孟利花，謝戩芳，段培青，王泉麗，程 超，肖 玲

(1太原市中心醫(yī)院風濕免疫科，太原 030001；2山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院風濕免疫科；*通訊作者,E-mail:mlhproject12345111@163.com)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的由異常免疫反應引起的主要侵及小關節(jié)的慢性、對稱性、進行性風濕性疾病[1]。免疫細胞功能和/或數(shù)量的改變所致的慢性炎癥可促進RA患者滑膜關節(jié)軟骨退化和軟骨下骨侵蝕，亦累及多器官、多組織功能障礙從而增加死亡風險[2,3]，如間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)[4,5]。ILD是一組由慢性炎癥參與并介導的肺實質(zhì)疾病，主要表現(xiàn)為肺實質(zhì)不同程度的炎癥改變和纖維化破壞，其臨床表現(xiàn)、疾病進展和預后類型具有高度異質(zhì)性[6]。高分辨率CT (high-resolution computed tomography, HRCT)目前仍是發(fā)現(xiàn)早期肺組織病變和肺功能障礙最重要的方法，但亦存在局限性[7,8]。隨著對免疫學以及組織病理學的深入研究，淋巴細胞亞群在RA及ILD等免疫相關性疾病發(fā)病中的重要作用被進一步認知[3,9,10]。本研究通過觀察RA-ILD患者外周淋巴細胞水平的改變，發(fā)現(xiàn)在其發(fā)病機制中扮演重要角色的淋巴細胞亞群，為RA-ILD的診斷與治療提供新的理念與靶點。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集2017年1月至2019年9月在山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院風濕免疫科就診的RA患者143例，其中合并ILD共43例，未合并ILD患者100例。所有的RA患者均滿18周歲且符合美國風濕病學會(ARA)1987年和2010年修訂的RA分類標準[11,12]，并且完善外周血淋巴細胞檢測及一般實驗室化驗及檢查。所有的RA患者均行肺部高分辨CT(high-resolution computed tomography，HRCT)檢查，有網(wǎng)格狀、蜂窩狀、牽引性支氣管擴張等ILD影像學指標和ILD臨床特征的43例患者被診斷為RA-ILD[13]。

RA患者排除標準：①合并其余風濕性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、銀屑病關節(jié)炎等；②曾診斷結(jié)核、結(jié)節(jié)病、淀粉樣變，及有惡性腫瘤病史；③近期有嚴重感染或慢性感染處于活動期患者，有HIV、病毒性肝炎等感染史；④合并有嚴重的肝、腎、心、肺功能障礙者。

本研究篩選同期就診于本院體檢中心且性別、年齡相匹配的的健康受試者57例，其中女性36例，男性21例，平均年齡(60±3.89)歲，均無風濕性疾病及ILD病史，且符合以上排除標準。收集所有健康人群外周血并用流式細胞術檢測淋巴細胞亞群水平，檢測經(jīng)費由研究人員課題經(jīng)費資助。所有健康人群均知情同意。研究方案已通過山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院倫理委員會批準(2016 KY-007)。

1.2 觀察指標

1.2.1 一般資料 收集所有受試者的性別、年齡，以及所有患者的用藥方案、病程、關節(jié)腫脹數(shù)(swollen joint count，SJC)、關節(jié)壓痛數(shù)(tender joint count，TJC)、以及疾病活動評分(disease activity score，DAS)28等資料。

1.2.2 一般實驗室指標 包括紅細胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、白細胞計數(shù)(white blood cell，WBC)、紅細胞計數(shù)(red blood cell，RBC)、血小板計數(shù)(platelet，PLT)、淋巴細胞(lymphocyte，LY)和血小板/淋巴細胞比值(platelet/lymphocyte ratio，PLR)。

1.2.3 淋巴細胞水平 流式細胞術檢測所有受試者外周血中淋巴細胞亞群絕對計數(shù)及百分比，包括T、B、CD4+T、CD8+T、NK細胞以及包括Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞和調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg)在內(nèi)的CD4+T細胞亞群。

1.3 淋巴細胞檢測方法

1.3.1 標本采集 受試者清晨空腹狀態(tài)下采集靜脈血，置于肝素鈉抗凝管，搖勻后置于室溫。

1.3.2 流式細胞術檢測外周血淋巴細胞亞群 熒光標記的單克隆抗體：異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CD3抗體、藻紅蛋白(PE)標記的CD8、CD16、CD56抗體、多甲藻素葉綠蛋白(PerCP)標記的CD45抗體、別藻藍蛋白(APC)標記的CD4、CD19抗體。用上述抗體孵育淋巴細胞T(CD3+CD19-)、B(CD3-CD19+)、CD4+T(CD3+CD4+)、CD8+T(CD3+CD8+)、NK(CD3-/CD16+CD56+)，隨后用流式細胞儀及Procount法分析細胞絕對計數(shù)及百分比。

1.3.3 流式細胞術檢測CD4+T淋巴細胞亞群 Th1(CD4+IFN-γ+)/Th2(CD4+IL-4+)/Th17(CD4+IL-17+)細胞:分別將10 μl PMA、10 μl Ionomycin和1 μl GolgiStop加入80 μl肝素抗凝靜脈血細胞，37 ℃溫育5 h。隨后將標本分為A和B管，均加入抗CD4-FITC抗體染色，在室溫下避光放置30 min，A管加入人抗IL-4-PE與IFN-γ-APC，B管加入人抗IL-17-PE，室溫放置30 min后用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌細胞，上機檢測。

Treg細胞(CD4+CD25+Foxp3+)：80 μl肝素抗凝靜脈血用人抗CD4-FITC和抗CD25-APC進行表面標記，避光孵育30 min后，用人抗Foxp3-PE進行染色，上機檢測。

上述細胞在24 h內(nèi)通過流式細胞儀(Calibur，BD，USA)進行檢測，并基于正向(FSC)和側(cè)向(SSC)散射圖案的門分化淋巴細胞。計算CellQuest軟件(Becton-Dickinson)檢測門中的104個細胞并分析百分比以分析淋巴細胞各亞群水平，其中CD4+T淋巴細胞各亞群的細胞絕對計數(shù)=各亞群陽性細胞的百分比×CD4+T細胞絕對數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 RA合并與不合并ILD患者一般資料比較

本研究共納入100例RA-non-ILD患者與43例RA-ILD患者，RA-ILD患者病程明顯長于RA-non-ILD患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組間年齡、性別及甲氨蝶呤、來氟米特等免疫抑制藥物的用藥比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1)。

表1 RA-non-ILD與RA-ILD患者一般資料及免疫抑制藥物用藥情況

2.2 RA-non-ILD與RA-ILD患者一般實驗室指標比較

RA-ILD組的PLT和PLR值明顯高于RA-non-ILD組，其余疾病活動度指標ESR、CRP、TJC、SJC和DAS28以及WBC、RBC、和LY水平無明顯差異(P>0.05，見表2)。

表2 RA-non-ILD與RA-ILD患者疾病活動度及一般實驗室指標比較 M(Q25，Q75)

2.3 健康對照(HC)、RA-non-ILD與RA-ILD外周血淋巴細胞水平比較

與HC相比，RA-non-ILD患者外周T細胞、CD8+T細胞、NK細胞絕對數(shù)明顯下降，CD4+T細胞百分比升高，而RA-ILD患者外周T細胞與B細胞數(shù)目下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。相比于RA-non-ILD患者，RA-ILD患者的T細胞數(shù)目與CD4+T細胞數(shù)目及百分比下降，而CD8+T細胞百分比升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表3)。

表3 HC、RA-non-ILD和RA-ILD患者外周淋巴細胞亞群水平比較 M(Q25，Q75)

2.4 HC組、RA-non-ILD與RA-ILD外周CD4+T淋巴細胞亞群水平比較

無論是否合并ILD，RA患者的Th1細胞與Treg細胞絕對計數(shù)、Th1細胞百分比以及Th1/Th2均明顯低于HC，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而僅有合并ILD的RA患者外周血中Th17細胞下降(P<0.05)。另外，與RA-non-ILD患者相比，在所有的CD4+T細胞亞群中，RA-ILD患者中只有Th2細胞計數(shù)下降(P<0.05，見表4)。

表4 HC、RA-non-ILD、RA-ILD患者外周CD4+T亞群細胞水平比較 M(Q25，Q75)

2.5 RA合并ILD的淋巴細胞亞群相關危險因素

以RA患者是否合并ILD為因變量(合并ILD賦值為1，未合并ILD賦值為0)，將前期組間分析中三組間存在差異的指標分別作為協(xié)變量，利用二元logistics回歸方程進一步分析RA患者發(fā)生ILD的相關因素。由表5可知，在納入的指標中，僅有病程、CD4+T細胞數(shù)及百分比、Th2細胞數(shù)與RA患者是否合并ILD存在相關性(P<0.05)。換言之，病程越長、CD4+T細胞與Th2細胞數(shù)目下降以及CD4+T細胞百分比的下降是RA患者合并ILD的危險因素。

3 討論

由于ILD具有高度異質(zhì)性，并且可導致結(jié)締組織病的診斷和治療復雜化，其發(fā)病機制、診斷和治療受到越來越多的關注[14]。ILD是RA患者死亡的重要原因之一[5]，雖然目前RA-ILD確切的發(fā)病機制仍未完全闡明，臨床治療方案尚存在爭議，但已有諸多研究[3,9,10,15]證實無論是RA還是ILD，淋巴細胞水平異常所介導的免疫功能紊亂均在其發(fā)病過程中扮演著重要的、不可或缺的角色。因而，探討RA-ILD患者外周淋巴細胞水平的改變對于其發(fā)生發(fā)展過程中免疫機制的深入研究以及臨床的診療新理念的建立具有重要的意義。

表5 二元logistic回歸分析RA合并ILD的危險因素

本研究中，在年齡、性別相匹配的情況下，RA-ILD患者有更長的病程，發(fā)生ILD的風險隨著RA病程的延長而增加[7]。相比于未合并ILD的RA患者，RA-ILD患者有更高的PLR值。作為一種簡單、可靠且廉價的反映全身炎癥的實驗室指標，PLR已被作為各種癌癥和心血管疾病的預后或診斷標志物[16]。在最近的研究中發(fā)現(xiàn)RA患者的PLR水平顯著高于健康對照，表明PLR可能是提示RA患者亞臨床慢性炎癥的潛在指標[17]。Chen等[16]發(fā)現(xiàn)PLR值在RA-ILD患者中升高，顯著高于RA-non-ILD患者及健康對照，這與本研究結(jié)果相似。但本研究在logistics回歸中并未發(fā)現(xiàn)PLR對于RA患者發(fā)生ILD的影響，與既往研究[16]中PLR可用作區(qū)分RA-ILD患者與RA-non-ILD患者的新型生物標志物這一觀點存在差異，這或許與納入病例數(shù)和觀察對象的基本特征存在差異有關。

與健康對照相比，RA患者無論是否合并ILD，其外周淋巴細胞數(shù)目均有一定程度的改變，其中RA-non-ILD患者的T細胞、CD8+T細胞、NK細胞下降，而RA-ILD患者外周T細胞與B細胞數(shù)目下降。但與未合并ILD患者組相比，RA-ILD患者的T細胞、CD4+T細胞數(shù)目下降，提示T細胞，尤其是CD4+T細胞參與RA患者中ILD的發(fā)生發(fā)展，其余淋巴細胞的下降或許與RA的免疫機制相關。T淋巴細胞是體內(nèi)主要的免疫細胞類型之一，多聚集于肺組織間質(zhì)纖維化和蜂窩狀改變的區(qū)域，在相對正常的肺組織區(qū)域較少[18]，炎癥T細胞的浸潤被認為是肺纖維化過程中最先發(fā)生的病理改變[19]。隨著肺部炎癥和纖維化的進程，T淋巴細胞會進一步浸潤并分化[20]。特發(fā)性肺纖維化患者的肺實質(zhì)中浸潤有大量的CD4+T細胞[20]。RA-ILD患者支氣管肺泡灌洗液及肺組織病理活檢中均可觀察到炎性細胞的聚集，大多數(shù)CD4+T細胞和CD20+淋巴細胞聚集在淋巴濾泡、肺泡壁和T淋巴細胞中，提示CD4+T淋巴細胞在RA患者發(fā)生ILD中有著重要作用[21]，而淋巴細胞在病變組織的聚集或許是外周血中相應細胞亞群減少的原因之一。

CD4+T淋巴細胞在抗原刺激及相應細胞因子的作用下，可分化為多種細胞亞群，其中應用及研究最為廣泛的是Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞以及Treg細胞，也是本研究中觀察的指標。既往雖無研究觀察外周CD4+T細胞在RA-ILD中的水平，但有一項病例報道稱RA-ILD患者經(jīng)來氟米特治療后出現(xiàn)肺損傷的同時，外周血淋巴細胞顯著下降，隨著肺功能的恢復，淋巴細胞也隨之恢復至基線水平，提示淋巴細胞水平參與肺損傷的過程[22]。與上述報道相似，本研究發(fā)現(xiàn)RA-ILD患者外周血Th1細胞、Th17細胞、Treg細胞絕對計數(shù)較之健康人群均明顯下降，但與RA-non-ILD患者相比，僅有Th2細胞計數(shù)在RA-ILD患者中是下降的，且可作為RA患者合并ILD的危險因素。這一結(jié)果提示以部分亞群細胞數(shù)目下降為主的CD4+T細胞亞群失衡參與了RA及RA-ILD的發(fā)生發(fā)展過程，而Th2細胞水平的下降與ILD的發(fā)生更為相關。

Th2細胞表達的細胞因子TGF-β，是一種有效的免疫抑制和抗炎調(diào)節(jié)因子，也是最有效的促纖維化細胞因子，細胞因子IL-4和IL-13可以通過激活成纖維細胞增殖和膠原蛋白的生成來促進肺纖維化的發(fā)展以促進愈合[23,24]。既往報道博來霉素刺激的T-bet-/-小鼠的肺纖維化形成與外周血中Th2細胞因子水平升高和促纖維化因子TGF-β1的表達升高有關[25]。在博來霉素刺激的肺纖維化小鼠模型中，過度表達Th2細胞分化重要因子GATA-3促進肺組織中TGF-β的表達，小鼠存活率下降，而外源性補充Th1細胞因子干擾素-γ可改善小鼠肺纖維化程度，提高生存率[26]。這一結(jié)果與Th2細胞促纖維化作用一致。特發(fā)性肺纖維化患者支氣管肺泡灌洗液中，CD4+T細胞上CXCR3的表達明顯降低，CCR4的表達明顯升高[27]，上述Th2細胞及細胞因子在肺組織中水平與本研究中所觀察到RA-ILD患者外周Th2細胞數(shù)目水平下降的結(jié)果存在矛盾，或許是外周參與肺組織纖維化過程的重要淋巴細胞Th2細胞在眾多趨化因子的作用下遷移至肺組織并表達相關細胞因子所致。另外，在RA的炎癥反應中，淋巴細胞可以通過啟動細胞凋亡級聯(lián)反應被清除[28]，導致淋巴細胞水平降低，這與本研究的結(jié)果一致。

綜上所述，Treg數(shù)目下降所介導的免疫耐受缺陷是RA發(fā)生的重要免疫學機制[3]，隨著RA病情的遷延及免疫失衡的加重，外周CD4+T細胞水平及Th2細胞的下降或許可促進ILD的進程，是RA患者發(fā)生ILD的危險因素，這為RA-ILD患者免疫治療及發(fā)病機制的深入研究方向提供初步臨床參考。