殷軍鋒 顧明

結(jié)腸癌是一種發(fā)生于乙狀結(jié)腸與直腸交界處的消化道惡性腫瘤，我國結(jié)腸癌發(fā)病率與死亡率逐年上升，早期診斷及治療是改善結(jié)腸癌病人預(yù)后的關(guān)鍵，因而探究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制對尋找有效的治療方法、改善病人預(yù)后意義重大[1-2]。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)在結(jié)腸癌中表達(dá)異常，并可參與結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展過程[3-4]。circ_0007385在非小細(xì)胞肺癌組織及細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，敲低其表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[5]。circ RNA Interactome預(yù)測顯示,circ_0007385與miR-485-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，研究表明,miR-485-3p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌的發(fā)展進(jìn)程[6]。因此，本研究主要探討circ_0007385是否可通過靶向調(diào)控miR-485-3p的表達(dá)而調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移及凋亡。

材料與方法

一、材料與試劑

收集2019年3月～2020年6月本院收治的43例結(jié)腸癌病人的結(jié)腸癌組織及其相應(yīng)癌旁組織(>5 cm處的正常組織)標(biāo)本，男23例，女20例，年齡50～68歲，平均年齡(55.36±3.26)歲。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求，且入組病人或其近親屬同意使用其組織樣本。

人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480購自上海奧陸生物科技有限公司；CCK-8試劑、凋亡檢測試劑盒、胎牛血清、胰蛋白酶、Transwell小室購自北京索萊寶；Trizol試劑、Lipofectamine 3000 Transfection Reagent購自美國Invitrogen；反轉(zhuǎn)錄試劑、熒光定量PCR試劑購自美國Thermo Fisher；miR-485-3p Inhibitor、si-NC、si-circ_0007385、miR-NC、miR-485-3p mimic、購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；兔抗人cleaved-caspase3抗體與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物。

二、方法

1.實(shí)驗(yàn)分組：SW480細(xì)胞接種于6孔板(1×105個/孔)，待細(xì)胞生長融合度達(dá)到70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別稀釋si-NC、si-circ_0007385、miR-NC、miR-485-3p mimic、si-circ_0007385和miR-485-3p Inhibitor，分別記為si-NC組、si-circ_0007385組、miR-NC組、miR-485-3p mimic組、si-circ_0007385+miR-485-3p Inhibitor組。同時將正常培養(yǎng)的SW480細(xì)胞記為control組。

2.qRT-PCR檢測circ_0007385、miR-485-3p的表達(dá)水平：采用Trizol試劑分別提取癌旁組織(43例)、結(jié)腸癌組織(43例)與各組SW480細(xì)胞總RNA，測定RNA濃度后。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA、上下游引物與實(shí)時qRT-PCR預(yù)混液混合進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。應(yīng)用羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀檢測circ_0007385、miR-485-3p相對表達(dá)量。

3.雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)檢測circ_0007385與miR-485-3p的靶向關(guān)系：將WT-circ_0007385與miR-NC、WT-circ_0007385與miR-485-3p mimic、MUT-circ_0007385與miR-NC、MUT-circ_0007385與miR-485-3p mimic分別共轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞，培養(yǎng)24 小時后，檢測細(xì)胞熒光素酶活性。

4.CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖：收集各組SW480細(xì)胞以1×104個/孔的密度接種96孔板，分別于培養(yǎng)24、48、72 小時分別加入10 μl CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 小時后用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值(OD 450 nm)。

5.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)：取各組SW480細(xì)胞接種于6孔板(1×103個/孔)，于37℃、5% CO2體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)箱14 天后棄培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛固定20 分鐘，0.1%結(jié)晶紫染色5 分鐘，PBS洗滌后晾干，于顯微鏡下統(tǒng)計直徑大于0.1 mm的細(xì)胞克隆形成數(shù)。

6.劃痕實(shí)驗(yàn)：取各組SW480細(xì)胞接種于6孔板(1×104個/孔)，待細(xì)胞長滿后用200 μl移液管槍頭劃下細(xì)胞，于顯微鏡下拍照(0 小時)，繼續(xù)培養(yǎng)24 小時后于顯微鏡下拍照(24 小時)，應(yīng)用ImageJ軟件檢測劃痕寬度并計算劃痕愈合率[(0 h小時劃痕寬度-24 小時劃痕寬度)/0 小時劃痕寬度×100%]。

7.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移：取各組SW480細(xì)胞(1×105個/ml)加入小室的上室(200 μl/孔)，取600 μl完全培養(yǎng)液加入下室，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 小時。多聚甲醛固定穿膜細(xì)胞20 分鐘，0.1%結(jié)晶紫染色10 分鐘，顯微鏡下觀察遷移情況，細(xì)胞遷移數(shù)以隨機(jī)3個視野染色細(xì)胞數(shù)的均值表示。

8.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率：預(yù)冷PBS洗滌各組SW480細(xì)胞，3 000 r/min離心6 分鐘，向細(xì)胞沉淀中加入500 μl結(jié)合緩沖液，重懸后按照凋亡試劑盒說明書操作并應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

9.Western blot檢測cleaved-caspase3蛋白表達(dá)量：取各組SW480細(xì)胞加入蛋白裂解液提取總蛋白，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，100 ℃孵育10 分鐘，電泳反應(yīng)后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%牛血清白蛋白封閉PVDF膜1 小時，加入內(nèi)參GAPDH抗體(1∶2 000)、cleaved-caspase3一抗(1∶1 000)稀釋液，4 ℃孵育24 小時，室溫下加入二抗(1∶5 000)稀釋液孵育2 小時。ECL發(fā)光液作用后顯影，ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié)果

1.circ_0007385和miR-485-3p表達(dá)的檢測：結(jié)腸癌組織中circ_0007385的表達(dá)量高于癌旁組織(P<0.05)，miR-485-3p的表達(dá)量低于癌旁組織(P<0.05)，見圖1A～B。采用Pearson法分析結(jié)腸癌組織中circ_0007385、miR-485-3p表達(dá)量的相關(guān)性，結(jié)果顯示，circ_0007385與miR-485-3p呈負(fù)相關(guān)(r=-0.972，P<0.001)，見圖1C。si-circ_0007385組circ_0007385的表達(dá)量低于control組和si-NC組(P<0.05)，見圖1D。與control組、si-NC組比較，si-circ_0007385組miR-485-3p的表達(dá)量升高(P<0.05)；與control組、miR-NC組比較，miR-485-3p mimic組miR-485-3p的表達(dá)量升高(P<0.05)；與si-circ_0007385組比較，si-circ_0007385+miR-485-3p Inhibitor組miR-485-3p的表達(dá)量降低(P<0.05)，見圖1E。

A：結(jié)腸癌組織中circ_0007385高表達(dá)；B：結(jié)腸癌組織中miR-485-3p低表達(dá)；C： circ_0007385和miR-485-3p負(fù)相關(guān)；D：circ_0007385表達(dá)的檢測；E：miR-485-3p表達(dá)的檢測注：與control組相比，aP<0.05；與si-NC組相比，bP<0.05；與miR-NC組相比，cP<0.05；與si-circ_0007385組相比，dP<0.05N：癌旁組織；C：結(jié)腸癌組織(43例)圖1 circ_0007385和miR-485-3p表達(dá)的檢測

2.circ_0007385和miR-485-3p靶向關(guān)系的驗(yàn)證：circ RNA Interactome預(yù)測顯示circ_0007385與miR-485-3p存在互補(bǔ)序列，見圖2。miR-485-3p過表達(dá)可降低WT-circ_0007385的熒光素酶活性(P<0.05)，而未能抑制MUT-circ_0007385的熒光素酶活性，見圖2B。表明circ_0007385與miR-485-3p存在靶向關(guān)系。

圖2 circ_0007385和miR-485-3p互補(bǔ)序列及熒光素酶活性檢測

3.同時抑制circ_0007385和miR-485-3p對SW480增殖的檢測：與control組、si-NC組比較，si-circ_0007385組細(xì)胞活力降低(P<0.05)，集落形成數(shù)減少(P<0.05)；與miR-NC組比較，miR-485-3p mimic組細(xì)胞活力降低(P<0.05)，集落形成數(shù)減少(P<0.05)；與si-circ_0007385組比較，si-circ_0007385+miR-485-3p Inhibitor組細(xì)胞活力升高(P<0.05)，集落形成數(shù)增多(P<0.05)，見表1。

表1 各個處理組細(xì)胞活性和集落形成數(shù)的檢測

4.同時抑制circ_0007385和miR-485-3p對SW480遷移的檢測：與control組、si-NC組比較，si-circ_0007385組劃痕愈合率降低(P<0.05)，遷移細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)；與miR-NC組比較，miR-485-3p mimic組劃痕愈合率降低(P<0.05)，遷移細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)；與si-circ_0007385組比較，si-circ_0007385+miR-485-3p Inhibitor組劃痕愈合率升高(P<0.05)，遷移細(xì)胞數(shù)增多(P<0.05)，見表2。

表2 各個處理組細(xì)胞遷移能力的檢測

5.同時抑制circ_0007385和miR-485-3p對SW480凋亡的檢測:與control組、si-NC組比較，si-circ_0007385組細(xì)胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白水平升高(P<0.05)；與miR-NC組比較，miR-485-3p mimic組細(xì)胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白水平升高(P<0.05)；與si-circ_0007385組比較，si-circ_0007385+miR-485-3p Inhibitor組細(xì)胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白水平降低(P<0.05)，見圖3、表3。

表3 各個處理組細(xì)胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表達(dá)的檢測

討論

circ_0007385在非小細(xì)胞肺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)較高，并且與較差的總生存期相關(guān)，沉默circ_0007385可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[8]。但circ_0007385在結(jié)腸癌中的表達(dá)尚未可知。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中circ_0007385的表達(dá)量升高，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，沉默circ_0007385后結(jié)腸癌細(xì)胞活力降低，集落形成數(shù)與遷移細(xì)胞數(shù)減少，劃痕愈合率降低。研究表明caspase3屬于凋亡執(zhí)行因子，其被激活后可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[9-10]。本研究結(jié)果顯示，沉默circ_0007385后結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率和cleaved-caspase3蛋白水平升高，提示沉默circ_0007385可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。表明circ_0007385高表達(dá)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移，從而參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程。

為進(jìn)一步探究circ_0007385在結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展過程中的作用機(jī)制，本研究證實(shí)circ_0007385基因序列上包含miR-485-3p的結(jié)合位點(diǎn)。研究表明，miR-485-3p在腎癌組織和細(xì)胞中表達(dá)水平降低，上調(diào)其表達(dá)可抑制腎癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[11]。miR-485-3p在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中呈低表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖及遷移[12]。miR-485-3p在結(jié)直腸癌中表達(dá)下調(diào)，miR-485-3p過表達(dá)可靶向程序性細(xì)胞死亡受體配體1(PDL1)表達(dá)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13]。miR-485-3p高表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移[14]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中miR-485-3p的表達(dá)量降低，circ_0007385與miR-485-3p呈負(fù)相關(guān)，miR-485-3p過表達(dá)可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖、遷移能力，而抑制miR-485-3p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)沉默circ_0007385對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移及凋亡的作用。提示circ_0007385可通過靶向調(diào)控miR-485-3p的表達(dá)而參與結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展過程。

綜上所述，結(jié)腸癌組織中circ_0007385的表達(dá)水平升高，miR-485-3p的表達(dá)水平降低，circ_0007385與miR-485-3p呈負(fù)相關(guān)且circ_0007385可靶向結(jié)合miR-485-3p，沉默circ_0007385可通過上調(diào)miR-485-3p表達(dá)而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖和遷移，circ_0007385/miR-485-3p可能作為結(jié)腸癌診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物及其治療的潛在靶點(diǎn)。但circ_0007385基因序列上富含多個miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，其是否可通過靶向調(diào)控其他miRNA而參與結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展過程尚需進(jìn)一步探究。