郭 棟,楊于冰,賀西京，李嘉熙,譚清華,劉東藩,常素娥

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨二科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:xijing_h@vip.tom.com)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)時，神經(jīng)元受到原發(fā)性機械性損傷，繼發(fā)性引起炎癥反應(yīng)、脂質(zhì)過氧化、局部缺血、自由基產(chǎn)生、神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成和軸突脫髓鞘等，嚴(yán)重抑制了神經(jīng)功能的恢復(fù)和軸突再生[1]。SCI的大量研究已經(jīng)證明，移植到受傷脊髓中的嗅鞘細胞(olfactory ensheathing cells，OECs)能夠促進軸突的再生[2]。OECs是一種特殊的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，兼有星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和施萬細胞等的多重功能，其神經(jīng)修復(fù)能力優(yōu)于其他類型膠質(zhì)細胞，同時表現(xiàn)出向損傷區(qū)遷移的作用，具有促進軸突再生，重建神經(jīng)環(huán)路的能力。OECs還具有分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，刺激髓鞘再生和吞噬作用。這些OECs的生物學(xué)特性使其在治療SCI中應(yīng)用廣泛[3]。

細胞移植可以促進支架整合和提高損傷神經(jīng)再生潛能。生物支架可以創(chuàng)造適合細胞遷移和分化的三維環(huán)境和為細胞遞送營養(yǎng)物質(zhì)，同時橋接受傷的脊髓，在結(jié)構(gòu)和化學(xué)上支持軸突再生，最終改善患者生活質(zhì)量[4]。生物支架聯(lián)合OECs的治療策略已取得一定進展。本文針對生物支架聯(lián)合OECs在SCI修復(fù)中的研究進展進行闡述，展示了OECs聯(lián)合生物支架治療SCI的發(fā)展趨勢,并對目前存在的問題進行了討論。

1 OECs的生物學(xué)功能

越來越多的研究表明，OECs可以促進軸突再生和重建神經(jīng)回路，最終實現(xiàn)SCI功能恢復(fù)。同時，OECs還可以分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子等發(fā)揮神經(jīng)保護作用。OECs的遷移特性、再髓鞘化和免疫調(diào)節(jié)作用也越來越被重視。OECs具有以下生物學(xué)功能[2,5]：①神經(jīng)營養(yǎng)作用：OECs移植到SCI損傷區(qū)后能夠提供大量的神經(jīng)營養(yǎng)分子。有文獻報道OECs可以分泌腦源性神經(jīng)生長因子、神經(jīng)生長因子-3等，可有效促進神經(jīng)元存活和軸突延伸，實現(xiàn)損傷區(qū)的長距離跨越[5]。②調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)：首先OECs可以吞噬壞死神經(jīng)碎片改善局部炎癥微環(huán)境，同時OECs移植可以促進白細胞介素4和白細胞介素13等抗炎細胞因子表達，抑制白細胞介素6和腫瘤壞死因子-α等炎癥因子的表達，從而促進神經(jīng)元存活和神經(jīng)軸突延伸。③遷移作用：OECs可以實現(xiàn)在損傷區(qū)的縱向和橫向遷移，而不受膠質(zhì)瘢痕的阻礙。更吸引人的是，OECs可以通過伴隨神經(jīng)軸突的生長而實現(xiàn)長距離遷移，OECs的遷移特性可能在中樞神經(jīng)損傷后神經(jīng)纖維再生中起關(guān)鍵作用。④再髓鞘化：SCI后的中樞神經(jīng)軸突通常不能延伸并與靶細胞重新連接，但移植的OECs可以與新生軸突進行整合，實現(xiàn)髓鞘的再形成。⑤異質(zhì)性：OECs通常從嗅球或者嗅黏膜提取，而不同來源的OECs在體內(nèi)移植后的神經(jīng)保護和神經(jīng)再生過程中發(fā)揮不同的作用。充分發(fā)揮不同來源OECs的優(yōu)勢和生物支架聯(lián)合應(yīng)用為治療SCI提供了新的路徑。

2 天然聚合物生物支架聯(lián)合OECs治療SCI

天然聚合物生物支架通常能與受傷的脊髓良好整合，不會引起劇烈的炎癥反應(yīng)。此外，天然聚合物可以很好地模擬脊髓本身的微環(huán)境。已經(jīng)用于OECs移植治療SCI的天然生物材料有膠原蛋白、纖維蛋白、絲素蛋白、海藻酸鹽、殼聚糖等。OECs聯(lián)合天然聚合物生物支架治療SCI的相關(guān)研究見表1[6-14]。

2.1 膠原蛋白

膠原蛋白是細胞外基質(zhì)蛋白的最大組成部分。明膠來源于膠原蛋白水解，并含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸等基序。與不含明膠的水凝膠相比，將明膠混合到聚合物中可促進軸突延伸，還為脊髓背根神經(jīng)節(jié)提供了更高的黏附力。據(jù)報道，負載神經(jīng)干細胞的膠原支架在T8 SCI大鼠模型中還可促進神經(jīng)再生和運動功能的恢復(fù)[15]。同時，膠原蛋白已被用于負載OECs的復(fù)合支架，表現(xiàn)出促進OECs的附著、增殖和減少細胞的凋亡[11]。

表1 OECs聯(lián)合天然聚合物生物支架治療脊髓損傷的實驗研究

2.2 纖維蛋白

纖維蛋白是一種纖維狀和非球狀蛋白，已被廣泛用作神經(jīng)組織工程研究中的生物支架[16]。含有神經(jīng)營養(yǎng)因子-3的纖維蛋白支架在SCI后2周接受延遲治療后促進神經(jīng)纖維再生[17]。在另一項研究中，纖維連接蛋白在脊髓半切模型中被證明支持再髓鞘化和軸突生長[18]。體外實驗結(jié)果顯示基于纖維蛋白的生物支架可以促進OECs黏附、增殖和延展，同時提高脊髓背根神經(jīng)突起的生成[7,10]。雖然基于纖維蛋白的OECs復(fù)合生物支架并沒有在SCI的動物模型中進行研究，但是仍表現(xiàn)出巨大的潛力。

2.3 絲素蛋白

絲素蛋白是一種天然生物聚合物，具有高生物相容性和低免疫原性以及足夠的生物降解性和彈性模量，適合體內(nèi)應(yīng)用[19]。有研究顯示絲素蛋白可以促進細胞附著和周圍神經(jīng)的再生[20]。此外，還有實驗證明了基于絲素蛋白的水凝膠可以支持神經(jīng)元生長以進行中樞神經(jīng)組織修復(fù)[21]。至關(guān)重要的是，絲素蛋白纖維可以引導(dǎo)神經(jīng)元生長的方向[22]。同時，負載間充質(zhì)干細胞的多孔絲素蛋白支架可以促進脊髓損傷后大鼠的軸突再生和髓鞘形成，這比單通道的支架更具優(yōu)勢[23]。在Wu等[6]的研究中，基于絲素蛋白的生物支架促進了OECs的黏附、生長、增殖和遷移。此外，絲素蛋白可以減輕損傷局部組織的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，同時顯示出緩慢的生物降解速率，這更拓展了絲素蛋白在OECs治療脊髓損傷中的應(yīng)用，具有良好的應(yīng)用前景[24]。

2.4 殼聚糖

殼聚糖是通過甲殼素脫乙?；@得的天然陽離子多糖，可設(shè)計為細胞調(diào)節(jié)、生長和分化的支架，已經(jīng)廣泛開發(fā)為神經(jīng)再生領(lǐng)域中有前途的替代治療策略。殼聚糖的上述功能是由于其獨特和吸引人的性質(zhì)，如相容性、生物降解性、無毒、通過支架/納米顆?？刂粕窠?jīng)營養(yǎng)因子或干細胞的釋放[25]。同時，殼聚糖支架可以起到很好的支撐和橋接作用，不但能抑制瘢痕組織的形成，還能介導(dǎo)神經(jīng)再生和促進SCI后運動功能的恢復(fù)[26]。Liu等[27]開發(fā)了一種由殼聚糖、透明質(zhì)酸衍生物和基質(zhì)膠構(gòu)成的新型生物墨水，利用3D生物打印技術(shù)制造了含有神經(jīng)干細胞的生物支架，并首次在動物試驗中探索了它們在SCI修復(fù)中的應(yīng)用。在Zhu等[28]的研究中顯示，負載OECs的生物支架可以促進細胞黏附、擴散和增殖，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的分泌，促進背根神經(jīng)節(jié)生長，促進軸突再生和功能恢復(fù)。然而，基于殼聚糖的水凝膠在應(yīng)用時，巨噬細胞可以被殼聚糖中存在的N-乙酰葡糖胺的受體介導(dǎo)激活引起炎癥反應(yīng)，這可能限制了殼聚糖在脊髓損傷中的應(yīng)用[29]。在此，基于OECs和殼聚糖的生物支架的研究較少。

2.5 海藻酸鹽

海藻酸是一種天然存在于某些褐藻物種中的酸性線型多糖。這種親水、可生物降解、生物相容且無免疫原性的多糖水凝膠被用作脊髓生物支架[11]。海藻酸鹽水凝膠可以成功遞送干細胞，將交聯(lián)的海藻酸鹽植入完全橫斷的脊髓中有助于軸突生長和膠質(zhì)瘢痕減少[30]。然而，基于多糖的水凝膠由于缺乏用于細胞黏附的必需蛋白質(zhì)組分而具有局限性，因此它們通常被修飾或與蛋白質(zhì)結(jié)合，如通過添加精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸結(jié)合肽(the integrin-binding peptide arginine-glycine-aspartic acid，RGD)來促進細胞的黏附[11]。最早在Novikova等[10]的研究中將海藻酸鹽和纖維連接蛋白聯(lián)合應(yīng)用作為負載OECs的生物支架，促進OECs增殖，改善脊髓背根神經(jīng)節(jié)的生成。在后來的進一步研究中，RGD肽修飾的海藻酸鹽可以促進OECs的存活和黏附[11]。組織工程和再生醫(yī)學(xué)的主要挑戰(zhàn)之一是能夠保持最佳細胞功能和移植后存活，在此，海藻酸鹽作為OECs的載體在治療SCI的應(yīng)用中具有巨大的潛力。

3 人工合成生物支架聯(lián)合OECs治療SCI

人工合成生物支架可以根據(jù)研究者的需求進行精準(zhǔn)定制，如設(shè)計特定的降解時間、孔隙率和物理結(jié)構(gòu)。此外，人工合成生物支架通常不會引起免疫排斥反應(yīng)。與天然聚合物相比，人工合成材料能夠被大批量生產(chǎn)，可以降低生物支架的使用成本。已經(jīng)用于OECs治療SCI的人工合成的生物材料有聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇(PEG)、自組裝肽(SAPs)、聚吡咯(PPy)等。OECs聯(lián)合人工合成生物支架治療SCI的相關(guān)研究見表2[31-37]。

表2 OECs聯(lián)合人工合成生物支架治療脊髓損傷的實驗研究

3.1 聚乙二醇

聚乙二醇(PEG)是一種無毒、親水的合成聚合物。這種低免疫原性聚合物通過保護細胞完整性和減少SCI急性期炎癥因子的釋放來減輕炎癥反應(yīng)并抑制局部膠質(zhì)瘢痕生成[38]。而且，PEG是生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中最常用的合成聚合物，可以作為水凝膠增強彈性模量的添加材料，同時具有支持膠質(zhì)細胞生長、新生血管形成以及有髓軸突在損傷區(qū)的再生[39]。除此之外，PEG還可以通過改性被設(shè)計成不同的降解率，增加細胞黏附[4]。在Chan等[32]的研究中，基于PEG的生物支架表現(xiàn)出可以促進OECs黏附、增殖、遷移的作用。在最近的一項研究中，Wang等[33]設(shè)計的細胞黏附肽修飾的多孔PEG水凝膠可以引導(dǎo)OECs的定向遷移。

3.2 聚乳酸-羥基乙酸共聚物

聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)是聚乳酸和聚乙醇酸的合成共聚物，具有生物相容性和可生物降解性[40]。由PLGA微球組成的透明質(zhì)酸生物支架被植入半切的大鼠脊髓中，表現(xiàn)出植入物與脊髓組織的良好整合，同時抑制了炎癥反應(yīng)和膠質(zhì)瘢痕的形成[41]。但是Li等[42]將負載OECs的PLGA支架植入損傷區(qū)后觀察12周，沒有觀察到坐骨神經(jīng)功能的恢復(fù)。這可能是因為PLGA的分解會產(chǎn)生乙醇酸和乳酸，改變了損傷局部的pH值，抑制了神經(jīng)組織的修復(fù)過程，這可能限制了它作為OECs載體在組織工程中的應(yīng)用。

3.3 自組裝肽

自組裝肽(SAPs)可以自發(fā)形成組織良好的納米結(jié)構(gòu)，這種特性對于廣泛的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用非常有利。對于神經(jīng)損傷，SAPs具有良好的生物相容性，可以為神經(jīng)細胞的存活和延展提供適當(dāng)?shù)娜S環(huán)境，同時可以設(shè)計成具有營養(yǎng)因子緩釋功能的多功能支架[43]。此外，SAPs可以提供有利于細胞增殖和分化的微環(huán)境，以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)重建和受損神經(jīng)的功能恢復(fù)[44]。用于SAPs的最常見序列是RGD、異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸(isoleucine-lysine-valine-alanine-valine，IKVAV)、酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸(tyrosine-isoleucine-glycine-serine-arginine，YIGSR)和RADA16自組裝肽(16-amino acid Type I-SAP，RADA16)。IKVAV和RGD可以促進受損神經(jīng)的細胞分化、黏附和軸突生長[45,46]。有研究發(fā)現(xiàn)基于RGD的生物支架提高了OECs的存活率[11]。同時在Zhang等[8]的研究中，將RADA16和RGD引入自組裝的納米纖維水凝膠中，促進OECs的黏附、增殖和減少神經(jīng)細胞凋亡。在其他研究中發(fā)現(xiàn)，將IKVAV和RADA16復(fù)合形成一種新型納米纖維水凝膠，可以增強軸突延伸，細胞附著和神經(jīng)再生[45,47]。

3.4 導(dǎo)電聚合物

導(dǎo)電聚合物在神經(jīng)組織工程領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。聚吡咯(PPy)可以通過與其他材料混合制成不同的導(dǎo)電復(fù)合生物支架[35]。此外，聚己內(nèi)酯通常用于靜電紡絲的制備[37]。靜電紡絲技術(shù)用于制作管狀、多孔等形式的纖維，可以與多種材料結(jié)合使其功能化，包括蛋白質(zhì)(如膠原蛋白和層粘連蛋白)、導(dǎo)電物質(zhì)、細胞黏附肽(如RGD，IKVAV和YIGSR)[48]。通過物理或共價連接方法將蛋白質(zhì)與導(dǎo)電物質(zhì)如碳納米管或PPy進行交聯(lián)構(gòu)建復(fù)合生物支架可以促進細胞黏附、軸突伸長、細胞遷移、信號傳遞和SCI后運動功能的恢復(fù)[49]。

有研究發(fā)現(xiàn)，在直徑為1 μm的靜電紡絲纖維上培養(yǎng)時，來自大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)突起延長最大，同時大量研究表明微米級的纖維直徑更適合于軸突的延伸(>750 nm)[49,50]。此外，與隨機方向的紡絲相比，定向?qū)R的紡絲更能促進血管形成、軸突再生和更好的髓鞘形成，從而導(dǎo)致更快的運動功能恢復(fù)[51,52]。Qi等[35]的研究顯示，PPy和殼聚糖組成的復(fù)合支架在體外實驗中證明了可以促進OECs黏附、擴散和增殖，以及神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌。在最近的研究中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)電復(fù)合支架可以促進OECs的黏附和遷移[53]。同樣在應(yīng)用碳納米管的研究中發(fā)現(xiàn)其可以促進OECs的黏附、生長、存活和增殖[36]?？傊Y(jié)合靜電紡絲工藝和水凝膠的優(yōu)勢在脊髓損傷修復(fù)中具有巨大潛力。

4 脫細胞生物支架

脊髓本身的復(fù)雜結(jié)構(gòu)在基本的化學(xué)反應(yīng)中很難復(fù)制，因此研究者開始嘗試將脊髓本身的細胞去除來獲取其三維結(jié)構(gòu)。脫細胞支架及其衍生物(水凝膠等)可以保留脊髓組織中的特異性組分，包括關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)和功能蛋白[54]。

脫細胞支架可以促進神經(jīng)元黏附、遷移、增殖、分化，并誘導(dǎo)血管生成。Liu等[55]結(jié)合脫細胞脊髓和溫敏水凝膠的優(yōu)點，提供了一種多功能仿生脊髓支架，使外源生長因子持續(xù)釋放，同時具有以脫細胞基質(zhì)為核心的灰質(zhì)和以緩釋堿性成纖維細胞生長因子溫敏水凝膠為白質(zhì)的灰白質(zhì)區(qū)域。在最近的一項研究中發(fā)現(xiàn)脫細胞支架聯(lián)合OECs可以促進損傷部位的軸突再生[56]。移植進入的OECs可以跨越膠質(zhì)瘢痕，在脊髓損傷后橋接病變部位，并為軸突再生提供條件，同時更好地發(fā)揮了OECs本身的神經(jīng)保護作用，增強神經(jīng)元存活，并促進損傷部位軸突的再生[56]。但是，脫細胞支架在OECs移植治療脊髓損傷的應(yīng)用中依然較少。

5 問題與展望

脊髓損傷仍然是一種在臨床上難以治療的病理生理學(xué)疾病。生物支架的應(yīng)用可以減少膠質(zhì)瘢痕，并為促進細胞生長和分化提供空間[57]。然而，許多挑戰(zhàn)仍未解決。生物材料的優(yōu)點和缺點使得支架的選擇非常困難，這在OECs中的應(yīng)用更加困難。

OECs通常來源于原代嗅覺神經(jīng)系統(tǒng)，當(dāng)OECs植入脊髓損傷局部后，不斷惡化的微環(huán)境導(dǎo)致移植的OECs逐漸死亡，神經(jīng)再生很少[58]。因此，制定有效的策略來加強OECs的治療潛力，包括促進OECs增殖和分泌神經(jīng)生長因子和抗炎因子的能力，具有極其重要的意義[2]。在本團隊的前期研究中發(fā)現(xiàn)OECs可以通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子改變SCI后損傷區(qū)的局部微環(huán)境，進而減輕膠質(zhì)瘢痕的形成，還可以通過抑制硫酸軟骨素蛋白聚糖的表達和促進生長相關(guān)蛋白43的表達，促進SCI后的軸突再生，更加拓展了OECs治療SCI的應(yīng)用前景[59]。用于OECs的生物支架已經(jīng)有了很多研究，同時取得了可靠的研究基礎(chǔ)，但是并沒有在臨床試驗中進行研究。它們有效地轉(zhuǎn)化用于人體可能需要一定的時間。另一方面，在對生物支架的研究中，大多數(shù)研究者并沒有對不同來源的OECs進行比較，如嗅球來源的OECs和嗅黏膜來源的OECs。大量研究顯示嗅球來源的OECs表現(xiàn)出對神經(jīng)再生和軸突延伸具有更強的作用，而嗅黏膜來源的OECs在炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、防御反應(yīng)、細胞遷移等過程中起著關(guān)鍵作用[5]。對此，本文也對在生物支架研究中OECs的不同來源進行了總結(jié)，可以供研究者參考。未來可以進一步探索不同生物材料及物理結(jié)構(gòu)對不同來源OECs生物學(xué)功能的影響。目前的研究表明，OECs在體內(nèi)和體外的表達不同，例如，在體外，OECs作為神經(jīng)營養(yǎng)生長因子的來源促進軸突生長;在體內(nèi)，它們可以與新生軸突進行整合，實現(xiàn)髓鞘的再形成[60]。同時大量的研究仍局限于體外實驗，這說明仍然需要大量的動物實驗去證明基于OECs的生物支架在治療SCI中的作用。此外，利用前沿生物打印技術(shù)與細胞移植相結(jié)合也能進一步提高OECs的治療效果。本團隊也在積極探索構(gòu)建多功能多響應(yīng)式水凝膠，為進一步在治療SCI中應(yīng)用創(chuàng)造條件[61]。

未來的研究方向可能集中在以下幾個方面：首先構(gòu)建合適的促神經(jīng)生長藥物遞送系統(tǒng)與OECs移植相結(jié)合，可以提高OECs治療SCI的效果。此外，探索更微創(chuàng)的細胞遞送策略以改善神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的再生，最大限度地減少SCI后的二次損傷也是很有必要的，在未來可以利用微流控技術(shù)構(gòu)建“肽-OECs-水凝膠”水凝膠微球?qū)崿F(xiàn)藥物和細胞的微創(chuàng)遞送。同時，探索OECs來源的外泌體或聯(lián)合其他細胞共同用于細胞移植治療SCI也具有巨大的潛力。在神經(jīng)修復(fù)領(lǐng)域中的大量研究顯示導(dǎo)電聚合物可以引導(dǎo)軸突定向延伸，從而促進神經(jīng)再生，這意味著導(dǎo)電復(fù)合生物支架在脊髓損傷修復(fù)過程中具有重要的作用，通過添加導(dǎo)電聚合物與其他生物材料聯(lián)合應(yīng)用探索OECs的定向遷移與歸巢機制也是很有潛力的研究方向。最后，基于生物3D打印技術(shù)制造的支架可以精確地適合不規(guī)則的病變部位，同時可以通過模仿脊髓白質(zhì)和灰質(zhì)不同的神經(jīng)元密度和分布構(gòu)建三維仿生人工脊髓，是一項令人驚喜的發(fā)現(xiàn)?；贠ECs的生物3D打印支架卻沒有進一步研究。將OECs作為生物3D打印支架的種子細胞之一，同時結(jié)合多種細胞不同的生物學(xué)特性實現(xiàn)多細胞3D打印構(gòu)建新型三維仿生人工脊髓可以為未來實現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療奠定基礎(chǔ)?？傊贠ECs的復(fù)合三維仿生支架仍然值得研究者去進一步探索。