種β細胞中反復觀察，以確定本研究結果的普遍適用性。其次，缺乏LIR治療糖尿病并涉及外泌體機制研究的文獻報道，以此為契機，本研究為外泌體轉運的信號機制參與調控糖尿病治療等研究提供了新的研究基礎。在后續(xù)研究中，本課題組將加大樣本量，并利用不同的糖尿病動物模型更進一步加強對LIR治療糖尿病后BMSC的外泌體轉運的信號機制進行深入研究。

綜上所述，本研究結果表明LIR通過調控T2DM大鼠BMSC中外泌體miR-31a-5p/E2F2信號軸從而對T2DM大鼠的β細胞損傷和骨代謝失衡具有調控作用。本研究為LIR臨床治療T2DM提供了潛在的治療機制，為LIR的治療效果評估和機制探究提供了研究基礎。