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        南海北部表層海水微生物多樣性及部分真菌活性物質(zhì)研究

        2022-09-22 07:49:48樊成奇周俊芳陸亞男馬麗艷田曉清
        海洋漁業(yè) 2022年4期
        關(guān)鍵詞:粗提物菌門(mén)站位

        李 涵,樊成奇,陳 莎,周 進(jìn),周俊芳,陸亞男,馬麗艷,田曉清,3

        (1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海 201306;2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所,上海 200090;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部遠(yuǎn)洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200090;4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200090;5.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部低洼鹽堿地水產(chǎn)養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200090)

        地球表面約70%以上的面積都是海洋,海洋由于其特殊的環(huán)境(高壓、高鹽、低溫等)擁有著非常豐富的微生物資源[1]。為了在海洋獨(dú)特的環(huán)境中生存,海洋微生物產(chǎn)生了不同的適應(yīng)機(jī)制,包括產(chǎn)生一些特定的生物分子,以及一些陸生環(huán)境中未曾發(fā)現(xiàn)的具有生物活性的化合物等[2]。種類(lèi)豐富、代謝獨(dú)特的海洋微生物是海洋天然產(chǎn)物的重要生產(chǎn)力,也是發(fā)現(xiàn)新藥的一個(gè)重要來(lái)源[3],這一方面彌補(bǔ)了因新的陸生生物活性次級(jí)代謝產(chǎn)物越來(lái)越少的不足[4],另一方面也為發(fā)現(xiàn)新的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物提供了新的途徑。

        海洋來(lái)源的真菌,其次級(jí)代謝產(chǎn)物因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和活性的多樣性,在近些年受到了研究者們的廣泛關(guān)注。在來(lái)源于南海海域可培養(yǎng)真菌中已經(jīng)分離到多種具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物,例如核苷類(lèi)[5]、萜類(lèi)[6-7]、吲哚生物堿類(lèi)[8]、聚酮類(lèi)化合物[9]、生物堿[9-10]等,分離出來(lái)的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有很好的抗菌活性[9]、抗腫瘤活性[9]、抗氧化活性[9]、抗細(xì)胞毒性[10]、抗煙草花葉病毒[11]等。由此可見(jiàn),從海洋來(lái)源的真菌中發(fā)掘新的活性物質(zhì)具有很好的發(fā)展前景。

        南海是中國(guó)面積最大的海域,地處熱帶-亞熱帶地區(qū),最大深處大于5 000 m,周?chē)卸喾N生態(tài)系統(tǒng)分區(qū)如海島、珊瑚、紅樹(shù)林等[12],蘊(yùn)含著非常豐富的微生物資源,是研究海洋微生物多樣性的理想?yún)^(qū)域之一。但近年來(lái)對(duì)南海微生物的多樣性研究主要集中在沉積物中[13-15],僅有少數(shù)文獻(xiàn)對(duì)海水中微生物的多樣性進(jìn)行報(bào)道[16-20]。本文通過(guò)對(duì)南海表層海水微生物的多樣性及真菌粗提物的組蛋白去乙?;福╤istone deacetylase,HDAC)抑制活性、抗腫瘤和抑菌活性進(jìn)行研究,旨在篩選和發(fā)現(xiàn)可以作為海洋藥物來(lái)源的天然產(chǎn)物,為南海微生物資源開(kāi)發(fā)提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        海水樣品的采集和保存:2019年10月于南海北部海域選取8個(gè)站位(15號(hào)、17號(hào)、19號(hào)、21號(hào)、39號(hào)、41號(hào)、43號(hào)和45號(hào)站位)采集樣品,具體站位信息如表1。樣品采集后冷藏運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室4℃冰箱中保存。

        表1 南海北部海域采樣站位信息Tab.1 Information of sampling stations in the northern South China Sea

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1 菌株的分離和純化

        海水樣品5 L,用0.22μm的無(wú)菌濾膜過(guò)濾,濾膜剪碎后放入無(wú)菌離心管中,加入10 mL無(wú)菌水充分振蕩混勻后靜置于4℃冰箱過(guò)夜。取菌懸液1 mL至9 mL無(wú)菌水中,常溫混勻,并梯度稀釋3次(10-1、10-2、10-3),取300μL混合液至細(xì)菌、真菌平板中,置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~28 d。所有分離培養(yǎng)基均按照文獻(xiàn)[21]方法配制。真菌分離培養(yǎng)基:YPD合成培養(yǎng)基、PDA合成培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基;細(xì)菌分離培養(yǎng)基:2216E合成培養(yǎng)基;放線菌分離培養(yǎng)基:高氏1號(hào)培養(yǎng)基、R2A培養(yǎng)基、Qligo培養(yǎng)基、2216E合成培養(yǎng)基。肉眼觀察菌落的特征(形態(tài)、大小、顏色等),初步篩選后挑選出不同形態(tài)的菌落至相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基中,三線法純化至單菌落,斜面保存至4℃冰箱中。真菌分離過(guò)程中在培養(yǎng)基中兩兩加入抗生素:青霉素、鏈霉素、氯霉素各30 mg·mL-1。細(xì)菌分離過(guò)程中在培養(yǎng)基中兩兩加入抗生素:放線菌酮50 mg·mL-1,萘啶酮酸25 mg·mL-1,重鉻酸鉀50 mg·mL-1。

        1.2.2 菌株鑒定

        將微生物單菌落分別接種到5 mL相應(yīng)液體培養(yǎng)基中,置于振蕩培養(yǎng)箱中28℃,160 r·min-1培養(yǎng)2~5 d。細(xì)菌DNA提取,根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Takara miniBest Bacteria DNA Extraction Kit Ver3.0,生工生物工程(上海)股份有限公司)說(shuō)明書(shū)步驟提取目標(biāo)基因組DNA。真菌DNA委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行提取,根據(jù)真菌基因組DNA提取試劑盒(E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit(M5635-02),OMEGA)說(shuō)明書(shū)步驟提取目標(biāo)基因組DNA。

        使用細(xì)菌通用引物:27F:(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R:(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′);真菌通用引物:ITS1:(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4:(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。

        細(xì)菌PCR反應(yīng)體系為50μL:2X Taq PCR Master Mix 25μL,DMSO 0.5μL,上下游引物各1 μL,模板DNA 2μL,ddH2O 20.5μL。PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性95℃5 min;變性95℃30 s、退火56℃30 s、延伸72℃1 min,35個(gè)循環(huán);延伸72℃10 min。真菌PCR反應(yīng)系為25μL:10X PCR Buffer 2.5μL,MgCl(25 mmol·L-1)2μL,dNTP(2 mmol·L-1)0.5μL,上下引物各1μL,Taq DNA Polymerase(5 U·μL-1)0.5μL,DNA模板1μL,ddH2O 16.5μL。PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性94℃5 min;變性94℃30 s、退火60℃30 s、延伸72℃1 min,35個(gè)循環(huán);延伸72℃8 min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將所測(cè)得細(xì)菌序列上傳至EZbiocloud網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì),真菌序列提交至NCBI網(wǎng)站并進(jìn)行Blast比對(duì),下載同源性較高的序列,用Clustal W對(duì)所得序列進(jìn)行校正比對(duì)分析,利用Mega 7.0軟件構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

        1.2.3 真菌培養(yǎng)與粗提物制備

        結(jié)合真菌序列比對(duì)結(jié)果和真菌所處站位的不同,從中挑選出16株真菌(表2)在真菌平板上活化。挑取一定量活化好的菌絲體接種于500 mL YPD液體培養(yǎng)基中,28℃、120 r·min-1條件下培養(yǎng)18 d。培養(yǎng)結(jié)束后加入1.5 L無(wú)水乙醇浸泡,靜置過(guò)夜,超聲2次,每次30 min,待菌絲體沉降后,收集濾液,減壓濃縮,濃縮液用DMSO溶解,制成10 mg·mL-1的粗提物備用。

        表2 參與活性篩選的16株真菌的具體分類(lèi)信息匯總Tab.2 Summary of specific taxonomic information of 16 strains of fungi in activity screening

        1.2.4 活性篩選

        1.2.4.1 HDAC抑制活性篩選

        按照HDAC抑制劑藥物篩選試劑盒(BioVision,貨號(hào)K340-100)說(shuō)明書(shū)操作。采用黑色96孔板,總反應(yīng)體系為100μL。SAHA作為陽(yáng)性對(duì)照1,以DMSO溶解,配置成100μmol·L-1的SAHA溶液;TSA(試劑盒自帶的抑制劑)作為陽(yáng)性對(duì)照2。Reaction Mix體系為50μL:10μL 10X HDAC Assay Buffer,2 μL Hela Nuclear Extract,5μL HDAC Substrate,33μL超純水。待測(cè)粗提物反應(yīng)體系為50μL的Reaction Mix,49 μL的超純水,1μL的待測(cè)粗提物。陽(yáng)性對(duì)照1的反應(yīng)體系為50μL的Reaction Mix,49μL的超純水,1μL的SAHA溶液。陽(yáng)性對(duì)照2的反應(yīng)體系為50μL的Reaction Mix,47μL的超純水,2 μL的DMSO溶液,1μL的TSA溶液。陰性對(duì)照的反應(yīng)體系為50μL的Reaction Mix,49μL的超純水,1μL的DMSO。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)平行重復(fù),計(jì)算HDAC的抑制活性。

        1.2.4.2 抗腫瘤活性篩選

        按照MTT[22]法測(cè)定16株真菌粗提物對(duì)HeLa細(xì)胞(購(gòu)自中科院細(xì)胞庫(kù),上海)的活性。真菌粗提物稀釋到60μg·mL-1,紫杉醇作為陽(yáng)性對(duì)照其濃度為2μg·mL-1,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        1.2.4.3 抑菌活性篩選

        按照K-B紙片法[23]測(cè)定16株真菌粗提物的抑菌活性。具體步驟為:將10 mg·mL-1的真菌粗提物稀釋至0.2 mg·mL-1,將待測(cè)的兩株指示菌嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、維氏氣單胞菌(Aeromonas vickers)(來(lái)源于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所)接種到液體培養(yǎng)基中,28℃振蕩培養(yǎng)12 h進(jìn)行菌株活化,調(diào)整其菌液濃度為104個(gè)·mL-1。將兩株指示菌液分別吸取100μL均勻涂布在LB固體平板上。等待菌液吸收后,在平板上放置滅菌的濾紙片,加入稀釋后的真菌粗提物5μL,28℃培養(yǎng)12 h,空白平板作為陰性對(duì)照,以抑菌圈的直徑來(lái)表示粗提物抑菌活性的強(qiáng)弱,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 可培養(yǎng)細(xì)菌的分離結(jié)果

        采用稀釋涂布的方法對(duì)2019年采集的8個(gè)站位的海水樣品中微生物進(jìn)行菌株分離培養(yǎng)。經(jīng)16S rRNA基因序列比對(duì)分析,合并相似度在98%以上的菌株為同一種[24],共分離得到162株細(xì)菌。對(duì)162株細(xì)菌進(jìn)行16SrRNA基因序列比對(duì)結(jié)果顯示:分屬于4個(gè)門(mén),5個(gè)綱,15個(gè)目,21個(gè)科,35個(gè)屬的61個(gè)種,系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建如圖1。從門(mén)水平上來(lái)看,變形菌門(mén)(Proteobacteria)和放線菌門(mén)(Actinomycetes)為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群,變形菌門(mén)一共分 離 出105株,其 中α-變 形 菌 綱(α-Proteobacteria)84株,占51.8%,γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)21株,占12.9%。放線菌門(mén)50株,占30.8%,擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)4株,占2.5%,厚壁菌門(mén)(Firmicutes)3株,占1.9%。

        圖1 基于NJ法對(duì)部分細(xì)菌代表菌株16S r RNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Neighbour-joining(NJ)tree based on bacterial 16S r DNA sequences of some representative bacterial strains

        從屬水平上來(lái)看(圖2),微桿菌屬(Microbacterium)和赤桿菌屬(Erythrobacter)為優(yōu)勢(shì)屬,分別分離得到40株和23株,袁其鵬屬(Qipengyuania)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和斯塔普氏菌屬(Stappia)分別分離得到14株、10株和9株。Salipiger屬 分 離 得 到6株,Brachybacterium、Citromicrobium、Marinobacter、Sulfitobacter屬各分離得到5株,Pseudooceanicola屬 分 離 得 到4株,Bacillus、Brevundimonas、Croceicoccus、Roseibium屬 各 分 離 得 到3株,Limimaricola、Mesoflavibacter、Psychrobacter、Paracoccus、Sphingobium屬各分離得到2株,Agrococcus、Arthrobacte、Chromohalobacter、Devosia、Dietzia、Gulosibacter、Halomonas、Janibacter、Leeuwenhoekiella、Pannonibacter、Pseudidiomarina、Salinicola、Thalassospira和Zunongwangia屬都只分離得到1株。

        圖2 分離得到的細(xì)菌屬分類(lèi)及數(shù)量占比情況Fig.2 Classification of isolated bacteria strains by genus and number proportion

        從菌株數(shù)量上來(lái)看(圖3),Erythrobacter pelagi分離得到的菌株數(shù)量最多,共12株;E.flavus和Microbacterium aurantiacum、M.schleiferi次之,分別分離得到10、9、9株。

        圖3 分離得到細(xì)菌種分類(lèi)及數(shù)量占比情況Fig.3 Classification of specific species of isolated bacteria strains and number proportion

        2.2 不同站位可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性

        在不同站位間分離出來(lái)的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性有明顯差異。從門(mén)水平上來(lái)看(圖4-A),8個(gè)站位都分離到變形菌門(mén)和放線菌門(mén)的細(xì)菌,且在每個(gè)站位中變形菌門(mén)菌株數(shù)均高于放線菌門(mén)菌株數(shù),只有3個(gè)站位分離到厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)。19號(hào)站位和21號(hào)站位分離得到細(xì)菌菌落組成相同,變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)菌株在這兩個(gè)站位中都有分離到。17號(hào)、39號(hào)和41號(hào)站位的細(xì)菌菌落為放線菌門(mén)和變形菌門(mén)。15號(hào)和45號(hào)站位雖然都分離到3個(gè)門(mén)的細(xì)菌,但是它們的菌落組成不一樣,兩個(gè)站位均分離到來(lái)自放線菌門(mén)和變形菌門(mén)中的細(xì)菌,15號(hào)站位未能分離到擬桿菌門(mén)細(xì)菌但分離到厚壁菌門(mén)的芽孢桿菌屬,45號(hào)站位未能分離到厚壁菌門(mén)但有來(lái)自擬桿菌門(mén)的細(xì)菌。

        從屬水平上來(lái)看(圖4-B),15、19和21號(hào)站位分離到的屬種類(lèi)最豐富,分別為15、13、14種,17號(hào)站位中分離出來(lái)的細(xì)菌數(shù)最少且屬的種類(lèi)也最少,只有4個(gè)屬。Erythrobacter、Microbacterium、Qipengyuania這3個(gè)屬分布較廣,從7個(gè) 站 位 中 分 離 出 來(lái)。Stappia和Citromicrobium屬?gòu)?個(gè)站位中分離出來(lái)、Pseudomonas和Brevundimonas屬?gòu)?個(gè)站位中分離出來(lái),Roseibium、Pseudooceanicola、Marinobacter和Bacillus屬?gòu)?個(gè)站位中分離出來(lái),Salipiger、Paracoccus、Croceicoccus和Brevibacterium屬?gòu)?個(gè)站位中分離出來(lái)。另有20個(gè)屬的細(xì)菌都只在特定的站位中被分離出來(lái),分屬于21、19、15、45和39號(hào)站位,占總屬多樣性的57%,其中21號(hào)站位分離出特定屬的數(shù)量是最多的(6個(gè)屬),19號(hào)站位中有5個(gè)屬,15號(hào)站位中有4個(gè)屬,45號(hào)站位中有3個(gè)屬,39號(hào)站位中有2個(gè)屬。

        圖4 不同站分離得到細(xì)菌門(mén)(A)和屬(B)水平多樣性Fig.4 Phylum(A)and genus(B)level diversity of bacteria isolated from different sites

        2.3 可培養(yǎng)真菌的多樣性

        從8個(gè)站位的海水樣品中分離出真菌,共43株。經(jīng)過(guò)ITS基因序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)這43株真菌分屬于2個(gè)門(mén),5個(gè)綱,7個(gè)目,7個(gè)科,7個(gè)屬的14個(gè)種,系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建如圖5。

        圖5 基于NJ法對(duì)ITSr DNA序列的部分真菌所屬菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Neighbour-joining(NJ)tree based on fungi ITS r DNA sequences of some representative fungi strains

        從門(mén)水平上來(lái)看,這43株真菌分屬于子囊菌門(mén)(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota),子囊菌門(mén)中所分離出來(lái)的菌株數(shù)量是最多的,有40株,其余3株是擔(dān)子菌門(mén)。從屬水平上來(lái)看,Aspergillus為優(yōu)勢(shì)屬,共分離得到21株,占48.8%;其次是Penicillium,分離得到9株,占20.9%; Cladosporium、 Cystobasidium、Purpureocillium、Exophiala和Candida分別分離得到5、3、2、2和1株,各占11.6%、7%、4.7%、4.7%和2.3%。從菌株數(shù)量上來(lái)看,Penicillium oxalicum分離得到的菌株數(shù)量是最多的,共分離得到9株,其次是Aspergillus versicolor,分離得到7株。A.sydowii和A.carneus則分別分離得到4株。Cystobasidium minutum和Aspergillus flavus分別分離得到3株。Purpureocillium lilacinum、Cladosporium halotolerans、 Cladosporium sphaerospermum和Exophiala xenobiotica分別分離得 到2株,Aspergillus hiratsukae、A.niger、A.tabacinus、Candida tropicalis和Cladosporium cladosporioides都分別只分離得到1株。從分離到的真菌序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的序列相比,其相似性都大于98%。

        2.4 部分真菌的活性分析

        HDAC抑制活性篩選結(jié)果顯示(圖6),這16株真菌粗提物對(duì)HDAC均有一定的抑制作用,但與陽(yáng)性對(duì)照組相比抑制率較低,抑制率在44%~54%之間,陽(yáng)性對(duì)照組SAHA和TSA對(duì)HDAC的抑制率達(dá)92.3%和94.7%。Aspergillus sydowii b-96、Aspergillus versicolor h-291、Aspergillus versicolor e-118、Cladosporium halotolerans b-61、Cystobasidium minutum e-114、Penicillium oxalicum f-112、Cystobasidium minutum e-129、Penicillium oxalicum b-49的真菌粗提物對(duì)組蛋白去乙酰化酶的抑制率在50%~54%之間,其余真菌粗提物對(duì)HDAC的抑制率在44%~49%之間,A.sydowii b-96的真菌粗提物的抑制率最高,為54%,A.versicolor h-291的抑制率次之,為53%,A.flavus f-111的抑制率最低,為44%。

        抗癌活性結(jié)果顯示(圖6),這16株真菌粗提物在濃度為60μg·mL-1時(shí)對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率較低,其中編號(hào)為P.oxalicum h-287和A.versicolor h-291的真菌粗提物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率為37%和35%,A.sydowii b-96和E.spinifera c-110這兩株真菌粗提物對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率最低,僅為2%。

        圖6 16株真菌HDAC、抗腫瘤活性篩選結(jié)果Fig.6 Screening results of HDAC and antitumor activity of 16 strains of fungi

        抑菌活性測(cè)試發(fā)現(xiàn),這16株真菌粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌沒(méi)有抑菌效果。

        3 討論

        本研究從南海局部地區(qū)采集了8個(gè)站位的表層海水樣品,經(jīng)過(guò)基因序列比對(duì)分析后共分離得到162株細(xì)菌和43株真菌。162株細(xì)菌是由變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)組成的,其中α-變形菌綱和放線菌綱為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群,與蘇悅[16]從南海北部海域分離到的細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群相同。本實(shí)驗(yàn)中分離到的厚壁菌門(mén)數(shù)量最少,且都是芽孢桿菌屬,與徐重[17]、盧靖雯等[18]從南海表層海水中分離的結(jié)果一致,而蘇悅[16]未能從南海北部海域表層海水中分離到厚壁菌門(mén)菌株。有研究顯示,可培養(yǎng)的芽孢桿菌屬在南海沉積物中分離到的菌株數(shù)量多于表層海水[25-27],推測(cè)是芽孢桿菌屬在海水中的分布少于沉積物中,原因可能是海水中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)相較于沉積物中偏少,導(dǎo)致芽孢桿菌未能在海水中形成芽孢幫助它抵御復(fù)雜的海洋環(huán)境,不足以支撐其在海水中存活下來(lái);亦或是實(shí)驗(yàn)室中使用的培養(yǎng)基選擇性不強(qiáng),不適合芽孢桿菌的生長(zhǎng),對(duì)于海水中分離芽孢桿菌屬較少的原因還需要進(jìn)行更深入的探討。

        基于本研究分離結(jié)果,不同站位分離得到的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性、數(shù)量存在差異。從采樣的空間水平分布來(lái)看,15~21號(hào)這4個(gè)站位的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性多于39~45號(hào)站位,造成站位間分離到的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性差異的原因,可能是受到各個(gè)站位水文因素的影響,如洋流、營(yíng)養(yǎng)組成[28]。

        從8個(gè)站位中分離得到43株真菌,經(jīng)過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后其ITS序列與真菌相似性均大于98%。大多數(shù)的海洋真菌都屬于子囊菌門(mén),從中分離到的擔(dān)子菌門(mén)代表性卻不足[29],本實(shí)驗(yàn)中真菌分離結(jié)果與其相同。其中曲霉屬(Aspergillus)和青霉屬(Penicillium)為優(yōu)勢(shì)屬,分別占48.8%和20.9%。曲霉屬和青霉屬在自然界中分布較廣,從馮麗等[30]、曾奇等[15]和曲佳等[31]從南海沉積物中分離出的真菌多樣性結(jié)果來(lái)看,曲霉屬和青霉屬在沉積物中也為優(yōu)勢(shì)屬。

        抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,真菌P.oxalicum h-287和A.versicolor h-291粗提物對(duì)Hela細(xì)胞活性的抑制率最高,分別為37%和35%。AWAD等[32]對(duì)A.versicolor Faesay4進(jìn)行深層發(fā)酵后獲得L-谷氨酰胺酶,對(duì)其進(jìn)行抗腫瘤活性研究,發(fā)現(xiàn)其對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG-2)、結(jié)腸癌細(xì)胞(HCT-116)、乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、肺癌細(xì)胞(A-549)和宮頸癌細(xì)胞(Hela)細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗癌活性,IC50分別為39.61、12.8、6.18、11.48、7.25μg·mL-1。SHI等[33]從海洋真菌P.oxalicum中分離出一種新型二氫噻吩縮合色酮(POA),POA是具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性,被認(rèn)為是一種具有生物活性的抗癌藥物。本實(shí)驗(yàn)中,從兩株不同屬真菌中獲得的粗提物對(duì)Hela腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用,與既往文獻(xiàn)研究結(jié)果相似,后續(xù)可以對(duì)這兩株真菌擴(kuò)大發(fā)酵,以期從中分離出具有抗腫瘤活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。

        WANG等[34]從中國(guó)西沙群島采集到的海綿上分離到一株Aspergillus sydowii,對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后從乙酸乙酯提取部位分離得到一個(gè)已知化合物aspergillusene A,這種化合物對(duì)嗜水氣單胞菌有顯著的抗菌活性。LI等[35]從深海沉積物真菌A.versicolor SD-330中分離鑒定了1個(gè)新的芳香族雙烯型倍半萜和4個(gè)已知的類(lèi)似物,其中3個(gè)化合物對(duì)嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、遲緩愛(ài)德華菌和哈維弧菌等人畜共患致病菌具有選擇性抑制活性,最低抑菌濃度(MIC)為1.0~8.0 μg·mL-1。通 過(guò) 已 有 文 獻(xiàn) 表 明[34,35],部 分Aspergillus真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)水生致病菌如嗜水氣單胞菌有抑菌作用,而本實(shí)驗(yàn)中16株真菌的粗提物對(duì)嗜水氣單胞菌均沒(méi)有抑菌作用,推測(cè)是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)中只測(cè)試了單一粗提物濃度,其中可能的活性次級(jí)代謝產(chǎn)物濃度低于其最低抑菌濃度,后續(xù)研究將繼續(xù)開(kāi)展對(duì)這16株真菌分離鑒定的次級(jí)代謝產(chǎn)物的抑菌作用的篩選,有望發(fā)現(xiàn)活性化合物。

        綜合以上分析,編號(hào)為P.oxalicum h-287和A.versicolor h-291兩株真菌的粗提物在活性篩選實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)優(yōu)異,HDAC抑制率為49%和53%,抗腫瘤抑制率為37%和35%,可以作為潛在的目標(biāo)活性菌株對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物和活性進(jìn)行深入研究。

        4 小結(jié)

        本文對(duì)南海局部地區(qū)表層海水中分離到的微生物進(jìn)行初步鑒定,共分離得到162株細(xì)菌和43株真菌。樣品中162株細(xì)菌屬于由變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)組成的35個(gè)屬,43株真菌屬于由子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)組成的14個(gè)種,該地區(qū)的微生物多樣性較高。通過(guò)對(duì)分離得到的部分真菌進(jìn)行HDAC活性、抗腫瘤活性和抑菌活性篩選后發(fā)現(xiàn),16株真菌粗提物對(duì)HDAC都一定的抑制作用,對(duì)人宮頸癌細(xì)胞的抑制率在2%~37%范圍內(nèi),對(duì)兩株細(xì)菌指示菌沒(méi)有抑菌效果。本研究結(jié)果可為研究南海菌株資源及其代謝產(chǎn)物提供資料,也可為研究人員從南海中發(fā)現(xiàn)有生物活性的天然藥物提供參考。

        致謝:感謝浙江工業(yè)大學(xué)占扎君教授團(tuán)隊(duì)完成了體外抗腫瘤活性篩選實(shí)驗(yàn)。

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