李傳步，王 元，趙 姝，范培莉，凌 海，李新蒼，周俊芳，房文紅

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，國(guó)家水生動(dòng)物病原庫，上海 201306）

隨著集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖日益發(fā)展，水產(chǎn)病害愈加嚴(yán)重，抗菌藥物被廣泛用于疾病的預(yù)防和治療，施用的抗菌藥物大部分隨著水生動(dòng)物的代謝而進(jìn)入到養(yǎng)殖水體中［1］。水體中的抗菌藥不僅能通過食物鏈進(jìn)入人體而危害人類健康，還能誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生耐藥基因，并通過水流動(dòng)介質(zhì)而傳播擴(kuò)散［2］。恩諾沙星是獸醫(yī)專用抗菌藥，其通過阻斷微生物DNA促旋酶和異構(gòu)酶Ⅳ抑制細(xì)菌增殖而產(chǎn)生殺菌效果，具有廣譜抗菌作用，在水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治上有明顯效果，因此在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用［3］。而該類化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難溶于水，并能在水體中持久存在［4］。

2019年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部等十部委發(fā)布《關(guān)于加快推進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展的若干意見》，提出要加強(qiáng)水產(chǎn)養(yǎng)殖獸藥等投入品的合理使用，提倡水產(chǎn)生態(tài)養(yǎng)殖，鼓勵(lì)利用水生植物對(duì)成片養(yǎng)殖池塘和工廠化養(yǎng)殖尾水進(jìn)行處理，合理利用水資源。目前，關(guān)于水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水排放標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)水體的pH、總氮、總磷、COD等營(yíng)養(yǎng)鹽指標(biāo)有所規(guī)定，尚未對(duì)水體中抗菌藥殘留污染進(jìn)行要求和規(guī)定。

水生植物在處理水體富營(yíng)養(yǎng)化和重金屬污染中已取得很大的進(jìn)展［5］。目前，越來越多的學(xué)者關(guān)注水生植物處理水環(huán)境中的抗菌藥污染研究。CARVALHO等［6］在實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，蘆葦（Phragmites australis）可以去除水中的恩諾沙星和四環(huán)素；國(guó)內(nèi)也有研究報(bào)道沉水植物大薸（Pistia stratiotes）和鳳眼蓮（Eichhornia crassipes）在水培條件下可以去除水中4種抗菌藥（鹽酸金霉素、氨芐青霉素、鹽酸土霉素和鹽酸四環(huán)素）［7］。除了實(shí)驗(yàn)室研究外，也有學(xué)者利用水生植物構(gòu)建人工濕地系統(tǒng)并成功去除了水體中的抗菌藥［8－10］。但是，目前相關(guān)研究大多都集中于水生植物對(duì)抗菌藥的去除效率和性能上，很少有關(guān)于其蓄積、代謝和消除能力的研究。

根據(jù)中國(guó)濕地分類國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，河蟹養(yǎng)殖池塘為一種人工濕地［11］，但關(guān)于河蟹池塘沉水植物對(duì)抗菌 藥 去 除 的 研 究 甚 少，僅ZHANG等［12］、GOMES等［13］和 朱 利 明［14］分 別 研 究 了 苦 草（Vallisneria natans）、伊樂藻（Elodea nuttallii）對(duì)恩諾沙星和苦草對(duì)磺胺的吸收能力，以及苦草對(duì)水體中磺胺的去除規(guī)律。因此本研究以河蟹養(yǎng)殖中典型沉水植物苦草、伊樂藻和輪葉黑藻（Hydrilla verticillata）為研究對(duì)象，以QuEchERS法（一種簡(jiǎn)單、快速、安全的樣品凈化方式）為基礎(chǔ)，建立了沉水植物中喹諾酮類抗菌藥的HPLC檢測(cè)方法，通過模擬生態(tài)實(shí)驗(yàn)比較了幾種沉水植物對(duì)恩諾沙星的蓄積、代謝和消除能力，旨在評(píng)估沉水植物在養(yǎng)殖尾水處理中的修復(fù)作用，同時(shí)也為水產(chǎn)生態(tài)養(yǎng)殖提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀（e2695，美國(guó)Waters），熒光檢測(cè)器（2475，美國(guó)Waters）高速冷凍離心機(jī)（CF16RN，日本HITACHI），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A，中國(guó)重葉），組織勻漿機(jī)（T10，德國(guó)IKA），多管渦旋混合儀（EFAA-HM-01，中國(guó)ANPEL），超聲波清洗機(jī)（SB-5200D，中國(guó)SCIENTZ），超純水儀（Milli-Q IQ 7000，法國(guó)默克）。

1.2 試劑

恩諾沙星（enrofloxacin，ENR）和環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）標(biāo) 準(zhǔn) 品 為 德 國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司產(chǎn)品；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）、石墨化炭黑（GCB）、氨基、十八烷基鍵合相硅膠（C18），以及色譜純乙腈和甲酸均為CNW產(chǎn)品；乙酸、磷酸、氯化鈉、磷酸二氫鉀和尿素均為化學(xué)純?cè)噭嚕?。ENR和CIP事先配制成濃度為100 mg·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)母液，置于棕色瓶中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

提取液A：乙腈；提取液B：0.1%甲酸酸化乙腈；提取液C：1%甲酸酸化乙腈；提取液D：1%乙酸酸化乙腈；提取液E：4%乙酸酸化乙腈，后4者均為體積比（V/V）。

1.3 實(shí)驗(yàn)用沉水植物

苦草、伊樂藻和輪葉黑藻采自上海市崇明區(qū)惠康水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社，該合作社無恩諾沙星和環(huán)丙沙星使用記錄。

1.4 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18（150×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈：0.01 mol·L－1四丁基溴化銨溶液（磷酸調(diào)pH至2.80）＝10∶90（V/V），使用前進(jìn)行抽濾、脫氣；柱溫28℃；流速1.0 mL·min－1；進(jìn)樣量10μL；熒光檢測(cè)波長(zhǎng)，激發(fā)光波長(zhǎng)（Ex）＝280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)（Em）＝450 nm。

1.5 前處理方法的建立

稱取2.00 g待測(cè)沉水植物（苦草）樣品，加入10.00 mL提取液，組織勻漿機(jī)粉碎5min，振蕩提取15 min，加入1.00 g氯化鈉，振蕩均勻，10 000 r·min－1離心2 min；收集上清液至離心管中，加入50 mg PSA和5 mg GCB，渦旋振蕩1 min，10 000 r·min－1離心2 min；取5.00 mL上清液至雞心瓶中，于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，加入1.00 mL流動(dòng)相，渦旋溶解，過0.22μm濾膜上機(jī)分析。

1.6 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)

采用外標(biāo)法，分別向3種沉水植物（苦草、伊樂藻和輪葉黑藻）樣品中加入ENR和CIP，設(shè)3個(gè)添加水平（0.05、0.10、0.50μg·g－1），根據(jù)1.5所建立的方法，以3倍信噪比、外標(biāo)法和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別計(jì)算檢測(cè)限、回收率和精密度。

1.7 沉水植物蓄積恩諾沙星模擬實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)共設(shè)置3組，分別對(duì)應(yīng)苦草、伊樂藻和輪葉黑藻，每組設(shè)4個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)在55 cm×42 cm×33 cm的高密度聚乙烯箱中進(jìn)行，箱子底部鋪上厚度5 cm底泥（事先檢測(cè)不含ENR和CIP），水位高度20.5 cm；每個(gè)箱子種植質(zhì)量（200±2）g、高（18±2）cm的沉水植物，每周添加1 mL的磷酸二氫鉀（10 g·L－1）和尿素（20 g·L－1）；暫養(yǎng)一周后開始實(shí)驗(yàn)，潑灑恩諾沙星使水體濃度為200μg·L－1，在藥物潑灑后的1 h、3 h、6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d、10 d、15 d、20 d和25 d采集沉水植物，用純凈水沖洗后置于－20℃冰箱保存。

1.8 數(shù)據(jù)處理

方法學(xué)數(shù)據(jù)通過Excel進(jìn)行處理，沉水植物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)通過DAS 3.1進(jìn)行計(jì)算，生物富集系數(shù)FBC＝Cf/Cw，其中，Cf和Cw分別為藥物在生物體內(nèi)的濃度和水中的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的建立

2.1.1 提取液的選擇

分別采用乙腈、0.1%甲酸酸化乙腈、1%甲酸酸化乙腈、1%乙酸酸化乙腈和4%乙酸酸化乙腈，按照1.5的處理步驟，對(duì)添加ENR和CIP標(biāo)準(zhǔn)品（0.5μg·g－1）的沉水植物（苦草）樣品進(jìn)行提取，其加標(biāo)回收率見圖1。隨著乙腈酸化程度的提高，ENR和CIP的回收率也相應(yīng)提高，但雜質(zhì)也隨之增多，干擾加大，精密度下降。因此，選擇提取液C（1%甲酸酸化乙腈）作為沉水植物中ENR和CIP的提取液。

圖1 不同提取液下沉水植物中恩諾沙星（ENR）和環(huán)丙沙星（CIP）的回收率（n＝3）Fig.1 Recovery of ENR and CIP in submerged macrophytes under different extraction conditions（n＝3）

2.1.2 萃取鹽的選擇

為了降低待測(cè)物在水相中的溶解度，使有機(jī)相和水相分層，設(shè)計(jì)了0.5 g NaCl、1.0 g NaCl、2.0 g NaCl、0.5 g無水Na2SO4、1.0 g無水Na2SO4和2.0 g無水Na2SO46組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，2種脫水鹽對(duì)恩諾沙星回收率影響不大，對(duì)環(huán)丙沙星回收率略有影響，Na2SO4組的重復(fù)性沒有NaCl穩(wěn)定。從回收率、重現(xiàn)性來看，1.0 g NaCl組效果最優(yōu)。

圖2 不同脫水鹽下沉水植物中恩諾沙星（ENR）和環(huán)丙沙星（CIP）的回收率（n＝3）Fig.2 Recovery of ENR and CIP in submerged macrophytes with different extraction salts（n＝3）

2.1.3 提取時(shí)間的選擇

沉水植物勻漿在提取液中的渦旋時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)ENR和CIP回收率的影響結(jié)果見圖3。提取效果主要由提取液和樣品接觸的提取時(shí)間所決定，渦旋提取15 min，ENR和CIP回收率最高，渦旋時(shí)間再延長(zhǎng)未見回收率提高。

圖3 不同提取時(shí)間下沉水植物中恩諾沙星（ENR）和環(huán)丙沙星（CIP）的回收率（n＝3）Fig.3 Recovery of ENR and CIP in submerged macrophytes with different extraction time（n＝3）

2.1.4 樣品凈化條件的優(yōu)化

沉水植物水分含量高、色素含量高、基質(zhì)復(fù)雜，采用QuEChERS法常用的凈化劑PSA、GCB、氨基和C18去除樣品中碳水化合物、脂肪酸和色素等極性物質(zhì)［15］。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了不同含量PSA（50 mg、100 mg和150 mg）、GCB（5 mg、10 mg和15 mg）、氨基（50 mg、100 mg和150 mg）和C18（50 mg、100 mg和150 mg）對(duì)沉水植物中恩諾沙星和環(huán)丙沙星回收率的影響（圖4），結(jié)果表明，PSA和GCB的回收率及其重現(xiàn)性優(yōu)于氨基和C18，50 mg的PSA和5 mg的GCB即可達(dá)到較高的回收率。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，兩者同時(shí)使用，基線更加平穩(wěn)，雜質(zhì)干擾少。

圖4 不同凈化劑下沉水植物中恩諾沙星（ENR）和環(huán)丙沙星（CIP）的回收率（n＝3）Fig.4 Recovery of ENR and CIP in submerged macrophytes cleaned by different purification agents（n＝3）

2.2 方法學(xué)建立

2.2.1 沉水植物中ENR和CIP色譜行為

圖5是ENR和CIP標(biāo)準(zhǔn)品、沉水植物空白樣和加標(biāo)樣的HPLC色譜行為圖。ENR和CIP的保留時(shí)間分別為4.25 min和3.35 min，基線平穩(wěn)，藥物峰分離良好，成BB峰，滿足藥物分析要求。

圖5 0.5μg·mL－1 ENR和CIP標(biāo)準(zhǔn)品、沉水植物空白和沉水植物加標(biāo)色譜圖Fig.5 Chromatograms of 0.5μg·mL－1 ENR and CIP standard，blank submerged macrophyte and submerged macrophyte added standards

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限

將恩諾沙星和環(huán)丙沙星混標(biāo)母液（濃度分別為100 mg·L－1）稀釋成1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.01 m·L－1的標(biāo)準(zhǔn)品濃度進(jìn)行HPLC分析，以藥物峰面積（y）對(duì)應(yīng)藥物質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸分析，ENR和CIP的標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)限見表1。

表1 ENR和CIP的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和檢測(cè)限Tab.1 Linear relationship，correlation coefficient and detection limit of ENR and CIP

2.2.3 回收率與精密度

在空白沉水植物（苦草、伊樂藻和輪葉黑藻）樣品中設(shè)置ENR和CIP 3個(gè)添加水平（0.05、0.10、0.50μg·g－1），按優(yōu)化后的方法測(cè)定回收率。結(jié)果顯示，在3種沉水植物中ENR平均回收率為79.60%～104.90%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.86%～10.90%；CIP平均回收率為57.26%～102.00%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.80%～11.72%。

2.3 沉水植物對(duì)恩諾沙星的蓄積、代謝與消除

2.3.1 沉水植物對(duì)恩諾沙星的蓄積與消除規(guī)律

施藥后，苦草、伊樂藻和輪葉黑藻中恩諾沙星含量隨時(shí)間的變化見圖6。沉水植物中恩諾沙星含量均呈現(xiàn)先快速升高、后下降的趨勢(shì)，且均在施藥后24 h達(dá)到最高值，分別為0.82μg·g－1、0.86μg·g－1和2.34μg·g－1，之后均呈緩慢下降的趨勢(shì)，600 h時(shí)恩諾沙星濃度分別降至0.09μg·g－1、0.15μg·g－1和0.22μg·g－1；采用梯形法計(jì)算曲線下面積，分別為192.06（μg·g－1）·h、209.92（μg·g－1）·h和471.44（μg·g－1）·h。24 h時(shí)沉水植物中恩諾沙星含量最高，此時(shí)水樣中恩諾沙星濃度平均為0.084 3μg·g－1，推算3種沉水植物對(duì)恩諾沙星的生物富集系數(shù)FBC分別為9.7、10.2和27.8。

表2 不同沉水植物的加標(biāo)回收率和精密度（n＝3）Tab.2 Recovery and precision of different submerged macrophytes（n＝3）

圖6 沉水植物中恩諾沙星含量隨時(shí)間變化（n＝4）Fig.6 Profile of enrofloxacin concentrations in submerged macrophytes with time（n＝4）

2.3.2 沉水植物中環(huán)丙沙星的消除規(guī)律

施藥后，苦草、伊樂藻和輪葉黑藻中恩諾沙星代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星含量隨時(shí)間的變化見圖7。3種沉水植物中環(huán)丙沙星濃度總體趨勢(shì)呈先上升后下降的趨勢(shì)，且均在施藥后72 h達(dá)到最高值，分別為0.027μg·g－1、0.029μg·g－1和0.037 μg·g－1，300 h后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)；采用梯形法計(jì)算曲線下面積，分別為8.42（μg·g－1）·h、8.21（μg·g－1）·h和12.21（μg·g－1）·h?？嗖荨⒁翗吩搴洼喨~黑藻中代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星最高含量與恩諾沙星最高含量的百分比分別為3.29%、3.37%和1.58%，代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星曲線下面積與恩諾沙星的百分比分別為4.39%、3.87%和2.59%。

圖7 沉水植物中環(huán)丙沙星含量隨時(shí)間變化（n＝4）Fig.7 Profile of ciprofloxacin concentrations in submerged macrophytes with time（n＝4）

3 討論

3.1 沉水植物中喹諾酮類的檢測(cè)方法

沉水植物水分和色素含量高，基質(zhì)復(fù)雜，干擾因素大，已有的前處理方法不能很好適用于沉水植物，本實(shí)驗(yàn)從提取液、脫水鹽和吸附劑等幾方面進(jìn)行了優(yōu)化。1）恩諾沙星和環(huán)丙沙星在酸性條件下溶解較好，在乙腈中添加甲酸或乙酸，使提取環(huán)境呈酸性，能有效抑制藥物的離子化，從而提高了待測(cè)物在有機(jī)相中分配比例。2）QuEChERS法簡(jiǎn)便、快捷，常用于農(nóng)產(chǎn)品藥殘檢測(cè)的樣品前處理，但商品化的QuEChERS試劑不適用于沉水植物。QuEChERS法處理生物樣品時(shí)，為了降低待測(cè)物在水中的溶解度，通常加入NaCl、無水Na2SO4和無水MgSO4等萃取鹽［15］，因?yàn)猷Z酮類藥物容易與Mg2＋離子形成穩(wěn)定的螯合物［16］，本實(shí)驗(yàn)中僅比較了NaCl和無水Na2SO4，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看NaCl提取效果的穩(wěn)定性優(yōu)于無水Na2SO4。3）比較了不同凈化劑對(duì)喹諾酮類藥物回收率的影響，其中C18對(duì)ENR和CIP存在一定的吸收，PSA、氨基和GCB的用量對(duì)其幾乎沒有影響，但氨基的穩(wěn)定性遠(yuǎn)低于其他凈化劑，而PSA結(jié)構(gòu)中含有2個(gè)NH2，吸附量大于氨基，并且兩個(gè)NH2可以螯合樣品中的金屬離子，GCB對(duì)蔬菜樣品中的色素具有很好的吸附效果［17］，因此本實(shí)驗(yàn)采用PSA和GCB組合，可以有效解決沉水植物中色素等雜質(zhì)的干擾。

本方法回收率低于羅潔等［18］和田茂軍等［19］在蔬菜中喹諾酮類的檢測(cè)方法，推測(cè)其可能的原因是沉水植物在水徑流作用下容易蓄積污染物，雜質(zhì)干擾多從而導(dǎo)致回收率降低。但本方法通過萃取鹽和凈化劑分別去除水分和雜質(zhì)，降低濃縮時(shí)間和節(jié)約成本，更有利于檢測(cè)工作。

3.2 水生植物在去除水環(huán)境化學(xué)污染物中作用

水生植物是人工濕地和水產(chǎn)養(yǎng)殖尾水處理系統(tǒng)中的基本組成部分。水生植物不僅直接吸收水中的營(yíng)養(yǎng)鹽供其自身生長(zhǎng)，并且能富集水中的農(nóng)藥、抗菌藥和重金屬等污染物，通過直接吸收、根系分泌作用和根區(qū)微生物作用，直接或間接去除化學(xué)污染物［20］。有研究報(bào)道，人工濕地中，磺胺甲■唑、羅紅霉素和氧氟沙星3種抗菌藥在種植風(fēng)車草（Cyperus involucratus）條件下的去除率均高于未種植水生植物的去除率［21］。FERNANDES等［22］在實(shí)驗(yàn)室條件下確定了蘆葦能吸收并降解恩諾沙星；ZHANG等［12］在模擬池塘環(huán)境中發(fā)現(xiàn)歐亞苦草（Vallisneria spiralis）能有效去除底泥中的恩諾沙星和環(huán)丙沙星，但沒有明確是水生植物的吸收降解，還是光降解、水解作用，或是底泥微生物的作用。本實(shí)驗(yàn)比較了3種水生植物對(duì)恩諾沙星的蓄積作用，發(fā)現(xiàn)輪葉黑藻對(duì)水環(huán)境中恩諾沙星富集遠(yuǎn)大于其他兩種沉水植物，說明研究藥物在植物體內(nèi)的代謝、蓄積和消除規(guī)律是明確植物作用的重要手段。

3.3 恩諾沙星在水生植物中的代謝

關(guān)于恩諾沙星代謝產(chǎn)物的研究在真菌、哺乳動(dòng)物、家禽類動(dòng)物和水生動(dòng)物中報(bào)道很多，但對(duì)于水生植物中恩諾沙星代謝產(chǎn)物的研究，僅在歐亞苦草（Vallisneria spiralis）［12］、加拿大伊 樂 藻（Elodea canadensis）［13］、反 枝 莧（Amaranthus retroflexus）［23］、大車前（Plantago major）［23］、小酸模（Rumex acetosella）［23］和 滿 江 紅（Azolla filiculoides）［23］等植物中提及能將恩諾沙星代謝成環(huán)丙沙星，本研究結(jié)果與其相一致，在苦草、伊樂藻和輪葉黑藻都能檢測(cè)到代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星的存在，從代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星最高含量和曲線下面積來看，與恩諾沙星在水生動(dòng)物中較為接近［23－24］。GOMES等［13］提出了細(xì)胞色素P450很可能參與了水蕰草中恩諾沙星代謝生成環(huán)丙沙星的過程，目前關(guān)于水生植物中恩諾沙星代謝的研究?jī)H局限于檢出環(huán)丙沙星，恩諾沙星在水生植物中的代謝機(jī)制還需今后進(jìn)一步深入研究。