單 虎，張 蓉，張秋紅，楊 俠，陳海娟，張 潔，李雅莉，張 明*

(1西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，西安 710004；2陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)一科；#共同第一作者；*通訊作者,E-mail:zhangmingdr@163.com)

慢性肺源性心臟病是慢性阻塞性肺疾病、肺間質(zhì)纖維化等慢性呼吸系統(tǒng)病的常見并發(fā)癥，由于缺乏有效的防治措施，該病死亡率較高，5年生存率僅32.4%[1]。慢性缺氧是慢性肺源性心臟病的主要病因，目前認為慢性缺氧主要通過誘導(dǎo)肺動脈高壓和心肌細胞直接損傷兩種途徑參與慢性肺源性心臟病的發(fā)病過程[2,3]。心肌細胞是一種高度依賴氧氣和能量的組織細胞，在缺氧微環(huán)境中，心肌細胞在細胞器水平迅速進行適應(yīng)性調(diào)節(jié)，如線粒體中代謝相關(guān)酶活性改變、線粒體質(zhì)量控制、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體非折疊蛋白反應(yīng)等。線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為維持心肌細胞功能的重要細胞器，可以在線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)耦聯(lián)這一功能平臺上實現(xiàn)交互作用，繼而參與細胞內(nèi)鈣信號調(diào)控、線粒體形態(tài)調(diào)節(jié)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、脂質(zhì)合成和轉(zhuǎn)運等功能。當(dāng)心肌細胞長期處于缺氧微環(huán)境時，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)適應(yīng)性調(diào)節(jié)無法維持心肌細胞功能，最終誘發(fā)心肌細胞自噬和凋亡[4-7]。然而，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是否參與慢性缺氧誘使心肌細胞線粒體途徑凋亡尚未見研究證實。本研究擬通過構(gòu)建慢性缺氧大鼠模型探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在慢性缺氧誘導(dǎo)線粒體途徑心肌細胞凋亡過程中的作用和機制，為研究慢性肺源性心臟病發(fā)病機制和治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

8周齡清潔級雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量200～250 g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心(許可證號：SCXK(陜)2018-001)。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度(25±1)℃，相對濕度60%～80%，自由進食進水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，將大鼠隨機分為對照組、低氧組和干預(yù)組。對照組大鼠24 h均在普通飼養(yǎng)籠中喂養(yǎng)，每天給予生理鹽水灌胃；低氧組大鼠在玻璃飼養(yǎng)籠中喂養(yǎng)，籠內(nèi)氧濃度由氣體濃度控制器(上海塔望智能科技有限公司)控制，每天固定8 h將氧濃度降至10%±0.5%，其余16 h內(nèi)氧濃度等同于實驗室空氣，同時每天給予生理鹽水灌胃；干預(yù)組大鼠喂養(yǎng)方式同低氧組，每天給予4-苯基丁酸(4-PBA)混懸液(0.5 mg/kg)灌胃。三組大鼠均連續(xù)喂養(yǎng)21 d，并稱重記錄。

1.2 主要試劑

高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)，組織蛋白裂解液(武漢博士德生物工程有限公司)，線粒體膜電位檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，4-苯基丁酸(4-Phenylbutyric acid，4-PBA，ERS抑制劑，美國Sigma公司)，抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)兔多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司(bs-1219R)，抗CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)兔多克隆抗體購自美國Sigma公司(SAB5700602)，抗Bcl-2兔多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司(26593-1-AP)，抗GAPDH兔多克隆抗體購自杭州賢至生物有限公司(AB-P-R 001)，抗細胞色素C兔多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司(BM4571)，抗COXⅣ兔多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司(A05442-1)，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司(BA1054)，Hoechst 33258細胞核探針購自美國Sigma公司。

1.3 心臟稱重評估心臟肥大情況

三組大鼠喂養(yǎng)21 d后稱重，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，開胸充分暴露心臟，從主動脈及肺動脈根部分離并取出心臟，此后操作在冰面上進行。用4 ℃ PBS溶液沖洗心腔內(nèi)血液至澄清，濾紙吸除水分后稱重。用眼科剪分離心包、脂肪組織、心房、右心室、室間隔和左心室，將右心室組織吸干后稱重，以右心室質(zhì)量所占比例反映右心肥大情況。取部分新鮮右心室組織用于提取心肌組織線粒體以檢測線粒體膜電位水平和線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)表達水平，剩余組織置于液氮并-80 ℃冰箱保存，用于提取心肌組織總蛋白。

1.4 線粒體提取

稱取新鮮右心室組織0.5 g，按照高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒說明書分離并純化線粒體，向提取的新鮮心肌組織線粒體混懸液中加入0.2 ml預(yù)冷的保存液，輕柔吹打重新懸浮線粒體，隨后進行蛋白定量。用含100 μg蛋白質(zhì)的線粒體進行膜電位檢測，剩余線粒體用于裂解提取蛋白質(zhì)。

1.5 線粒體膜電位檢測

在避光環(huán)境下使用JC-1熒光探針用于檢測線粒體膜電位，按照線粒體膜電位檢測試劑盒說明書操作，首先制備JC-1染色工作液，向0.1 ml新鮮提取的含100 μg蛋白質(zhì)的線粒體中加入0.9 ml JC-1染色工作液，混勻，37 ℃孵育20 min，離心棄上清，用染色緩沖液洗滌2次。用熒光酶標(biāo)儀分別設(shè)定激發(fā)波長525 nm，發(fā)射波長590 nm測定紅色熒光值，設(shè)定激發(fā)波長490 nm，發(fā)射波長530 nm測定綠色熒光值。紅色與綠色熒光比值代表線粒體膜電位水平。

1.6 Western blot法測定蛋白表達水平

組織勻漿法獲取右心室心肌組織總蛋白，線粒體溶解液提取線粒體總蛋白，用Bradford法蛋白定量。取40 μg蛋白質(zhì)變性后經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用含10%脫脂奶粉的PBST室溫封閉2 h，分別用GRP78抗體(1 ∶1 000稀釋)、CHOP抗體(1 ∶2 000稀釋)、bcl-2抗體(1 ∶800稀釋)、GAPDH抗體(1 ∶1 000稀釋)、細胞色素C抗體(1 ∶1 000稀釋)、COXⅣ抗體(1 ∶1 000稀釋)孵育4 ℃過夜，用1 ∶20 000稀釋的HRP標(biāo)記二抗37 ℃孵育2 h。使用ECL發(fā)光試劑盒進行顯色，用Image Plus Pro圖像處理軟件進行灰度分析。

1.7 TUNEL法檢測細胞凋亡

常規(guī)石蠟包埋右心室組織，用3%雙氧水處理，按照TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒操作，先后用1 ∶100倍稀釋的ASBC-FITC和Hoechst 32258染色。最后用Vectashield抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察綠色熒光標(biāo)記的細胞為凋亡細胞，藍色熒光標(biāo)記的為所有細胞的細胞核。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性缺氧及4-PBA對大鼠心臟肥大的影響

與對照組相比，缺氧組大鼠進食量少，生長速度慢，然而心臟體質(zhì)比(心臟質(zhì)量/體質(zhì)量，g/kg)卻相對升高(P<0.001)，右心室質(zhì)量分析顯示缺氧組大鼠右心室占比增高，右心室體質(zhì)比(右心室質(zhì)量/體質(zhì)量，g/kg)增高(均P<0.001，見表1)。與缺氧組相比，干預(yù)組大鼠心臟體質(zhì)比、右心室體質(zhì)比、右心室占比均有所降低(分別為P≤0.001，見表1)。提示慢性缺氧可誘發(fā)大鼠出現(xiàn)以右心室肥大為主的病理改變，而4-PBA干預(yù)可部分緩解慢性缺氧所誘導(dǎo)的右心室肥大。

表1 慢性缺氧時大鼠心臟形態(tài)變化及4-PBA的干預(yù)作用

2.2 慢性缺氧及4-PBA對大鼠心肌組織線粒體膜電位的影響

與對照組相比，缺氧組大鼠右室心肌組織線粒體膜電位明顯降低(P<0.001)，而干預(yù)組大鼠右室心肌組織線粒體膜電位則高于缺氧組(P=0.014，見圖1)，這提示慢性缺氧可引起大鼠右室心肌組織線粒體膜電位降低，而4-PBA干預(yù)可減輕慢性缺氧對線粒體膜電位的影響。

2.3 慢性缺氧及4-PBA對大鼠心肌組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

與對照組相比，缺氧組大鼠右室心肌組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子CHOP、GRP78表達水平明顯升高(均P<0.001)，而干預(yù)組大鼠CHOP、GRP78表達水平明顯低于缺氧組(P分別為0.047，0.007，見圖2)，提示慢性缺氧誘發(fā)大鼠右室心肌組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，且4-PBA可顯著抑制慢性缺氧的上述作用。

與對照組相比，*P<0.01；與缺氧組相比，#P<0.05圖1 慢性缺氧時大鼠心肌組織線粒體膜電位變化及4-PBA的干預(yù)作用Figure 1 Effect of chronic hypoxia on myocardial mitochondrial membrane potential and the interference effect of 4-PBA

與對照組相比，*P<0.05；與缺氧組相比，#P<0.05圖2 慢性缺氧對大鼠心肌組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達的影響及4-PBA的干預(yù)作用Figure 2 Effect of chronic hypoxia on the protein expression involved in ERS and the interference effect of 4-PBA

2.4 慢性缺氧及4-PBA對大鼠心肌組織凋亡的影響

與對照組相比，缺氧組大鼠右室心肌組織細胞凋亡率明顯升高(P<0.001)，而干預(yù)組大鼠細胞凋亡率則低于缺氧組(P<0.001，見圖3)，提示慢性缺氧誘導(dǎo)大鼠右室心肌細胞凋亡，4-PBA干預(yù)可部分緩解慢性缺氧的促凋亡作用。

圖3 慢性缺氧對大鼠心肌凋亡的影響及4-PBA的干預(yù)作用 (×400)Figure 3 Effect of chronic hypoxia on the cardiomyocyte apoptosis and the interference effect of 4-PBA (×400)

2.5 慢性缺氧及4-PBA對線粒體途徑細胞凋亡的影響

與對照組相比，缺氧組大鼠右室心肌組織Bcl-2表達水平明顯升高(P=0.001)，細胞內(nèi)總細胞色素C表達水平未見明顯變化(P=0.294，見圖4)，但線粒體內(nèi)細胞色素C含量明顯降低(P=0.001，見圖5)，提示缺氧組大鼠右室心肌組織內(nèi)細胞色素C大量釋放。與缺氧組相比，干預(yù)組大鼠Bcl-2表達水平有所降低(P=0.020)，細胞內(nèi)總細胞色素C表達仍未見差異(P=0.514，見圖4)，但線粒體內(nèi)細胞色素C含量有所升高(P=0.017，見圖5)，提示4-PBA可部分抑制慢性缺氧對大鼠右室心肌組織線粒體途徑細胞凋亡的活化作用。

與對照組相比，*P<0.05；與缺氧組相比，#P<0.05圖4 慢性缺氧對大鼠心肌組織凋亡相關(guān)蛋白表達的影響及4-PBA的干預(yù)作用Figure 4 Effect of chronic hypoxia on the expression of apoptosis-related proteins and the interference effect of 4-PBA

與對照組相比，*P<0.05；與缺氧組相比，#P<0.05圖5 慢性缺氧對大鼠心肌組織線粒體內(nèi)細胞色素C表達的影響及4-PBA的干預(yù)作用Figure 5 Effect of chronic hypoxia on the expression of cytochrome C in myocardial mitochondria and the interference effect of 4-PBA

3 討論

長期缺氧導(dǎo)致的肺動脈高壓是目前研究慢性肺源性心臟病發(fā)病機制的熱點方向，心肌細胞缺氧再復(fù)氧損傷相關(guān)研究證實缺氧可誘發(fā)心肌細胞線粒體損傷甚至線粒體途徑細胞凋亡，然而慢性缺氧對心肌細胞損傷和凋亡的具體機制并未引起足夠重視[8]。線粒體是為維持心肌細胞功能而供應(yīng)能量的重要細胞器，同時線粒體損傷也是介導(dǎo)細胞凋亡的重要途徑之一，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在維持細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)及調(diào)節(jié)細胞凋亡方面與線粒體有諸多功能重疊，二者之間的交互作用關(guān)系非常緊密[4-7]。基于此，本研究擬通過動物實驗探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在慢性缺氧誘發(fā)慢性肺源性心臟病心肌細胞線粒體途徑凋亡中的作用。

本研究通過常壓間歇缺氧法成功建立以右心室肥大為主的慢性肺源性心臟病大鼠模型，在該模型大鼠右心室心肌組織中觀察到明顯的細胞凋亡現(xiàn)象，以及活化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。為明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在慢性缺氧誘發(fā)心肌細胞凋亡中的作用和可能機制，本研究利用JC-1探針測定線粒體膜電位，結(jié)果證實缺氧組大鼠心肌組織線粒體膜電位明顯降低，同時Bcl-2表達水平明顯升高，線粒體內(nèi)細胞色素C含量降低，提示線粒體釋放更多的細胞色素C進入細胞質(zhì)，上述結(jié)果提示慢性缺氧刺激下線粒體途徑細胞凋亡明顯活化。隨后，通過分析干預(yù)組大鼠與缺氧組大鼠右心室組織中細胞凋亡和蛋白質(zhì)表達水平的變化，證實4-PBA干預(yù)在抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的同時，可以顯著降低心肌細胞Bcl-2表達水平和線粒體內(nèi)細胞色素C的釋放，同時心肌組織細胞過度凋亡得到部分緩解。由此可見，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以有效緩解慢性缺氧刺激誘發(fā)的線粒體途徑細胞凋亡。

線粒體是心肌細胞中最為重要的細胞器之一，約占心肌細胞體積的45%，主要負責(zé)供給心肌細胞收縮所需要能量[9]。在心肌細胞凋亡時，線粒體結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)生明顯改變，提示線粒體參與心肌細胞凋亡[10-13]?，F(xiàn)已證實，線粒體是細胞凋亡的執(zhí)行者和重要調(diào)節(jié)點，線粒體凋亡途徑受bcl-2家族調(diào)控，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔在凋亡信號誘導(dǎo)下開放，引發(fā)線粒體腫脹，并通過釋放凋亡誘導(dǎo)因子和細胞色素C，啟動細胞死亡過程[14-17]。本研究證實慢性缺氧刺激下，心肌細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的同時，Bcl-2表達水平上調(diào)，線粒體膜電位降低，線粒體中細胞色素C釋放增加，啟動線粒體途徑細胞凋亡。同時，以4-PBA干預(yù)下調(diào)心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性缺氧刺激所誘發(fā)的線粒體膜電位降低、細胞色素C釋放和Bcl-2高表達得到部分緩解，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作為線粒體途徑細胞凋亡的上游參與慢性缺氧誘發(fā)慢性肺源性心臟病的發(fā)病過程。

作為兩種重要的細胞器，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間存在著密切的聯(lián)系，二者之間不但存在線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)耦聯(lián)(mitochondrion endoplasmic reticulum physical coupling，MAM)，還存在共同誘導(dǎo)細胞凋亡的調(diào)節(jié)蛋白[18,19]。例如存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的酪氨酸蛋白激酶C-Ab1可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后轉(zhuǎn)運至線粒體中，促進線粒體釋放細胞色素C并繼而活化凋亡過程[20]。MAM在線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)雙向反饋調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后，這一物理結(jié)構(gòu)可在線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間傳遞鈣信號，將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的大量鈣離子轉(zhuǎn)運進入線粒體中，造成線粒體鈣超載，并引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放、線粒體腫脹和線粒體途徑細胞凋亡[19]。心臟是一個對氧氣高度依賴的器官，任何引起機體系統(tǒng)性缺氧的疾病都可能導(dǎo)致心肌組織慢性缺氧，繼而引發(fā)心肌收縮功能降低，甚至心力衰竭[6,21]。因此，探尋慢性缺氧情況下心肌細胞功能變化的機制將為臨床上救治慢性肺源性心臟病等缺氧性心臟病提供新的線索。本研究證實慢性缺氧環(huán)境中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過活化線粒體凋亡途徑介導(dǎo)心肌細胞凋亡，而其中具體機制尚需進一步研究探索，下一步將以細胞鈣穩(wěn)態(tài)和MAM為重點深入探索其中的機制。

綜上所述，本研究通過動物實驗揭示了慢性缺氧可誘發(fā)心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，繼而引起線粒體凋亡途徑，參與慢性肺源性心臟病的發(fā)病過程。明確內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑在慢性肺源性心臟病中的作用有助于闡明慢性肺源性心臟病的發(fā)病機制，并證實靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保護的藥物可以應(yīng)用于以心肌細胞保護為策略的慢性肺源性心臟病治療中。