宓嘉輝 周健 楊帆

熒光顯像技術是生物實時顯像領域非常重要的技術手段。與傳統(tǒng)的放射顯像技術相比，熒光顯像因其具有更高的安全性和分辨率而具有突出優(yōu)勢[1]。對于熒光顯像技術而言，需要其具備對深部結構的成像能力以及更高的信背比(signal-to-background ratio,SBR)才能更好地協(xié)助外科醫(yī)師在術中實時識別特定目標組織結構[2]。然而，光子在穿過人體組織的過程中會發(fā)生吸收和散射現(xiàn)象，對于波長較短的可見光(400～700 nm)，光子很難穿過人體組織從而導致無法實現(xiàn)深部組織結構的實時顯像[3]。此外，人體組織本身存在自發(fā)熒光現(xiàn)象，當組織自發(fā)熒光與目標組織結構的熒光信號相互重合覆蓋時，會導致SBR明顯降低。這些因素使得采用可見光波段實現(xiàn)術中實時顯像存在一定限制[4]。相較于可見光，近紅外熒光由于其具有更長的波長，光子在人體組織中的吸收和散射有所降低。雖然已有相關研究表明，一區(qū)近紅外(near-infrared-Ⅰ window,NIR-Ⅰ,700～900 nm)熒光可以更好地穿透生物組織，如皮膚和脂肪等，但NIR-Ⅰ熒光顯像對深層組織的成像質(zhì)量仍需進一步提高[5]。

二區(qū)近紅外(near-infrared-Ⅱ window,NIR-Ⅱ,1 000～1 700 nm)熒光顯像技術被認為可以進一步提升熒光顯像的穿透深度以及分辨率[6]。隨著銦砷化鎵(InGaAs)相機的快速發(fā)展，NIR-Ⅱ熒光顯像的效果有了顯著的提高，為臨床轉化提供了幫助[7]。此外，除了傳統(tǒng)熒光染料吲哚菁綠(indocyanine green,ICG)已被證實適用于NIR-Ⅱ熒光顯像，一系列新型NIR-Ⅱ熒光探針也已經(jīng)被開發(fā)并利用，其中包括有機小分子，單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes,SWCNTs)，稀土納米顆粒(rare-earth-doped nanoparticles,RENPs)，半導體量子點(quantum dots,QDs)以及共軛聚合物等各類材料[3]。該技術可以進行術中目標組織結構的實時準確識別定位，促進外科手術朝著更加精準化的方向發(fā)展。本文將圍繞NIR-Ⅱ熒光顯像技術在外科領域的應用進行綜述，并對該技術的下一步發(fā)展前景展開討論。

一、實體腫瘤顯像

在外科領域，NIR-Ⅱ熒光應用最廣泛的是實體腫瘤的術中實時顯像。實現(xiàn)實體腫瘤NIR-Ⅱ熒光顯像的熒光探針主要分為兩類，一類是以ICG為代表的可以在腫瘤位置發(fā)生聚集，從而實現(xiàn)實體瘤實時顯像的非特異性熒光染料；另一類是根據(jù)不同腫瘤特異性表達靶點，采用與之相對應的靶向受體與NIR-Ⅱ熒光染料相結合所構成的NIR-Ⅱ靶向熒光探針[8]。

ICG作為一種已被批準用于臨床的非特異性靶向熒光染料，表現(xiàn)出了優(yōu)越的實體腫瘤顯像效果[9]。Hu等[10]首次將NIR-Ⅱ熒光應用于肝癌手術實時顯像,結果顯示，NIR-Ⅱ熒光對于肝癌主病灶的顯像效果較傳統(tǒng)顯像方法有明顯提升，并且利用NIR-Ⅱ熒光顯像可以在術中發(fā)現(xiàn)術前未明確診斷的額外微小肝癌病灶。該研究還證實了NIR-Ⅱ熒光在生物組織中的穿透能力顯著提升。此外，一些新型的非特異性NIR-Ⅱ熒光探針也被成功制備并被證明可以在實體腫瘤顯像中取得相較于ICG更好的顯像效果[11-12]。

一般認為，采用非特異性熒光染料進行實體腫瘤術中顯像是通過腫瘤組織的高通透性和滯留(enhanced permeability and retention，EPR) 效應所實現(xiàn)[13-14]，即腫瘤區(qū)域新生的血管結構完整性較差，淋巴引流受損而導致大分子物質(zhì)可以順利地在腫瘤組織中富集[15]。然而，最新的研究提示，大分子在腫瘤區(qū)域的富集可能不僅僅是由于EPR效應所導致[16]。在臨床實踐中也可以觀察到，采用非特異性熒光染料實現(xiàn)NIR-Ⅱ熒光顯像，雖然可以對絕大部分實體瘤展現(xiàn)出良好的顯像效果，但其對于某些腫瘤顯像效果不佳，甚至有可能出現(xiàn)假陽性的顯像結果[10]，而NIR-Ⅱ靶向熒光探針有可能進一步解決以上問題。

尿激酶型纖溶酶原激活劑受體(urokinase plasminogen activator receptor,uPAR) 已被證實在膠質(zhì)母細胞瘤中存在過表達的現(xiàn)象[17]。Kurbegovic等[18]利用uPAR特異性多肽(AE105)與NIR-Ⅱ熒光團相結合制作出了新型NIR-Ⅱ靶向熒光探針，實現(xiàn)了膠質(zhì)母細胞瘤的特異性實時顯像。通過這種方法，外科醫(yī)師可以在術中實時觀測腫瘤的位置，并且可以根據(jù)熒光顯像情況明確腫瘤的邊界從而保證腫瘤的完整切除。目前，已有多種針對不同腫瘤高表達物質(zhì)為目標而設計的NIR-Ⅱ靶向熒光探針實現(xiàn)了優(yōu)異的NIR-Ⅱ熒光顯像效果[19-20]。

二、前哨淋巴結示蹤

前哨淋巴結(sentinel lymph nodes,SLN)是指區(qū)域淋巴引流區(qū)中最先接受腫瘤淋巴引流并發(fā)生轉移的淋巴結[21]。術中準確識別前哨淋巴結并對其性質(zhì)進行判斷可以指導下一步手術及治療方案[22]。在臨床實踐中，外科醫(yī)師需要借助特別的顯影劑或染料實現(xiàn)前哨淋巴結術中顯像。以往使用的以放射性元素標記的探針雖然可以有效地實現(xiàn)前哨淋巴結顯像[23]，但放射性元素發(fā)出的輻射會對病人及醫(yī)護人員造成傷害，并且不同醫(yī)院對放射性物質(zhì)的使用與管理模式不同，也使其應用受限。亞甲藍等染料雖然價格便宜且不具有放射性[24]，但對前哨淋巴結檢測的敏感性較低，術中也難以協(xié)助外科醫(yī)師定位深部前哨淋巴結[25]。盡管采用NIR-Ⅰ熒光進行前哨淋巴結顯像可以在一定程度上解決以上問題[26-27],但NIR-Ⅰ熒光由于對組織的穿透深度有限，通常需要外科醫(yī)師盡可能清除表面組織才能明確地觀察到前哨淋巴結[28]。

目前，研究人員嘗試利用具有更強穿透能力以及更高SBR的NIR-Ⅱ熒光顯像實現(xiàn)前哨淋巴結定位。Fan等[29]開發(fā)了一種新型有機納米探針(IDSe-IC2F)，并通過該探針進行了NIR-Ⅱ熒光顯像指導下的淋巴結顯像和切除。研究人員將IDSe-IC2F注射到小腸淋巴濾泡中，并在793 nm的激光照射下，根據(jù)組織發(fā)出的NIR-Ⅱ熒光信號實現(xiàn)了淋巴結和淋巴管的準確定位。該方法不僅可以明確前哨淋巴結的位置，還可以判斷淋巴結清除后是否存在殘留。此外，不同研究人員已開發(fā)出多種不同類型的NIR-Ⅱ熒光探針，均可實現(xiàn)對于前哨淋巴結準確且高效的顯像[19,30-32]。

三、血管的顯像

臨床上多使用術前影像學檢查以及術中探查判斷病人手術部位重要血管的位置和走向。但是，在腫瘤的壓迫或粘連導致無法準確判斷血管位置的情況下，醫(yī)源性血管損傷風險會顯著增高。此外，傳統(tǒng)的注射造影劑后在X射線下進行血管顯像的方法仍存在諸多不足：首先，該方法需要在X線照射下完成，會使得病人及醫(yī)護人員長時間在輻射中暴露；其次，成像時間短、造影劑具有人體毒性等因素也導致該方法無法滿足外科手術需求。最新的研究結果顯示，采用近紅外熒光血管顯像技術可以很好地解決以上問題。

Carr等[33]通過向小鼠靜脈注射ICG的方法在動物模型上實現(xiàn)了NIR-Ⅱ熒光血管顯像。該研究發(fā)現(xiàn)，NIR-Ⅱ熒光可以清晰顯示腦血管在皮膚以及顱骨下的位置和走向，并且相較于傳統(tǒng)的NIR-Ⅰ熒光，NIR-Ⅱ熒光可以顯著提高血管顯像的SBR以及分辨率。通過制備新型的NIR-Ⅱ熒光探針，Sun等[34]進一步提升了NIR-Ⅱ熒光下血管顯像效果。而Wan等[35]制備的高亮度NIR-Ⅱ熒光探針甚至可以對直徑5～7 μm的血管實現(xiàn)清晰顯像。

Mi等[36]首次在人體內(nèi)使用NIR-Ⅱ熒光血管顯像技術成功實現(xiàn)了鎖骨下動靜脈的實時顯像，并且在該方法的幫助下完成了復雜縱隔腫瘤的完整切除。研究人員針對一例縱隔腫瘤與鎖骨下動靜脈關系緊密的病人，在術中經(jīng)病人左側橈靜脈內(nèi)注射25 mg(5 mg/ml)ICG，并采用NIR-Ⅱ熒光顯像設備對腫物與鎖骨下動靜脈進行顯像，結果顯示，鎖骨下靜脈和鎖骨下動脈分別在ICG注射后的3秒和17秒后開始清晰顯像。術者在NIR-Ⅱ熒光血管顯像的幫助下清晰地辨別了已經(jīng)偏離了正常解剖位置的鎖骨下動靜脈的走行與邊界，在完整切除腫瘤的同時避免了重要血管的損傷。

雖然使用ICG實現(xiàn)NIR-Ⅱ熒光血管顯像可以達到協(xié)助手術的目的，但ICG經(jīng)靜脈注射后在人體的半衰期仍然較短[37]。Li等[38]開發(fā)了一種新型的NIR-Ⅱ熒光探針(LZ-1105)，其在血液循環(huán)中的半衰期可達3.2小時，從而可以持續(xù)地保持血管的良好顯像。這對于需要長時間保持血管顯像的手術提供了可行的方案。

四、輸尿管及膽管顯像

醫(yī)源性輸尿管損傷是盆腔手術中嚴重的并發(fā)癥，輸尿管損傷后會導致輸尿管瘺或狹窄，嚴重者可造成感染甚至腎功能衰竭[39-40]。特別是當輸尿管緊鄰盆腔腫瘤或病人既往接受過盆腔手術及放射治療后，外科醫(yī)生很難準確識別輸尿管的位置，導致輸尿管損傷的可能性大大增加[41]。Du等[42]設計了一種聚集誘導發(fā)光(aggregation-induced emission,AIE)物質(zhì)，通過向輸尿管內(nèi)注射該熒光物質(zhì)并通過NIR-Ⅱ熒光顯像，可以準確顯示出輸尿管的位置和走向。此外，如果出現(xiàn)輸尿管損傷，該方法還可以準確評估損傷位置，以便及時處理。

與輸尿管顯像類似，在肝膽外科領域，解剖變異或炎癥等因素同樣會導致醫(yī)生很難在術中準確識別膽管的位置[43]。有學者提出術前靜脈注射ICG實現(xiàn)術中NIR-Ⅰ熒光膽管顯像的方法[44-45]，但采用該方法肝臟的熒光背景會嚴重影響膽管的實時顯像[46]。Wu等[47]采用NIR-Ⅱ熒光對膽管進行實時顯像并與NIR-Ⅰ熒光進行對比，結果顯示，NIR-Ⅱ熒光可以顯著降低背景信號并具有更強的組織穿透能力。此外，NIR-Ⅱ熒光可以在小鼠膽管狹窄、穿孔以及橫斷模型中提供更多的組織結構信息，進一步改善了膽管以及病變位置的顯像效果。

五、總結與展望

目前，NIR-Ⅱ熒光顯像技術已經(jīng)開始了從基礎研究到臨床應用的快速轉化。與傳統(tǒng)熒光顯像方法相比，NIR-Ⅱ熒光顯像在不同外科場景中不僅能實現(xiàn)更深的顯像深度，而且可以更好地減少背景干擾，提升顯像效果?？傮w來看，目前已經(jīng)應用到臨床的NIR-Ⅱ熒光染料仍然是傳統(tǒng)的ICG。雖然ICG并不是NIR-Ⅱ熒光顯像的最佳顯影劑，但ICG通過第二發(fā)射峰同樣可以在NIR-Ⅱ熒光顯像中發(fā)揮很好的效果，這也極大地鼓舞了NIR-Ⅱ熒光顯像領域研究人員的信心[10]。迄今為止，已有許多研究團隊成功合成并制備了各類有機或無機NIR-Ⅱ熒光探針，盡管一部分新型NIR-Ⅱ熒光探針已被驗證可以在成功顯影的條件下保證生物安全性，但目前尚無被批準可應用于臨床的新型NIR-Ⅱ熒光探針。相信隨著技術的發(fā)展與人體安全性實驗的不斷嘗試，在不久的將來一定會有新型NIR-Ⅱ熒光探針可以被廣泛應用于臨床。除此之外，NIR-Ⅱ熒光作為既往傳統(tǒng)顯像方法的發(fā)展和延伸，可以將該方法與傳統(tǒng)顯像方法相結合，進一步實現(xiàn)多模態(tài)成像，為外科醫(yī)師提供更加全面且細致的生物學信息，使外科手術獲益?？傊?，NIR-Ⅱ熒光顯像作為一種新型的術中顯像方法已經(jīng)得到了越來越多基礎學科研究人員與外科醫(yī)師的關注與認可，其不斷的探索必將會促進整個外科手術領域的進一步發(fā)展。