周 聃， 王 曙， 周冬仁， 盛鵬程， 胡大雁， 周志金

(1.農業(yè)農村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室/浙江省淡水水產研究所，浙江湖州 313001；2.浙江省湖州市農業(yè)科技發(fā)展中心，浙江湖州 313001)

大口黑鱸()，俗名加州鱸魚，太陽魚科、黑鱸屬，肉質鮮美，肌間刺較少，深受廣大消費者歡迎，具有廣闊的市場前景。2019年，我國大口黑鱸養(yǎng)殖產量已達47.8萬t，比2018年增長了10.6%。目前，大口黑鱸的主要養(yǎng)殖方式為專養(yǎng)和混養(yǎng)結合的傳統(tǒng)池塘化養(yǎng)殖、網箱養(yǎng)殖和池塘內循環(huán)水養(yǎng)殖等模式。IPRA模式(又稱“跑道”養(yǎng)殖)是集成循環(huán)流水養(yǎng)殖、生物凈水、高效集污等技術于一體的新型養(yǎng)殖模式，該模式能夠減少水體污染，改善魚肉肉質，方便生產管理，在江蘇、浙江、上海等地區(qū)被廣泛推廣。隨著IPRA養(yǎng)殖技術的推廣，大口黑鱸已成為我國主要的養(yǎng)殖淡水魚品種，為漁業(yè)提質增效、農業(yè)鄉(xiāng)村振興提供重要支持。

iTRAQ技術是利用同位素標簽標記蛋白基團，結合質譜分析，對不同樣品中的蛋白質含量比較，確定差異蛋白，并分析其蛋白功能。該技術通量高、精度準、重復性好，已廣泛應用于醫(yī)學、食品科學和微生物學等領域。

對大口黑鱸品質研究主要涉及肌肉營養(yǎng)成分、質構等表觀特征研究，對其更進一步的蛋白探索較為罕見。本研究采用iTRAQ技術對IPRA養(yǎng)殖和傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖模式下的大口黑鱸進行定量蛋白質組學研究，分析2種養(yǎng)殖模式下魚肉蛋白質組表達水平差異，并對其差異蛋白質生物信息學進行分析，獲得IPRA養(yǎng)殖與傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖模式下大口黑鱸蛋白質組表達水平的差異，從而為分析不同養(yǎng)殖模式下鱸魚魚肉品質和代謝差異靶標提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

同齡段IPRA養(yǎng)殖和傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖大口黑鱸(450～500 g/尾)，購于湖州南潯某養(yǎng)殖場，同一飼料，養(yǎng)殖時間為2019年3—10月。每組取3尾魚，0.5 h內運回實驗室，采用自來水清洗，取其背部魚肉，液氮速凍，-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

8-plex iTRAQ試劑盒，購自美國AB Sciex公司；PMSF，購自上海生工生物工程股份有限公司；丙酮，購自美國J.T.Baker公司；胎牛血清標準品BSA、TCEP、MMTS、三乙基碳酸氫銨緩沖液、氨水，購自美國Sigma公司；胰酶，購自美國Promega公司；乙腈、甲酸，購自美國Thermo公司。

1.2 儀器與設備

真空干燥儀冷凍離心機(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司)；超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；低溫離心機(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司)；恒溫箱(上海一恒科學儀器有限公司)；液相色譜LC-20AD(日本Shimadzu公司)；液相色譜Dionex Ultimate 3 000 RSLCnano、質譜儀Q Exactive(美國Thermo Scientific公司)。

1.3 試驗與方法

1.3.1 蛋白質提取 稱取約2 g魚肉樣品置于預冷研缽內，充分研磨至粉末狀態(tài)，加入1 mL裂解液L3 SDS(使用前加1×PMSF)，超聲(功率500 W，間隔1.5 s，時間1 s，超聲5 min)，離心20 min(4 ℃，12 000 r/min)，收集上清液分裝，每管250 μL，加入1 mL丙酮，-20 ℃過夜。離心20 min(4 ℃，12 000 r/min)，棄上清，干燥。采用Bradford法，對蛋白質進行定量。

1.3.2 蛋白FASP酶解及iTRAQ試劑標記 取200 μg蛋白溶液，加入蛋白質量比1/50的胰蛋白酶，37 ℃過夜；次日加入質量比1/100胰蛋白酶，37 ℃ 反應4 h，離心20 min(4 ℃，12 000 r/min)。加入50 μL 0.5 mol/L TEAB，離心20 min(4 ℃，12 000 r/min)，獲得酶解液，利用iTRAQ試劑盒進行標記，具體見表1(傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖標記為CT，IPRA養(yǎng)殖標記為PD)，下同。

表1 樣本及標記物對照

1.3.3 液相分離及質譜鑒定 采用流動相A(HO，pH值=10)和流動相B(80% ACN，pH值=10)以0.2 mL/min流速進行梯度洗脫；洗脫條件為：0～5 min，5%B；5～10 min，5%～10%B；10～60 min，10%～40%B；60～65 min，40%～95%B；65～75 min，保持95%B；75～85 min，95%～5%B。在 214 nm 吸光度下監(jiān)測洗脫過程，根據峰型和時間收取20個組分，每個組分取3 μg進行二維液相色譜分離。流動相分別為A(0.1%甲酸)，B(0.1%甲酸，80%ACN)，洗脫條件為：0～5 min，5%B；5～8 min，5%～10%B；8～40 min，10%～30%B；40～45 min，30%～35%B；45～50 min，35%～90%B；50～55 min，保持90%B；55～56 min，90%～5%B；56～65 min，保持5%B。每個組分分析時間為 65 min，流速為300 nL/min。

分離后的肽段進入質譜儀檢測，一級質譜參數：分辨率為70 000，最大離子強度為3e6，最大注入時間為100 ms，掃描范圍為350～1 800；二級質譜參數：分辨率為17 500，最大離子強度為5e4，最大注入時間為120 ms，母離子選擇20個TopN，碰撞能量NCE為30。

1.3.4 蛋白鑒定和生物信息學分析 在Uniprot 數據庫中，對肽段的質譜信息進行檢索。將113、114、115混合作為池塘養(yǎng)殖組(CT)；116、118、119混合作為IPRA養(yǎng)殖組(PD)。將蛋白比率≥20或≤0.05除去。對其進行檢驗，<0.05，平均比率≥1.5或≤0.667為上調或下調差異蛋白，并進行GO、KEGG代謝通路和STRING網絡通路分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白質鑒定

在大口黑鱸魚肉中共鑒定出置信度在95%以上的蛋白質1 484個。2種養(yǎng)殖模式下大口黑鱸檢測出差異蛋白152個，其中，上調蛋白98個，下調蛋白54個。蛋白表達豐度分布見圖1。

2.2 GO功能分析

由圖2可知，對152個差異蛋白進行GO 注釋，其中，主要參與的分子功能有6個，包括：結合(85個)、催化活性(64個)、結構分子活性(14個)、轉運活性(8個)、分子功能調節(jié)劑(8個)、分子載體活性(3個)；細胞位置2個，包括細胞解剖實體(84個)、蛋白質復合體(37個)；生物過程14個，其中蛋白數量較高的主要是細胞過程(58個)、代謝過程(49個)、細胞定位(14個)、生物調節(jié)(10個)。

2.3 差異蛋白通路分析

KEGG代謝通路分析結果見表2。由表2可知，差異蛋白一共參與142個信號轉導通路。其中，主要的代謝通路包括次生代謝產物的生物合成(26個)、肌動蛋白細胞骨架調節(jié)(16個)、碳代謝(16個)、蛋白質消化吸收(13個)、氨基酸的生物合成(12個)、糖酵解(11個)、氧化磷酸化(6個)、檸檬酸循環(huán)(6個)、嘌呤代謝(5個)、鈣信號通路(5個)。

表2 兩種養(yǎng)殖模式下大口黑鱸差異蛋白途徑富集分析

2.4 目標差異蛋白確定

根據上述差異蛋白分析情況及相關文獻資料，由表3可知，篩選得魚肉品質密切相關的28個目標差異蛋白，主要分成6類，分別為肌動蛋白細胞骨架調節(jié)8個(上調5個，下調3個)、糖酵解8個(均上調)、檸檬酸循環(huán)5個(均上調)、氧化磷酸化3個(均上調)、鈣信號通路3個(上調2個，下調1個)和熱休克1個(上調)。

表3 兩種養(yǎng)殖模式下大口黑鱸目標差異蛋白

2.5 目標差異蛋白STRING網絡通路分析

STRING網絡數據庫信息全面、操作簡便，廣泛運用于蛋白質網絡結構分析。由圖3可知，在28個目標蛋白質中，有24個蛋白存在相互作用，共162個相互關系，形成了一個多中心互作網絡。各蛋白間通過多條通路進行調節(jié)，中心蛋白除與周邊蛋白間存在相互關系外，與其他中心蛋白間也存在著相互關系。

3 討論與結論

魚肉是優(yōu)質蛋白質來源，營養(yǎng)價值豐富。蛋白質在生命活動中起著重要作用，其結構和含量變化影響各類生理生化反應，如細胞凋亡、糖酵解反應、信號轉導等，從而對魚肉品質產生相應的影響。因此，通過研究不同養(yǎng)殖模式下大口黑鱸魚肉蛋白質差異對提高魚肉品質及調控具有深遠意義。

結果顯示，IPRA養(yǎng)殖的大口黑鱸與傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖的大口黑鱸相比，共有差異蛋白152個，其中，上調98個，下調54個；根據條件，篩選得魚肉品質密切相關的目標差異蛋白28個，主要分為6類，分別為肌動蛋白細胞骨架調節(jié)、糖酵解、檸檬酸循環(huán)、氧化磷酸化、鈣信號通路和熱休克蛋白。其中，與肌動蛋白細胞骨架調節(jié)有關的目標差異蛋白共有8個，分別為6個肌球蛋白重鏈(MHC)、1個根蛋白(Radixin)和1個肌球蛋白輕鏈-2(MYL2)；與糖酵解有關的目標差異蛋白有8個，分別為葡萄糖-6-磷酸異構酶、ATP依賴性6-磷酸果糖激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(2個)、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、2-磷酸--甘油酸氫裂解酶和-乳酸脫氫酶；與檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))有關的目標差異蛋白有5個，分別為丙酮酸脫氫酶復合物乙酰基轉移酶組分、蘋果酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶和烏頭酸水合酶(2個)；與氧化磷酸化的目標差異蛋白有3個，均與細胞色素c氧化酶有關；與鈣信號通路有關的目標差異蛋白有3個，分別為鈣調素結合蛋白、肌鈣蛋白C(TnC)和鈣轉運ATP酶蛋白；與熱休克(HSP)有關的目標差異蛋白有1個，為HSP60。

魚肉肌纖維分慢收縮型、快收縮型和中間型3類。慢收縮型纖維屬有氧代謝型肌纖維，含有豐富的線粒體、細胞色素和肌球蛋白、顯紅色，主要與慢速游泳有關?？焓湛s型纖維屬酵解代謝型肌纖維，細胞色素或肌球蛋白含量較少、顯白色，主要與快速突然游泳有關。中間型纖維位于兩者之間，呈粉紅色，屬于過渡類型。

MHC是指沿著肌肉纖維排列的細絲，通過收縮、保持和控制釋放控制肌肉運動，是負責運動的主要蛋白。2種養(yǎng)殖模式下MHC差異均為快收縮型纖維差異，這主要與流水運動下糖酵解代謝差異有關。由于處于流水運動下，細胞形態(tài)變化復雜，快收縮性MHC蛋白發(fā)生復雜變化(3個上調，3個下調)。根蛋白能夠連接肌動蛋白，影響細胞生長、遷移、分裂及信號轉導等功能。MYL2為調節(jié)性輕鏈，能夠影響肌球蛋白重鏈上ATP 酶的活性，使肌纖維的類型出現轉變，影響肌肉生長。IPRA養(yǎng)殖與傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖相比，其魚肉根蛋白和MYL2表達均明顯上調，這可能導致IPRA養(yǎng)殖的魚體肌肉在肌纖維排布上更加致密，纖維直徑更加粗壯，從而使肉質品質高于池塘養(yǎng)殖的魚體。

IPRA養(yǎng)殖與傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖相比，魚肉中與糖酵解有關的8個差異蛋白表達均明顯上調，表明其具有更強的糖酵解能力。在牛、羊肉中有研究表明，糖酵解能力與其肉質品質呈反比。哺乳動物肌肉纖維數在幼期就已固定，然而魚類生長過程中持續(xù)有快速收縮型纖維補充。此外，Sun等還研究發(fā)現，葡萄糖-6-磷酸異構酶具有通過抑制絲氨酸蛋白酶(MBSP)活性來防止肌原纖維分解的功能。IPRA養(yǎng)殖的大口黑鱸具有較強的糖酵解能力，這可能與其長期處于流水運動狀態(tài)有關。在檸檬酸循環(huán)中，糖類、脂肪、蛋白質會分解產生能量貯存在ATP中，從而供給生物體。檸檬酸循環(huán)過程中發(fā)生的反應會影響肉質的嫩度及脂肪含量。IPRA養(yǎng)殖的大口黑鱸與傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖相比，與檸檬酸循環(huán)有關的5個差異蛋白表達均明顯上調，表明其具有更強的檸檬酸循環(huán)能力，同樣可能與其長期處于流水運動狀態(tài)有關。

細胞色素c氧化酶是終端氧化酶，多存在于線粒體中，含有血紅素，影響肌肉顏色。IPRA養(yǎng)殖的大口黑鱸與傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖相比，與氧化磷酸化有關的3個細胞色素C氧化酶差異蛋白表達均明顯上調，這可能是由于長期處于流水運動，需要更高的代謝，從而使肌纖維中的與色澤有關的肌纖維發(fā)生改變。

鈣調素結合蛋白是通過抑制肌漿中Ca釋放來介導Ca信號傳遞，從而調節(jié)細胞生理功能。TnC是與鈣結合的靶分子，能夠調控骨骼肌收縮。TnC通過與Ca結合，產生應激反應，促進蛋白合成和肌肉增長。鈣轉運ATP酶是影響鈣離子轉運的重要蛋白，其活性越高，越容易釋放Ca。Ca的釋放會使肌肉不可逆收縮，導致肉的含水性和嫩度下降。在3個目標差異鈣信號通路調節(jié)蛋白中，IPRA養(yǎng)殖的大口黑鱸與傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖相比，鈣調素結合蛋白和TnC表達均上調，而鈣轉運ATP酶表達下調，表明IPRA養(yǎng)殖的大口黑鱸魚肉Ca結合能力較強，釋放較少。

HSP蛋白是機體在應激條件下迅速合成的一類蛋白，其保守性和應激性較高，可作為分子伴侶與不同的多肽鏈非特異性結合，催化介導蛋白質特定構象的形成。HSP60是分子量約為60 ku的一個HSP蛋白，能夠促進脂肪分解，與肉的嫩度密切關聯(lián)。IPRA養(yǎng)殖的大口黑鱸與傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖相比，其HSP60表達明顯上調，反映了IPRA養(yǎng)殖的鱸魚其耐熱應激性要好于傳統(tǒng)池塘養(yǎng)殖。

綜上所述，與傳統(tǒng)池塘相比，IPRA養(yǎng)殖的大口黑鱸肌肉中糖酵解、TCA循環(huán)、氧化磷酸化、鈣離子結合以及抗應激能力均顯著加強，表明IPRA養(yǎng)殖通過加強一定的運動，提高了魚體代謝，從而改善了魚肉營養(yǎng)和品質。