宋利明，周 旺，王 迪，Ebango Ngando Narcisse

（1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)國(guó)家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海 201306）

沙丁魚（Sardina pilchardus）隸屬于硬骨魚綱（Osteichthyes），鯡科（Clupeidae），沙丁魚屬，是近海暖水性洄游魚類。沙丁魚資源在西非漁業(yè)中占有重要地位，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。毛里塔尼亞海域位于幾內(nèi)亞暖流和加納利寒流交匯區(qū)，存在較強(qiáng)的涌升流，初級(jí)生產(chǎn)力較高，是西北非海域的重要漁場(chǎng)之一［1－3］。耳石是魚類內(nèi)耳膜迷路內(nèi)的一種碳酸鈣晶體，魚類棲息環(huán)境化學(xué)信息猶如生活史的指紋保存在耳石日輪中［4］。魚類耳石微化學(xué)分析已成為研究魚類生活史的重要方法之一［5］，在魚類種群識(shí)別［6］、產(chǎn)卵場(chǎng)比較［7］、洄游生活史研究［8］等方面發(fā)揮了很好的作用。耳石日輪技術(shù)應(yīng)用于早期生活史特點(diǎn)、產(chǎn)卵期或產(chǎn)卵場(chǎng)位置推算等研究［9－10］。耳石微化學(xué)分析方法主要有鍶（Sr）、鋇（Ba）與鈣（Ca）元素含量比值分析［11］、多元素分析［12］、穩(wěn)定同位素分析［13］等。魚類耳石Sr∶Ca、Ba∶Ca與棲息環(huán)境鹽度［14］和溫度［15］相關(guān)，作為研究其棲息環(huán)境的指紋元素得到普遍認(rèn)同［16－18］。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于毛里塔尼亞海域沙丁魚耳石研究大多基于耳石形態(tài)和耳石年齡測(cè)定［19－20］，對(duì)毛里塔尼亞海域沙丁魚耳石微化學(xué)研究主要用于種群識(shí)別［21］。對(duì)毛里塔尼亞海域沙丁魚耳石微量元素的特征進(jìn)行研究，可進(jìn)一步了解沙丁魚的棲息環(huán)境，以利于開發(fā)、養(yǎng)護(hù)和管理沙丁魚等小型中上層漁業(yè)資源。本研究采用激光剝蝕電感等離子質(zhì)譜儀法（laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry，LA-ICP-MS）對(duì)毛里塔尼亞海域沙丁魚耳石元素含量進(jìn)行測(cè)定，分析其耳石不同年齡測(cè)定處（核心區(qū)、1齡區(qū)、2齡區(qū)與邊緣區(qū)）主要元素［鈉（Na）、Sr、Ba、鐵（Fe）、鎂（Mg）］含量與Ca含量比值的差異性，研究毛里塔尼亞海域沙丁魚不同年齡棲息環(huán)境的變化情況，以期為今后研究毛里塔尼亞海域沙丁魚洄游生活史及沙丁魚資源的可持續(xù)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

2018年10月至12月在毛里塔尼亞20°10′N～21°10′N、17°10′W～17°40′W海域（圖1），通過宏東國(guó)際（毛里塔尼亞）漁業(yè)發(fā)展有限公司的燈光圍網(wǎng)船“福遠(yuǎn)漁097”，采集沙丁魚樣本219尾，叉 長(zhǎng)（15.24±6.76）cm，體 質(zhì) 量（103.51±23.48）g。沙丁魚樣本的性別鑒定和耳石采集在毛里塔尼亞宏東國(guó)際漁業(yè)發(fā)展有限公司的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，采集沙丁魚的矢耳石樣本，編號(hào)并記錄性別，置于盛有95%酒精溶液的1.5 mL離心管中保存［22］。

圖1 沙丁魚采樣站點(diǎn)Fig.1 Sampling sites of sardine

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耳石預(yù)處理

耳石樣本的預(yù)處理參考韓振華［23］的方法，主要包括包埋、切割、研磨、拋光及讀取年齡等步驟。首先使用固化劑與冷埋樹脂1∶1混合液體包埋耳石樣品，待其硬化后進(jìn)行切割。然后分別使用600目、1 200目、2 500目、4 000目防水耐磨砂紙，沿耳石縱切面研磨至耳石核心。耳石兩面研磨至核心后，用0.3μm氧化鋁絨布對(duì)耳石切片進(jìn)行拋光。最后挑選日輪清晰、雜質(zhì)較少的沙丁魚耳石樣品置于體式顯微鏡下讀取日輪，邊緣不清晰的耳石日輪依據(jù)鄰近輪紋寬度計(jì)算，通過耳石日輪劃分沙丁魚年齡。耳石日輪由3人分別讀取，日輪數(shù)與均值差值均小于5%的則視為正確日輪［24］。制備完善的耳石樣本置于魚鱗袋保存，以備測(cè)定耳石元素。

1.2.2 耳石微化學(xué)測(cè)定

利用沙丁魚的生長(zhǎng)方程［25］，根據(jù)體長(zhǎng)逆算其年齡，然后乘以365 d，得到沙丁魚的理論日齡，并根據(jù)沙丁魚的捕撈日期和產(chǎn)卵期推算其生長(zhǎng)期，用于與耳石日輪紋數(shù)比對(duì)分析。本實(shí)驗(yàn)共選取58枚（其中雄性25枚，雌性33枚）完整、日輪數(shù)較多的沙丁魚耳石樣品，耳石日輪范圍為344～789輪，1齡以下、1～2齡和2齡以上的分別為2尾、40尾和16尾，以1～2齡為主。在武漢上譜分析科技有限責(zé)任公司，采用安捷倫電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（LA-ICP-MS，Agilent 7900）和193 nm準(zhǔn)分子激光剝蝕系統(tǒng)（GeoLas HD）分析耳石微量元素。耳石核心區(qū)到邊緣區(qū)元素含量按年齡序列完整記錄著魚類出生至被捕獲時(shí)的棲息環(huán)境變化［26］，因此本實(shí)驗(yàn)根據(jù)沙丁魚耳石日輪劃分，分別在核心處、0齡與1齡交匯處、1齡與2齡交匯處及邊緣處各取一個(gè)測(cè)定點(diǎn)（圖2）進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定耳石元素前使用電阻率大于18Ω的去離子水清洗耳石切片5 min，利用LA-ICP-MS測(cè)定耳石各測(cè)定點(diǎn)處的元素成分及含量［27］，激光剝蝕點(diǎn)直徑44μm。每個(gè)測(cè)定點(diǎn)數(shù)據(jù)分析包括約25 s的空白信號(hào)和50 s的分析信號(hào)，激光剝蝕過程采用氦氣（0.7 L·min－1）作為載氣，氬氣作為補(bǔ)償氣（0.8 L·min－1）用于調(diào)節(jié)靈敏 度［28］。使 用NIST610、BCR、BIR、BHVO、MACS-3、ZS參考標(biāo)準(zhǔn)作為校正的標(biāo)準(zhǔn)，每進(jìn)行3～5個(gè)樣品打點(diǎn)之后重新校正儀器參數(shù)［29］。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

使用ICP-MSDatacal 10.8軟件，計(jì)算耳石樣本中各測(cè)定點(diǎn)處元素成分及含量（mg·kg－1）。為了減小不同樣本個(gè)體大小產(chǎn)生的誤差，耳石微化學(xué)分析采用元素含量與耳石中Ca元素含量的比值進(jìn)行分析［30］。本研究使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，首先檢驗(yàn)耳石各元素值的組內(nèi)正態(tài)分布性（Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)）和組間方差齊次性（Levene檢驗(yàn)）［11］，考慮到所有測(cè)定元素比值的多元效應(yīng)，利用Wilcoxon統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)比較不同性別沙丁魚各測(cè)定點(diǎn)主要元素含量與Ca含量比值差異，探討沙丁魚不同性別間耳石元素含量的差異；并比較耳石各測(cè)定點(diǎn)主要元素含量與Ca含量比值的差異，探討毛里塔尼亞海域沙丁魚不同年齡棲息環(huán)境的變化。如若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布，可直接對(duì)其用多元方差分析，由于多元方差分析對(duì)偏離正態(tài)分布有一定的抗性，尤其是在各組樣本量相等或近似相等的情況下，而且非正態(tài)分布實(shí)質(zhì)上并不影響犯統(tǒng)計(jì)學(xué)假設(shè)檢驗(yàn)中“棄真”錯(cuò)誤的概率，因此可以直接進(jìn)行檢驗(yàn)，但結(jié)果中需比較對(duì)正態(tài)分布的偏離。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙丁魚耳石元素組成

本研究在沙丁魚耳石中共檢測(cè)出44種元素，其中Ca含量最高，為（3.13～3.98）×105mg·kg－1，平均為（3.89±0.19）×105mg·kg－1。沙丁魚耳石9種主要元素含量高低依次為Ca、Na、Sr、Fe、Mg、Ba、鋰（Li）、錳（Mn）、銅（Cu）（表1）。

表1 沙丁魚耳石主要元素組成及含量Tab.1 Dominant trace element composition and content of sardine otolith

2.2 雌雄沙丁魚耳石各測(cè)定點(diǎn)主要元素與Ca含量比值

計(jì)算25尾雄性及33尾雌性沙丁魚耳石各測(cè)定點(diǎn)主要元素含量與Ca含量的比值（表2、表3），并使用符號(hào)秩（Wilcoxon）檢驗(yàn)比較不同性別的差異。結(jié)果表明，毛里塔尼亞海域雌雄沙丁魚各測(cè)定點(diǎn)Na、Sr、Fe、Mg、Ba含量與Ca含量比值均無顯著性差異（P＞0.05），因此認(rèn)為不同性別的沙丁魚耳石可綜合在一起分析。

表2 雄性沙丁魚耳石各測(cè)定點(diǎn)主要元素含量與Ca含量的比值Tab.2 Ratio of dominant trace element content to Ca content in each region of male sardine otolith

表3 雌性沙丁魚耳石各測(cè)定點(diǎn)主要元素含量與Ca含量的比值Tab.3 Ratio of dominant trace element content to Ca content in each region of female sardine otolith

2.3 沙丁魚耳石各測(cè)定點(diǎn)主要元素與Ca含量比值

本研究采用Wilcoxon檢驗(yàn)對(duì)58枚沙丁魚耳石不同測(cè)定點(diǎn)處主要元素（Na、Sr、Fe、Mg、Ba）與Ca含量比值進(jìn)行分析（圖3），檢驗(yàn)結(jié)果見表4。結(jié)果表明，毛里塔尼亞海域沙丁魚耳石核心區(qū)與1齡區(qū)的Na、Sr、Fe、Mg、Ba含量與Ca含量的比值均無顯著性差異（P＞0.05）；1齡區(qū)與2齡區(qū)、2齡區(qū)與邊緣區(qū)除Fe與Ca元素含量比值無顯著性差異（P＞0.05），其他元素與Ca元素含量比值存在顯著性差異（P＜0.05）。

圖3 沙丁魚耳石各測(cè)定點(diǎn)Na、Sr（a）、Fe、Mg（b）、Ba（c）含量與Ca含量的比值Fig.3 Na∶Ca，Sr∶Ca（a），F(xiàn)e∶Ca，Mg∶Ca（b），and Ba∶Ca（c）in each region of Sardine otolith

表4 各測(cè)定點(diǎn)主要元素含量與Ca含量比值之間的Wilcoxon檢驗(yàn)結(jié)果（P值）Tab.4 Result of Wilcoxon test among dominant trace element content to Ca content at each measurement point（P value）

3 討論

本研究結(jié)果表明，毛里塔尼亞海域沙丁魚含有44種元素，9種主要元素根據(jù)含量高低依次為Ca、Na、Sr、Fe、Mg、Ba、Li、Mn、Cu。迄今為止，魚類耳石中已檢測(cè)出的元素約50多種［30－31］。HAMPTON等［32］對(duì)南非沿岸沙丁魚幼魚耳石元素的時(shí)空變化進(jìn)行研究，測(cè)得20種元素，主要元素為Ca、Sr、Mg、B、Li、Ba等。CASTRO［33］對(duì)大西洋沿岸沙丁魚耳石元素進(jìn)行了分析，認(rèn)為沙丁魚耳石元素組成與其他海洋魚類相似，主要為Ca、Na、Sr、Mg、Li、Ba、Mn。本研究與這些研究結(jié)果得到的結(jié)果基本一致。

有研究認(rèn)為，魚類耳石元素的沉積受到棲息環(huán)境的影響，也與性別和生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)［5］。但本研究表明，毛里塔尼亞不同性別的沙丁魚各年齡階段耳石主要元素（Na、Sr、Fe、Mg、Ba）含量與Ca元素含量比值均無顯著性差異（P＞0.05），毛里塔尼亞海域不同性別的沙丁魚生活環(huán)境相近，具有相同的洄游路線，在對(duì)其洄游生活史研究時(shí)不需要分性別來研究。

本研究中，通過對(duì)毛里塔尼亞沙丁魚耳石不同年齡測(cè)定點(diǎn)Sr∶Ca、Ba∶Ca、Na∶Ca、Mg∶Ca差異性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沙丁魚耳石核心處和1齡打點(diǎn)處Sr∶Ca、Ba∶Ca、Na∶Ca、Mg∶Ca無顯著性差異（P＞0.05），1齡打點(diǎn)處與2齡打點(diǎn)處Sr∶Ca、Ba∶Ca、Na∶Ca、Mg∶Ca存在顯著性差異（P＜0.05），2齡打點(diǎn)處與邊緣處Sr：Ca、Ba：Ca、Na：Ca、Mg：Ca存在顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)果表明，毛里塔尼亞海域沙丁魚0齡至1齡棲息環(huán)境無顯著變化，1齡至2齡棲息環(huán)境發(fā)生變化，2齡至被捕獲時(shí)棲息環(huán)境也發(fā)生變化。毛里塔尼亞海域沙丁魚的洄游模式與其附近的上升流系統(tǒng)和塞內(nèi)加爾-毛里塔尼亞熱鋒的季節(jié)性變化有關(guān)［34］。毛里塔尼亞海域的沙丁魚全年產(chǎn)卵，主要的產(chǎn)卵期為10月至12月和翌年的4月至5月，在北部沿岸產(chǎn)卵［35］，沙丁魚幼魚停留在布朗角外海的淺灘上［34］。4月至5月，由于水溫的升高，沙丁魚魚群隨塞內(nèi)加爾-毛里塔尼亞熱鋒向北部的西屬撒哈拉沿岸海域洄游［36］。到11月份，隨著水溫的下降，毛里塔尼亞海域以北的沙丁魚魚群向南洄游［33］。本研究結(jié)果與這些研究結(jié)果基本一致。0齡至1齡的沙丁魚可能停留在布朗角外海的淺灘上未發(fā)生洄游，1齡至2齡、2齡至捕獲時(shí)的沙丁魚有季節(jié)性洄游運(yùn)動(dòng)，在夏秋季節(jié)向北部的西屬撒哈拉沿岸海域洄游，冬春季節(jié)向南洄游。這樣就導(dǎo)致了0齡至1齡的沙丁魚棲息環(huán)境無顯著變化，1齡至2齡的沙丁魚棲息環(huán)境發(fā)生變化、2齡至被捕獲時(shí)棲息環(huán)境也發(fā)生了變化。

海洋魚類耳石中元素Sr、Ba含量與魚類棲息環(huán)境相關(guān)。魚類耳石Sr∶Ca、Ba∶Ca作為研究其生活史的環(huán)境指紋元素得到普遍認(rèn)同，早期的研究如ELSDON等［37］發(fā)現(xiàn)，海洋洄游性魚類耳石中Sr、Ba與其生活環(huán)境中的元素濃度非常接近，并假定元素按照環(huán)境水體中相應(yīng)的含量比例被吸收進(jìn)入耳石，但據(jù)目前研究結(jié)果顯示，元素在耳石中的沉積機(jī)制并非完全如此。WALTHER和THRROLD［38］認(rèn)為，海洋魚類耳石中的元素Sr、Ba主要來源于棲息環(huán)境的海水，貢獻(xiàn)率分別為83%和98%。

本研究認(rèn)為，Na∶Ca、Mg∶Ca也可用于研究沙丁魚不同年齡棲息環(huán)境的變化，F(xiàn)e∶Ca不適用于研究毛里塔尼亞海域沙丁魚棲息環(huán)境的變化。原因?yàn)椋?）除了Sr、Ba元素，也可以使用其他元素分析探討海洋魚類生活史［39－40］，尉曉英和朱國(guó)平［31］認(rèn)為，Sr、Ba、Li、Mg、Mn、Cu、Zn較適用于海洋洄游魚類生活史反演；2）魚類耳石中Na含量與海水溫度有關(guān)［41］，Mg含量與海水溫度和鹽度有關(guān)［37，42］；3）非洲西北部的大西洋海域海水中的元素組成還受到來自撒哈拉沙漠礦塵的影響［43－44］，毛里塔尼亞鐵礦資源豐富［45－46］，這可能導(dǎo)致該海域中Fe的含量分布比較均勻，沙丁魚耳石生長(zhǎng)過程中Fe的含量變化不大。

棲息環(huán)境水域元素被魚類攝入并轉(zhuǎn)化沉積于耳石是一個(gè)復(fù)雜的過程［47－48］，今后可以結(jié)合棲息環(huán)境水體中元素的組成，分析沙丁魚耳石各指紋元素吸收和沉積與棲息環(huán)境水體中各元素間的關(guān)系，進(jìn)一步探討沙丁魚具體的洄游路線。另外，在今后的研究中，建議在耳石上對(duì)每個(gè)年齡輪紋選擇3個(gè)以上的測(cè)定點(diǎn)測(cè)定元素含量，并增加樣本數(shù)量，以提高研究的精度。

致謝：本研究得到了毛里塔尼亞政府的許可，并得到宏東國(guó)際（毛里塔尼亞）漁業(yè)發(fā)展有限公司蘭平勇、林蘭英、曾志堅(jiān)、趙松輝、朱國(guó)平先生和“福遠(yuǎn)漁097”號(hào)船長(zhǎng)及全體船員等大力支持，謹(jǐn)致謝意。