李 涵，樊成奇，陳 莎，周 進(jìn)，周俊芳，陸亞男，馬麗艷，田曉清，3

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部遠(yuǎn)洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；5.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部低洼鹽堿地水產(chǎn)養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090）

地球表面約70%以上的面積都是海洋，海洋由于其特殊的環(huán)境（高壓、高鹽、低溫等）擁有著非常豐富的微生物資源［1］。為了在海洋獨(dú)特的環(huán)境中生存，海洋微生物產(chǎn)生了不同的適應(yīng)機(jī)制，包括產(chǎn)生一些特定的生物分子，以及一些陸生環(huán)境中未曾發(fā)現(xiàn)的具有生物活性的化合物等［2］。種類(lèi)豐富、代謝獨(dú)特的海洋微生物是海洋天然產(chǎn)物的重要生產(chǎn)力，也是發(fā)現(xiàn)新藥的一個(gè)重要來(lái)源［3］，這一方面彌補(bǔ)了因新的陸生生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物越來(lái)越少的不足［4］，另一方面也為發(fā)現(xiàn)新的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物提供了新的途徑。

海洋來(lái)源的真菌，其次級(jí)代謝產(chǎn)物因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和活性的多樣性，在近些年受到了研究者們的廣泛關(guān)注。在來(lái)源于南海海域可培養(yǎng)真菌中已經(jīng)分離到多種具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，例如核苷類(lèi)［5］、萜類(lèi)［6－7］、吲哚生物堿類(lèi)［8］、聚酮類(lèi)化合物［9］、生物堿［9－10］等，分離出來(lái)的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有很好的抗菌活性［9］、抗腫瘤活性［9］、抗氧化活性［9］、抗細(xì)胞毒性［10］、抗煙草花葉病毒［11］等。由此可見(jiàn)，從海洋來(lái)源的真菌中發(fā)掘新的活性物質(zhì)具有很好的發(fā)展前景。

南海是中國(guó)面積最大的海域，地處熱帶-亞熱帶地區(qū)，最大深處大于5 000 m，周?chē)卸喾N生態(tài)系統(tǒng)分區(qū)如海島、珊瑚、紅樹(shù)林等［12］，蘊(yùn)含著非常豐富的微生物資源，是研究海洋微生物多樣性的理想?yún)^(qū)域之一。但近年來(lái)對(duì)南海微生物的多樣性研究主要集中在沉積物中［13－15］，僅有少數(shù)文獻(xiàn)對(duì)海水中微生物的多樣性進(jìn)行報(bào)道［16－20］。本文通過(guò)對(duì)南海表層海水微生物的多樣性及真菌粗提物的組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制活性、抗腫瘤和抑菌活性進(jìn)行研究，旨在篩選和發(fā)現(xiàn)可以作為海洋藥物來(lái)源的天然產(chǎn)物，為南海微生物資源開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

海水樣品的采集和保存：2019年10月于南海北部海域選取8個(gè)站位（15號(hào)、17號(hào)、19號(hào)、21號(hào)、39號(hào)、41號(hào)、43號(hào)和45號(hào)站位）采集樣品，具體站位信息如表1。樣品采集后冷藏運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室4℃冰箱中保存。

表1 南海北部海域采樣站位信息Tab.1 Information of sampling stations in the northern South China Sea

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離和純化

海水樣品5 L，用0.22μm的無(wú)菌濾膜過(guò)濾，濾膜剪碎后放入無(wú)菌離心管中，加入10 mL無(wú)菌水充分振蕩混勻后靜置于4℃冰箱過(guò)夜。取菌懸液1 mL至9 mL無(wú)菌水中，常溫混勻，并梯度稀釋3次（10－1、10－2、10－3），取300μL混合液至細(xì)菌、真菌平板中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～28 d。所有分離培養(yǎng)基均按照文獻(xiàn)［21］方法配制。真菌分離培養(yǎng)基：YPD合成培養(yǎng)基、PDA合成培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基；細(xì)菌分離培養(yǎng)基：2216E合成培養(yǎng)基；放線菌分離培養(yǎng)基：高氏1號(hào)培養(yǎng)基、R2A培養(yǎng)基、Qligo培養(yǎng)基、2216E合成培養(yǎng)基。肉眼觀察菌落的特征（形態(tài)、大小、顏色等），初步篩選后挑選出不同形態(tài)的菌落至相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中，三線法純化至單菌落，斜面保存至4℃冰箱中。真菌分離過(guò)程中在培養(yǎng)基中兩兩加入抗生素：青霉素、鏈霉素、氯霉素各30 mg·mL－1。細(xì)菌分離過(guò)程中在培養(yǎng)基中兩兩加入抗生素：放線菌酮50 mg·mL－1，萘啶酮酸25 mg·mL－1，重鉻酸鉀50 mg·mL－1。

1.2.2 菌株鑒定

將微生物單菌落分別接種到5 mL相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，置于振蕩培養(yǎng)箱中28℃，160 r·min－1培養(yǎng)2～5 d。細(xì)菌DNA提取，根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（Takara miniBest Bacteria DNA Extraction Kit Ver3.0，生工生物工程（上海）股份有限公司）說(shuō)明書(shū)步驟提取目標(biāo)基因組DNA。真菌DNA委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行提取，根據(jù)真菌基因組DNA提取試劑盒（E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit（M5635-02），OMEGA）說(shuō)明書(shū)步驟提取目標(biāo)基因組DNA。

使用細(xì)菌通用引物：27F：（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R：（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）；真菌通用引物：ITS1：（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4：（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。

細(xì)菌PCR反應(yīng)體系為50μL：2X Taq PCR Master Mix 25μL，DMSO 0.5μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 2μL，ddH2O 20.5μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃5 min；變性95℃30 s、退火56℃30 s、延伸72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；延伸72℃10 min。真菌PCR反應(yīng)系為25μL：10X PCR Buffer 2.5μL，MgCl（25 mmol·L－1）2μL，dNTP（2 mmol·L－1）0.5μL，上下引物各1μL，Taq DNA Polymerase（5 U·μL－1）0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O 16.5μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃5 min；變性94℃30 s、退火60℃30 s、延伸72℃1 min，35個(gè)循環(huán)；延伸72℃8 min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將所測(cè)得細(xì)菌序列上傳至EZbiocloud網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)，真菌序列提交至NCBI網(wǎng)站并進(jìn)行Blast比對(duì)，下載同源性較高的序列，用Clustal W對(duì)所得序列進(jìn)行校正比對(duì)分析，利用Mega 7.0軟件構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 真菌培養(yǎng)與粗提物制備

結(jié)合真菌序列比對(duì)結(jié)果和真菌所處站位的不同，從中挑選出16株真菌（表2）在真菌平板上活化。挑取一定量活化好的菌絲體接種于500 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28℃、120 r·min－1條件下培養(yǎng)18 d。培養(yǎng)結(jié)束后加入1.5 L無(wú)水乙醇浸泡，靜置過(guò)夜，超聲2次，每次30 min，待菌絲體沉降后，收集濾液，減壓濃縮，濃縮液用DMSO溶解，制成10 mg·mL－1的粗提物備用。

表2 參與活性篩選的16株真菌的具體分類(lèi)信息匯總Tab.2 Summary of specific taxonomic information of 16 strains of fungi in activity screening

1.2.4 活性篩選

1.2.4.1 HDAC抑制活性篩選

按照HDAC抑制劑藥物篩選試劑盒（BioVision，貨號(hào)K340-100）說(shuō)明書(shū)操作。采用黑色96孔板，總反應(yīng)體系為100μL。SAHA作為陽(yáng)性對(duì)照1，以DMSO溶解，配置成100μmol·L－1的SAHA溶液；TSA（試劑盒自帶的抑制劑）作為陽(yáng)性對(duì)照2。Reaction Mix體系為50μL：10μL 10X HDAC Assay Buffer，2 μL Hela Nuclear Extract，5μL HDAC Substrate，33μL超純水。待測(cè)粗提物反應(yīng)體系為50μL的Reaction Mix，49 μL的超純水，1μL的待測(cè)粗提物。陽(yáng)性對(duì)照1的反應(yīng)體系為50μL的Reaction Mix，49μL的超純水，1μL的SAHA溶液。陽(yáng)性對(duì)照2的反應(yīng)體系為50μL的Reaction Mix，47μL的超純水，2 μL的DMSO溶液，1μL的TSA溶液。陰性對(duì)照的反應(yīng)體系為50μL的Reaction Mix，49μL的超純水，1μL的DMSO。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行重復(fù)，計(jì)算HDAC的抑制活性。

1.2.4.2 抗腫瘤活性篩選

按照MTT［22］法測(cè)定16株真菌粗提物對(duì)HeLa細(xì)胞（購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù)，上海）的活性。真菌粗提物稀釋到60μg·mL－1，紫杉醇作為陽(yáng)性對(duì)照其濃度為2μg·mL－1，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4.3 抑菌活性篩選

按照K-B紙片法［23］測(cè)定16株真菌粗提物的抑菌活性。具體步驟為：將10 mg·mL－1的真菌粗提物稀釋至0.2 mg·mL－1，將待測(cè)的兩株指示菌嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、維氏氣單胞菌（Aeromonas vickers）（來(lái)源于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所）接種到液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)12 h進(jìn)行菌株活化，調(diào)整其菌液濃度為104個(gè)·mL－1。將兩株指示菌液分別吸取100μL均勻涂布在LB固體平板上。等待菌液吸收后，在平板上放置滅菌的濾紙片，加入稀釋后的真菌粗提物5μL，28℃培養(yǎng)12 h，空白平板作為陰性對(duì)照，以抑菌圈的直徑來(lái)表示粗提物抑菌活性的強(qiáng)弱，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 可培養(yǎng)細(xì)菌的分離結(jié)果

采用稀釋涂布的方法對(duì)2019年采集的8個(gè)站位的海水樣品中微生物進(jìn)行菌株分離培養(yǎng)。經(jīng)16S rRNA基因序列比對(duì)分析，合并相似度在98%以上的菌株為同一種［24］，共分離得到162株細(xì)菌。對(duì)162株細(xì)菌進(jìn)行16SrRNA基因序列比對(duì)結(jié)果顯示：分屬于4個(gè)門(mén)，5個(gè)綱，15個(gè)目，21個(gè)科，35個(gè)屬的61個(gè)種，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建如圖1。從門(mén)水平上來(lái)看，變形菌門(mén)（Proteobacteria）和放線菌門(mén)（Actinomycetes）為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，變形菌門(mén)一共分 離 出105株，其 中α-變 形 菌 綱（α-Proteobacteria）84株，占51.8%，γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria）21株，占12.9%。放線菌門(mén)50株，占30.8%，擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）4株，占2.5%，厚壁菌門(mén)（Firmicutes）3株，占1.9%。

圖1 基于NJ法對(duì)部分細(xì)菌代表菌株16S r RNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Neighbour-joining（NJ）tree based on bacterial 16S r DNA sequences of some representative bacterial strains

從屬水平上來(lái)看（圖2），微桿菌屬（Microbacterium）和赤桿菌屬（Erythrobacter）為優(yōu)勢(shì)屬，分別分離得到40株和23株，袁其鵬屬（Qipengyuania）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和斯塔普氏菌屬（Stappia）分別分離得到14株、10株和9株。Salipiger屬 分 離 得 到6株，Brachybacterium、Citromicrobium、Marinobacter、Sulfitobacter屬各分離得到5株，Pseudooceanicola屬 分 離 得 到4株，Bacillus、Brevundimonas、Croceicoccus、Roseibium屬 各 分 離 得 到3株，Limimaricola、Mesoflavibacter、Psychrobacter、Paracoccus、Sphingobium屬各分離得到2株，Agrococcus、Arthrobacte、Chromohalobacter、Devosia、Dietzia、Gulosibacter、Halomonas、Janibacter、Leeuwenhoekiella、Pannonibacter、Pseudidiomarina、Salinicola、Thalassospira和Zunongwangia屬都只分離得到1株。

圖2 分離得到的細(xì)菌屬分類(lèi)及數(shù)量占比情況Fig.2 Classification of isolated bacteria strains by genus and number proportion

從菌株數(shù)量上來(lái)看（圖3），Erythrobacter pelagi分離得到的菌株數(shù)量最多，共12株；E.flavus和Microbacterium aurantiacum、M.schleiferi次之，分別分離得到10、9、9株。

圖3 分離得到細(xì)菌種分類(lèi)及數(shù)量占比情況Fig.3 Classification of specific species of isolated bacteria strains and number proportion

2.2 不同站位可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性

在不同站位間分離出來(lái)的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性有明顯差異。從門(mén)水平上來(lái)看（圖4-A），8個(gè)站位都分離到變形菌門(mén)和放線菌門(mén)的細(xì)菌，且在每個(gè)站位中變形菌門(mén)菌株數(shù)均高于放線菌門(mén)菌株數(shù)，只有3個(gè)站位分離到厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)。19號(hào)站位和21號(hào)站位分離得到細(xì)菌菌落組成相同，變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)菌株在這兩個(gè)站位中都有分離到。17號(hào)、39號(hào)和41號(hào)站位的細(xì)菌菌落為放線菌門(mén)和變形菌門(mén)。15號(hào)和45號(hào)站位雖然都分離到3個(gè)門(mén)的細(xì)菌，但是它們的菌落組成不一樣，兩個(gè)站位均分離到來(lái)自放線菌門(mén)和變形菌門(mén)中的細(xì)菌，15號(hào)站位未能分離到擬桿菌門(mén)細(xì)菌但分離到厚壁菌門(mén)的芽孢桿菌屬，45號(hào)站位未能分離到厚壁菌門(mén)但有來(lái)自擬桿菌門(mén)的細(xì)菌。

從屬水平上來(lái)看（圖4-B），15、19和21號(hào)站位分離到的屬種類(lèi)最豐富，分別為15、13、14種，17號(hào)站位中分離出來(lái)的細(xì)菌數(shù)最少且屬的種類(lèi)也最少，只有4個(gè)屬。Erythrobacter、Microbacterium、Qipengyuania這3個(gè)屬分布較廣，從7個(gè) 站 位 中 分 離 出 來(lái)。Stappia和Citromicrobium屬?gòu)?個(gè)站位中分離出來(lái)、Pseudomonas和Brevundimonas屬?gòu)?個(gè)站位中分離出來(lái)，Roseibium、Pseudooceanicola、Marinobacter和Bacillus屬?gòu)?個(gè)站位中分離出來(lái)，Salipiger、Paracoccus、Croceicoccus和Brevibacterium屬?gòu)?個(gè)站位中分離出來(lái)。另有20個(gè)屬的細(xì)菌都只在特定的站位中被分離出來(lái)，分屬于21、19、15、45和39號(hào)站位，占總屬多樣性的57%，其中21號(hào)站位分離出特定屬的數(shù)量是最多的（6個(gè)屬），19號(hào)站位中有5個(gè)屬，15號(hào)站位中有4個(gè)屬，45號(hào)站位中有3個(gè)屬，39號(hào)站位中有2個(gè)屬。

圖4 不同站分離得到細(xì)菌門(mén)（A）和屬（B）水平多樣性Fig.4 Phylum（A）and genus（B）level diversity of bacteria isolated from different sites

2.3 可培養(yǎng)真菌的多樣性

從8個(gè)站位的海水樣品中分離出真菌，共43株。經(jīng)過(guò)ITS基因序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)這43株真菌分屬于2個(gè)門(mén)，5個(gè)綱，7個(gè)目，7個(gè)科，7個(gè)屬的14個(gè)種，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建如圖5。

圖5 基于NJ法對(duì)ITSr DNA序列的部分真菌所屬菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Neighbour-joining（NJ）tree based on fungi ITS r DNA sequences of some representative fungi strains

從門(mén)水平上來(lái)看，這43株真菌分屬于子囊菌門(mén)（Ascomycota）和擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota），子囊菌門(mén)中所分離出來(lái)的菌株數(shù)量是最多的，有40株，其余3株是擔(dān)子菌門(mén)。從屬水平上來(lái)看，Aspergillus為優(yōu)勢(shì)屬，共分離得到21株，占48.8%；其次是Penicillium，分離得到9株，占20.9%； Cladosporium、 Cystobasidium、Purpureocillium、Exophiala和Candida分別分離得到5、3、2、2和1株，各占11.6%、7%、4.7%、4.7%和2.3%。從菌株數(shù)量上來(lái)看，Penicillium oxalicum分離得到的菌株數(shù)量是最多的，共分離得到9株，其次是Aspergillus versicolor，分離得到7株。A.sydowii和A.carneus則分別分離得到4株。Cystobasidium minutum和Aspergillus flavus分別分離得到3株。Purpureocillium lilacinum、Cladosporium halotolerans、 Cladosporium sphaerospermum和Exophiala xenobiotica分別分離得 到2株，Aspergillus hiratsukae、A.niger、A.tabacinus、Candida tropicalis和Cladosporium cladosporioides都分別只分離得到1株。從分離到的真菌序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的序列相比，其相似性都大于98%。

2.4 部分真菌的活性分析

HDAC抑制活性篩選結(jié)果顯示（圖6），這16株真菌粗提物對(duì)HDAC均有一定的抑制作用，但與陽(yáng)性對(duì)照組相比抑制率較低，抑制率在44%～54%之間，陽(yáng)性對(duì)照組SAHA和TSA對(duì)HDAC的抑制率達(dá)92.3%和94.7%。Aspergillus sydowii b-96、Aspergillus versicolor h-291、Aspergillus versicolor e-118、Cladosporium halotolerans b-61、Cystobasidium minutum e-114、Penicillium oxalicum f-112、Cystobasidium minutum e-129、Penicillium oxalicum b-49的真菌粗提物對(duì)組蛋白去乙酰化酶的抑制率在50%～54%之間，其余真菌粗提物對(duì)HDAC的抑制率在44%～49%之間，A.sydowii b-96的真菌粗提物的抑制率最高，為54%，A.versicolor h-291的抑制率次之，為53%，A.flavus f-111的抑制率最低，為44%。

抗癌活性結(jié)果顯示（圖6），這16株真菌粗提物在濃度為60μg·mL－1時(shí)對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率較低，其中編號(hào)為P.oxalicum h-287和A.versicolor h-291的真菌粗提物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率為37%和35%，A.sydowii b-96和E.spinifera c-110這兩株真菌粗提物對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率最低，僅為2%。

圖6 16株真菌HDAC、抗腫瘤活性篩選結(jié)果Fig.6 Screening results of HDAC and antitumor activity of 16 strains of fungi

抑菌活性測(cè)試發(fā)現(xiàn)，這16株真菌粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌沒(méi)有抑菌效果。

3 討論

本研究從南海局部地區(qū)采集了8個(gè)站位的表層海水樣品，經(jīng)過(guò)基因序列比對(duì)分析后共分離得到162株細(xì)菌和43株真菌。162株細(xì)菌是由變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)組成的，其中α-變形菌綱和放線菌綱為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，與蘇悅［16］從南海北部海域分離到的細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群相同。本實(shí)驗(yàn)中分離到的厚壁菌門(mén)數(shù)量最少，且都是芽孢桿菌屬，與徐重［17］、盧靖雯等［18］從南海表層海水中分離的結(jié)果一致，而蘇悅［16］未能從南海北部海域表層海水中分離到厚壁菌門(mén)菌株。有研究顯示，可培養(yǎng)的芽孢桿菌屬在南海沉積物中分離到的菌株數(shù)量多于表層海水［25－27］，推測(cè)是芽孢桿菌屬在海水中的分布少于沉積物中，原因可能是海水中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相較于沉積物中偏少，導(dǎo)致芽孢桿菌未能在海水中形成芽孢幫助它抵御復(fù)雜的海洋環(huán)境，不足以支撐其在海水中存活下來(lái)；亦或是實(shí)驗(yàn)室中使用的培養(yǎng)基選擇性不強(qiáng)，不適合芽孢桿菌的生長(zhǎng)，對(duì)于海水中分離芽孢桿菌屬較少的原因還需要進(jìn)行更深入的探討。

基于本研究分離結(jié)果，不同站位分離得到的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性、數(shù)量存在差異。從采樣的空間水平分布來(lái)看，15～21號(hào)這4個(gè)站位的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性多于39～45號(hào)站位，造成站位間分離到的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性差異的原因，可能是受到各個(gè)站位水文因素的影響，如洋流、營(yíng)養(yǎng)組成［28］。

從8個(gè)站位中分離得到43株真菌，經(jīng)過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后其ITS序列與真菌相似性均大于98%。大多數(shù)的海洋真菌都屬于子囊菌門(mén)，從中分離到的擔(dān)子菌門(mén)代表性卻不足［29］，本實(shí)驗(yàn)中真菌分離結(jié)果與其相同。其中曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬（Penicillium）為優(yōu)勢(shì)屬，分別占48.8%和20.9%。曲霉屬和青霉屬在自然界中分布較廣，從馮麗等［30］、曾奇等［15］和曲佳等［31］從南海沉積物中分離出的真菌多樣性結(jié)果來(lái)看，曲霉屬和青霉屬在沉積物中也為優(yōu)勢(shì)屬。

抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，真菌P.oxalicum h-287和A.versicolor h-291粗提物對(duì)Hela細(xì)胞活性的抑制率最高，分別為37%和35%。AWAD等［32］對(duì)A.versicolor Faesay4進(jìn)行深層發(fā)酵后獲得L-谷氨酰胺酶，對(duì)其進(jìn)行抗腫瘤活性研究，發(fā)現(xiàn)其對(duì)人肝癌細(xì)胞（HepG-2）、結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT-116）、乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）、肺癌細(xì)胞（A-549）和宮頸癌細(xì)胞（Hela）細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗癌活性，IC50分別為39.61、12.8、6.18、11.48、7.25μg·mL－1。SHI等［33］從海洋真菌P.oxalicum中分離出一種新型二氫噻吩縮合色酮（POA），POA是具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，被認(rèn)為是一種具有生物活性的抗癌藥物。本實(shí)驗(yàn)中，從兩株不同屬真菌中獲得的粗提物對(duì)Hela腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用，與既往文獻(xiàn)研究結(jié)果相似，后續(xù)可以對(duì)這兩株真菌擴(kuò)大發(fā)酵，以期從中分離出具有抗腫瘤活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。

WANG等［34］從中國(guó)西沙群島采集到的海綿上分離到一株Aspergillus sydowii，對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后從乙酸乙酯提取部位分離得到一個(gè)已知化合物aspergillusene A，這種化合物對(duì)嗜水氣單胞菌有顯著的抗菌活性。LI等［35］從深海沉積物真菌A.versicolor SD-330中分離鑒定了1個(gè)新的芳香族雙烯型倍半萜和4個(gè)已知的類(lèi)似物，其中3個(gè)化合物對(duì)嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、遲緩愛(ài)德華菌和哈維弧菌等人畜共患致病菌具有選擇性抑制活性，最低抑菌濃度（MIC）為1.0～8.0 μg·mL－1。通 過(guò) 已 有 文 獻(xiàn) 表 明［34，35］，部 分Aspergillus真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)水生致病菌如嗜水氣單胞菌有抑菌作用，而本實(shí)驗(yàn)中16株真菌的粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌均沒(méi)有抑菌作用，推測(cè)是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)中只測(cè)試了單一粗提物濃度，其中可能的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物濃度低于其最低抑菌濃度，后續(xù)研究將繼續(xù)開(kāi)展對(duì)這16株真菌分離鑒定的次級(jí)代謝產(chǎn)物的抑菌作用的篩選，有望發(fā)現(xiàn)活性化合物。

綜合以上分析，編號(hào)為P.oxalicum h-287和A.versicolor h-291兩株真菌的粗提物在活性篩選實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)優(yōu)異，HDAC抑制率為49%和53%，抗腫瘤抑制率為37%和35%，可以作為潛在的目標(biāo)活性菌株對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物和活性進(jìn)行深入研究。

4 小結(jié)

本文對(duì)南海局部地區(qū)表層海水中分離到的微生物進(jìn)行初步鑒定，共分離得到162株細(xì)菌和43株真菌。樣品中162株細(xì)菌屬于由變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)組成的35個(gè)屬，43株真菌屬于由子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)組成的14個(gè)種，該地區(qū)的微生物多樣性較高。通過(guò)對(duì)分離得到的部分真菌進(jìn)行HDAC活性、抗腫瘤活性和抑菌活性篩選后發(fā)現(xiàn)，16株真菌粗提物對(duì)HDAC都一定的抑制作用，對(duì)人宮頸癌細(xì)胞的抑制率在2%～37%范圍內(nèi)，對(duì)兩株細(xì)菌指示菌沒(méi)有抑菌效果。本研究結(jié)果可為研究南海菌株資源及其代謝產(chǎn)物提供資料，也可為研究人員從南海中發(fā)現(xiàn)有生物活性的天然藥物提供參考。

致謝：感謝浙江工業(yè)大學(xué)占扎君教授團(tuán)隊(duì)完成了體外抗腫瘤活性篩選實(shí)驗(yàn)。