孟利花，謝戩芳，段培青，王泉麗，程 超，肖 玲

(1太原市中心醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，太原 030001；2山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科；*通訊作者,E-mail:mlhproject12345111@163.com)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的由異常免疫反應(yīng)引起的主要侵及小關(guān)節(jié)的慢性、對(duì)稱性、進(jìn)行性風(fēng)濕性疾病[1]。免疫細(xì)胞功能和/或數(shù)量的改變所致的慢性炎癥可促進(jìn)RA患者滑膜關(guān)節(jié)軟骨退化和軟骨下骨侵蝕，亦累及多器官、多組織功能障礙從而增加死亡風(fēng)險(xiǎn)[2,3]，如間質(zhì)性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)[4,5]。ILD是一組由慢性炎癥參與并介導(dǎo)的肺實(shí)質(zhì)疾病，主要表現(xiàn)為肺實(shí)質(zhì)不同程度的炎癥改變和纖維化破壞，其臨床表現(xiàn)、疾病進(jìn)展和預(yù)后類型具有高度異質(zhì)性[6]。高分辨率CT (high-resolution computed tomography, HRCT)目前仍是發(fā)現(xiàn)早期肺組織病變和肺功能障礙最重要的方法，但亦存在局限性[7,8]。隨著對(duì)免疫學(xué)以及組織病理學(xué)的深入研究，淋巴細(xì)胞亞群在RA及ILD等免疫相關(guān)性疾病發(fā)病中的重要作用被進(jìn)一步認(rèn)知[3,9,10]。本研究通過觀察RA-ILD患者外周淋巴細(xì)胞水平的改變，發(fā)現(xiàn)在其發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色的淋巴細(xì)胞亞群，為RA-ILD的診斷與治療提供新的理念與靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2017年1月至2019年9月在山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的RA患者143例，其中合并ILD共43例，未合并ILD患者100例。所有的RA患者均滿18周歲且符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ARA)1987年和2010年修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)[11,12]，并且完善外周血淋巴細(xì)胞檢測(cè)及一般實(shí)驗(yàn)室化驗(yàn)及檢查。所有的RA患者均行肺部高分辨CT(high-resolution computed tomography，HRCT)檢查，有網(wǎng)格狀、蜂窩狀、牽引性支氣管擴(kuò)張等ILD影像學(xué)指標(biāo)和ILD臨床特征的43例患者被診斷為RA-ILD[13]。

RA患者排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其余風(fēng)濕性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、銀屑病關(guān)節(jié)炎等；②曾診斷結(jié)核、結(jié)節(jié)病、淀粉樣變，及有惡性腫瘤病史；③近期有嚴(yán)重感染或慢性感染處于活動(dòng)期患者，有HIV、病毒性肝炎等感染史；④合并有嚴(yán)重的肝、腎、心、肺功能障礙者。

本研究篩選同期就診于本院體檢中心且性別、年齡相匹配的的健康受試者57例，其中女性36例，男性21例，平均年齡(60±3.89)歲，均無風(fēng)濕性疾病及ILD病史，且符合以上排除標(biāo)準(zhǔn)。收集所有健康人群外周血并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群水平，檢測(cè)經(jīng)費(fèi)由研究人員課題經(jīng)費(fèi)資助。所有健康人群均知情同意。研究方案已通過山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2016 KY-007)。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 一般資料 收集所有受試者的性別、年齡，以及所有患者的用藥方案、病程、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)(swollen joint count，SJC)、關(guān)節(jié)壓痛數(shù)(tender joint count，TJC)、以及疾病活動(dòng)評(píng)分(disease activity score，DAS)28等資料。

1.2.2 一般實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) 包括紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cell，WBC)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(red blood cell，RBC)、血小板計(jì)數(shù)(platelet，PLT)、淋巴細(xì)胞(lymphocyte，LY)和血小板/淋巴細(xì)胞比值(platelet/lymphocyte ratio，PLR)。

1.2.3 淋巴細(xì)胞水平 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所有受試者外周血中淋巴細(xì)胞亞群絕對(duì)計(jì)數(shù)及百分比，包括T、B、CD4+T、CD8+T、NK細(xì)胞以及包括Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)在內(nèi)的CD4+T細(xì)胞亞群。

1.3 淋巴細(xì)胞檢測(cè)方法

1.3.1 標(biāo)本采集 受試者清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集靜脈血，置于肝素鈉抗凝管，搖勻后置于室溫。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群 熒光標(biāo)記的單克隆抗體：異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CD3抗體、藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的CD8、CD16、CD56抗體、多甲藻素葉綠蛋白(PerCP)標(biāo)記的CD45抗體、別藻藍(lán)蛋白(APC)標(biāo)記的CD4、CD19抗體。用上述抗體孵育淋巴細(xì)胞T(CD3+CD19-)、B(CD3-CD19+)、CD4+T(CD3+CD4+)、CD8+T(CD3+CD8+)、NK(CD3-/CD16+CD56+)，隨后用流式細(xì)胞儀及Procount法分析細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)及百分比。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T淋巴細(xì)胞亞群 Th1(CD4+IFN-γ+)/Th2(CD4+IL-4+)/Th17(CD4+IL-17+)細(xì)胞:分別將10 μl PMA、10 μl Ionomycin和1 μl GolgiStop加入80 μl肝素抗凝靜脈血細(xì)胞，37 ℃溫育5 h。隨后將標(biāo)本分為A和B管，均加入抗CD4-FITC抗體染色，在室溫下避光放置30 min，A管加入人抗IL-4-PE與IFN-γ-APC，B管加入人抗IL-17-PE，室溫放置30 min后用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

Treg細(xì)胞(CD4+CD25+Foxp3+)：80 μl肝素抗凝靜脈血用人抗CD4-FITC和抗CD25-APC進(jìn)行表面標(biāo)記，避光孵育30 min后，用人抗Foxp3-PE進(jìn)行染色，上機(jī)檢測(cè)。

上述細(xì)胞在24 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀(Calibur，BD，USA)進(jìn)行檢測(cè)，并基于正向(FSC)和側(cè)向(SSC)散射圖案的門分化淋巴細(xì)胞。計(jì)算CellQuest軟件(Becton-Dickinson)檢測(cè)門中的104個(gè)細(xì)胞并分析百分比以分析淋巴細(xì)胞各亞群水平，其中CD4+T淋巴細(xì)胞各亞群的細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)=各亞群陽性細(xì)胞的百分比×CD4+T細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 RA合并與不合并ILD患者一般資料比較

本研究共納入100例RA-non-ILD患者與43例RA-ILD患者，RA-ILD患者病程明顯長(zhǎng)于RA-non-ILD患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組間年齡、性別及甲氨蝶呤、來氟米特等免疫抑制藥物的用藥比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

表1 RA-non-ILD與RA-ILD患者一般資料及免疫抑制藥物用藥情況

2.2 RA-non-ILD與RA-ILD患者一般實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

RA-ILD組的PLT和PLR值明顯高于RA-non-ILD組，其余疾病活動(dòng)度指標(biāo)ESR、CRP、TJC、SJC和DAS28以及WBC、RBC、和LY水平無明顯差異(P>0.05，見表2)。

表2 RA-non-ILD與RA-ILD患者疾病活動(dòng)度及一般實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 M(Q25，Q75)

2.3 健康對(duì)照(HC)、RA-non-ILD與RA-ILD外周血淋巴細(xì)胞水平比較

與HC相比，RA-non-ILD患者外周T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞絕對(duì)數(shù)明顯下降，CD4+T細(xì)胞百分比升高，而RA-ILD患者外周T細(xì)胞與B細(xì)胞數(shù)目下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相比于RA-non-ILD患者，RA-ILD患者的T細(xì)胞數(shù)目與CD4+T細(xì)胞數(shù)目及百分比下降，而CD8+T細(xì)胞百分比升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表3)。

表3 HC、RA-non-ILD和RA-ILD患者外周淋巴細(xì)胞亞群水平比較 M(Q25，Q75)

2.4 HC組、RA-non-ILD與RA-ILD外周CD4+T淋巴細(xì)胞亞群水平比較

無論是否合并ILD，RA患者的Th1細(xì)胞與Treg細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)、Th1細(xì)胞百分比以及Th1/Th2均明顯低于HC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而僅有合并ILD的RA患者外周血中Th17細(xì)胞下降(P<0.05)。另外，與RA-non-ILD患者相比，在所有的CD4+T細(xì)胞亞群中，RA-ILD患者中只有Th2細(xì)胞計(jì)數(shù)下降(P<0.05，見表4)。

表4 HC、RA-non-ILD、RA-ILD患者外周CD4+T亞群細(xì)胞水平比較 M(Q25，Q75)

2.5 RA合并ILD的淋巴細(xì)胞亞群相關(guān)危險(xiǎn)因素

以RA患者是否合并ILD為因變量(合并ILD賦值為1，未合并ILD賦值為0)，將前期組間分析中三組間存在差異的指標(biāo)分別作為協(xié)變量，利用二元logistics回歸方程進(jìn)一步分析RA患者發(fā)生ILD的相關(guān)因素。由表5可知，在納入的指標(biāo)中，僅有病程、CD4+T細(xì)胞數(shù)及百分比、Th2細(xì)胞數(shù)與RA患者是否合并ILD存在相關(guān)性(P<0.05)。換言之，病程越長(zhǎng)、CD4+T細(xì)胞與Th2細(xì)胞數(shù)目下降以及CD4+T細(xì)胞百分比的下降是RA患者合并ILD的危險(xiǎn)因素。

3 討論

由于ILD具有高度異質(zhì)性，并且可導(dǎo)致結(jié)締組織病的診斷和治療復(fù)雜化，其發(fā)病機(jī)制、診斷和治療受到越來越多的關(guān)注[14]。ILD是RA患者死亡的重要原因之一[5]，雖然目前RA-ILD確切的發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，臨床治療方案尚存在爭(zhēng)議，但已有諸多研究[3,9,10,15]證實(shí)無論是RA還是ILD，淋巴細(xì)胞水平異常所介導(dǎo)的免疫功能紊亂均在其發(fā)病過程中扮演著重要的、不可或缺的角色。因而，探討RA-ILD患者外周淋巴細(xì)胞水平的改變對(duì)于其發(fā)生發(fā)展過程中免疫機(jī)制的深入研究以及臨床的診療新理念的建立具有重要的意義。

表5 二元logistic回歸分析RA合并ILD的危險(xiǎn)因素

本研究中，在年齡、性別相匹配的情況下，RA-ILD患者有更長(zhǎng)的病程，發(fā)生ILD的風(fēng)險(xiǎn)隨著RA病程的延長(zhǎng)而增加[7]。相比于未合并ILD的RA患者，RA-ILD患者有更高的PLR值。作為一種簡(jiǎn)單、可靠且廉價(jià)的反映全身炎癥的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，PLR已被作為各種癌癥和心血管疾病的預(yù)后或診斷標(biāo)志物[16]。在最近的研究中發(fā)現(xiàn)RA患者的PLR水平顯著高于健康對(duì)照，表明PLR可能是提示RA患者亞臨床慢性炎癥的潛在指標(biāo)[17]。Chen等[16]發(fā)現(xiàn)PLR值在RA-ILD患者中升高，顯著高于RA-non-ILD患者及健康對(duì)照，這與本研究結(jié)果相似。但本研究在logistics回歸中并未發(fā)現(xiàn)PLR對(duì)于RA患者發(fā)生ILD的影響，與既往研究[16]中PLR可用作區(qū)分RA-ILD患者與RA-non-ILD患者的新型生物標(biāo)志物這一觀點(diǎn)存在差異，這或許與納入病例數(shù)和觀察對(duì)象的基本特征存在差異有關(guān)。

與健康對(duì)照相比，RA患者無論是否合并ILD，其外周淋巴細(xì)胞數(shù)目均有一定程度的改變，其中RA-non-ILD患者的T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞下降，而RA-ILD患者外周T細(xì)胞與B細(xì)胞數(shù)目下降。但與未合并ILD患者組相比，RA-ILD患者的T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞數(shù)目下降，提示T細(xì)胞，尤其是CD4+T細(xì)胞參與RA患者中ILD的發(fā)生發(fā)展，其余淋巴細(xì)胞的下降或許與RA的免疫機(jī)制相關(guān)。T淋巴細(xì)胞是體內(nèi)主要的免疫細(xì)胞類型之一，多聚集于肺組織間質(zhì)纖維化和蜂窩狀改變的區(qū)域，在相對(duì)正常的肺組織區(qū)域較少[18]，炎癥T細(xì)胞的浸潤(rùn)被認(rèn)為是肺纖維化過程中最先發(fā)生的病理改變[19]。隨著肺部炎癥和纖維化的進(jìn)程，T淋巴細(xì)胞會(huì)進(jìn)一步浸潤(rùn)并分化[20]。特發(fā)性肺纖維化患者的肺實(shí)質(zhì)中浸潤(rùn)有大量的CD4+T細(xì)胞[20]。RA-ILD患者支氣管肺泡灌洗液及肺組織病理活檢中均可觀察到炎性細(xì)胞的聚集，大多數(shù)CD4+T細(xì)胞和CD20+淋巴細(xì)胞聚集在淋巴濾泡、肺泡壁和T淋巴細(xì)胞中，提示CD4+T淋巴細(xì)胞在RA患者發(fā)生ILD中有著重要作用[21]，而淋巴細(xì)胞在病變組織的聚集或許是外周血中相應(yīng)細(xì)胞亞群減少的原因之一。

CD4+T淋巴細(xì)胞在抗原刺激及相應(yīng)細(xì)胞因子的作用下，可分化為多種細(xì)胞亞群，其中應(yīng)用及研究最為廣泛的是Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞以及Treg細(xì)胞，也是本研究中觀察的指標(biāo)。既往雖無研究觀察外周CD4+T細(xì)胞在RA-ILD中的水平，但有一項(xiàng)病例報(bào)道稱RA-ILD患者經(jīng)來氟米特治療后出現(xiàn)肺損傷的同時(shí)，外周血淋巴細(xì)胞顯著下降，隨著肺功能的恢復(fù)，淋巴細(xì)胞也隨之恢復(fù)至基線水平，提示淋巴細(xì)胞水平參與肺損傷的過程[22]。與上述報(bào)道相似，本研究發(fā)現(xiàn)RA-ILD患者外周血Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)較之健康人群均明顯下降，但與RA-non-ILD患者相比，僅有Th2細(xì)胞計(jì)數(shù)在RA-ILD患者中是下降的，且可作為RA患者合并ILD的危險(xiǎn)因素。這一結(jié)果提示以部分亞群細(xì)胞數(shù)目下降為主的CD4+T細(xì)胞亞群失衡參與了RA及RA-ILD的發(fā)生發(fā)展過程，而Th2細(xì)胞水平的下降與ILD的發(fā)生更為相關(guān)。

Th2細(xì)胞表達(dá)的細(xì)胞因子TGF-β，是一種有效的免疫抑制和抗炎調(diào)節(jié)因子，也是最有效的促纖維化細(xì)胞因子，細(xì)胞因子IL-4和IL-13可以通過激活成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白的生成來促進(jìn)肺纖維化的發(fā)展以促進(jìn)愈合[23,24]。既往報(bào)道博來霉素刺激的T-bet-/-小鼠的肺纖維化形成與外周血中Th2細(xì)胞因子水平升高和促纖維化因子TGF-β1的表達(dá)升高有關(guān)[25]。在博來霉素刺激的肺纖維化小鼠模型中，過度表達(dá)Th2細(xì)胞分化重要因子GATA-3促進(jìn)肺組織中TGF-β的表達(dá)，小鼠存活率下降，而外源性補(bǔ)充Th1細(xì)胞因子干擾素-γ可改善小鼠肺纖維化程度，提高生存率[26]。這一結(jié)果與Th2細(xì)胞促纖維化作用一致。特發(fā)性肺纖維化患者支氣管肺泡灌洗液中，CD4+T細(xì)胞上CXCR3的表達(dá)明顯降低，CCR4的表達(dá)明顯升高[27]，上述Th2細(xì)胞及細(xì)胞因子在肺組織中水平與本研究中所觀察到RA-ILD患者外周Th2細(xì)胞數(shù)目水平下降的結(jié)果存在矛盾，或許是外周參與肺組織纖維化過程的重要淋巴細(xì)胞Th2細(xì)胞在眾多趨化因子的作用下遷移至肺組織并表達(dá)相關(guān)細(xì)胞因子所致。另外，在RA的炎癥反應(yīng)中，淋巴細(xì)胞可以通過啟動(dòng)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)被清除[28]，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞水平降低，這與本研究的結(jié)果一致。

綜上所述，Treg數(shù)目下降所介導(dǎo)的免疫耐受缺陷是RA發(fā)生的重要免疫學(xué)機(jī)制[3]，隨著RA病情的遷延及免疫失衡的加重，外周CD4+T細(xì)胞水平及Th2細(xì)胞的下降或許可促進(jìn)ILD的進(jìn)程，是RA患者發(fā)生ILD的危險(xiǎn)因素，這為RA-ILD患者免疫治療及發(fā)病機(jī)制的深入研究方向提供初步臨床參考。