李 月，王云龍，歐陽瓏玲

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090）

蟲黃藻（Symbiodinium sp.）是構(gòu)成珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)所必需的共生甲藻。在共生體中，蟲黃藻為珊瑚提供氧氣及合成有機(jī)物等，而珊瑚蟲代謝產(chǎn)生的CO2、硝酸鹽和磷酸鹽等則為蟲黃藻所用，以維持其生長［1］。珊瑚礁在營養(yǎng)貧乏的淺水中形成，與其他水生系統(tǒng)相比，磷的濃度相對較低，其溶解無機(jī)磷（dissolved inorganic phosphorus，DIP）的濃度在0.05～0.50μmol·L－1［2－3］。國內(nèi)外學(xué)者就不同磷酸鹽濃度對造礁珊瑚-蟲黃藻共生體中蟲黃藻的影響開展了較多研究。結(jié)果表明，磷酸鹽限制可引起共生蟲黃藻光合效率降低，增加珊瑚對熱和光脅迫的敏感度而導(dǎo)致其白化［4］；共生蟲黃藻的光合效率可隨磷酸鹽含量的升高而增加，同時(shí)珊瑚的鈣化速率也隨之加快，但在高磷酸鹽初始濃度影響下，共生蟲黃藻的光合作用效率隨著磷濃度的升高反而受到抑制［5］。

實(shí)際上，除與宿主共生外，蟲黃藻也可在珊瑚礁生活的海域外營浮游生活，且這類蟲黃藻可作為潛在的磷源儲(chǔ)備庫，對珊瑚礁的構(gòu)建有著重要的生態(tài)學(xué)意義［6］。由于外部輸入和內(nèi)部周轉(zhuǎn)情況不同，不同海域中磷的含量差異較大。根據(jù)《中國漁業(yè)生態(tài)環(huán)境狀況公報(bào)》，近十年我國海域活性磷酸鹽濃度最低為0.012μmol·L－1，最高達(dá)12.97μmol·L－1。活性磷酸鹽水平在同一海域不同時(shí)期變化也較大，如赤潮發(fā)生后磷酸鹽濃度可降至最低。由此可見，浮游蟲黃藻處在磷酸鹽不斷變化的自然環(huán)境中。但由于目前僅見光照和代謝抑制劑對浮游蟲黃藻吸收磷酸鹽影響的研究［7］，不同磷酸鹽濃度對浮游蟲黃藻的影響尚不可知。雖然有學(xué)者就不同磷源和磷酸鹽濃度對從珊瑚中分離后單獨(dú)培養(yǎng)的蟲黃藻的生長影響進(jìn)行了較為細(xì)致的研究［8－10］，但離體培養(yǎng)與營浮游生活的蟲黃藻對不同磷酸鹽濃度的響應(yīng)可能存在差異［7］。因此，研究浮游蟲黃藻細(xì)胞對不同磷酸鹽濃度的響應(yīng)，以及長時(shí)間處于低磷酸鹽環(huán)境中藻細(xì)胞的生長特性，可進(jìn)一步幫助揭示蟲黃藻的生理生態(tài)特性，并為保護(hù)珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)提供理論依據(jù)。

鑒于此，本研究以從東海海域分離出的浮游蟲黃藻為實(shí)驗(yàn)材料，研究短期內(nèi)4個(gè)初始磷酸鹽濃度對該藻生長的影響，同時(shí)以高磷酸鹽初始濃度為培養(yǎng)條件對該蟲黃藻進(jìn)行長期培養(yǎng)，研究藻細(xì)胞的生長特性，同時(shí)探究光合作用效率及堿性磷酸酶活性（alkaline phosphatase activity，APA）與磷酸鹽之間的響應(yīng)聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 藻種來源及培養(yǎng)

蟲黃藻ECSFRI081109藻株由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所提供。該藻從舟山海域海水樣品中分離純化而得，通過掃描電鏡及ITS基因擴(kuò)增和測序而確定其為蟲黃藻E系群的一種。

配置鹽度為28的人工海水，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后高壓蒸汽滅菌（121℃、20 min），并在超凈工作臺(tái)中配置f/2培養(yǎng)基，保證藻細(xì)胞無菌培養(yǎng)。將接種后的蟲黃藻放置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度為20℃，光照強(qiáng)度為4 000 lx，光暗比為12 h∶12 h。所有培養(yǎng)液每天8∶00和18∶00點(diǎn)手動(dòng)搖勻兩次。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了解不同磷酸鹽濃度對營浮游生活的蟲黃藻的影響，以及當(dāng)藻細(xì)胞長時(shí)間處于低磷酸鹽環(huán)境中是否能維持生長，分別設(shè)計(jì)短期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和長期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 短期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)磷酸二氫鈉初始濃度試驗(yàn)組。其中，基于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)所用f/2培養(yǎng)基設(shè)置最高濃度為35.00μmol·L－1，基于近年來我國東海區(qū)海域中磷酸鹽濃度低值平均值和高值平均值設(shè)置濃度分別為0.15、10.00μmol·L－1，并增設(shè)20.00μmol·L－1試驗(yàn)組。

將達(dá)到指數(shù)生長期的藻液經(jīng)8 000×g離心收集后用不含磷的無菌人工海水洗滌，然后再離心收集并分別轉(zhuǎn)接至200 mL磷酸鹽初始濃度為0.15、10.00、20.00、35.00μmol·L－1的f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。藻細(xì)胞初始密度為30×106個(gè)·L－1，培養(yǎng)條件與前面一致。實(shí)驗(yàn)過程中不再添加任何營養(yǎng)物質(zhì)。于第0、1、2、4、7天取樣測定細(xì)胞濃度、磷酸鹽濃度、APA。

1.2.2 長期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

將達(dá)到指數(shù)生長期的藻細(xì)胞經(jīng)8 000×g離心收集后用不含磷的無菌人工海水洗滌，然后再離心收集轉(zhuǎn)接至200 mL磷酸鹽濃度為35.00 μmol·L－1的f/2培養(yǎng)基中培養(yǎng)，時(shí)長55 d。藻細(xì)胞初始密度約為5×106個(gè)·L－1，設(shè)置3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)過程中不再添加任何營養(yǎng)物質(zhì)。每隔5 d測定細(xì)胞濃度、磷酸鹽濃度、APA、光合作用參數(shù)。

1.3 比生長速率及葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

取0.9 mL藻液加入0.1 mL魯戈氏液固定，使用光學(xué)顯微鏡（BX43，Olympus，Japan），取0.1 mL樣品置于浮游植物計(jì)數(shù)框計(jì)數(shù)。蟲黃藻比生長速率（μ）按式（1）計(jì)算。

式（1）中，μ為連續(xù)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)的比生長速率，N1及N2分別為培養(yǎng)時(shí)間t1和t2時(shí)的蟲黃藻細(xì)胞密度。

使用浮游植物熒光分析儀（PHYTO-PAMED，Walz，Effeltrich，Germany）測定葉綠素a含量和實(shí)際光化學(xué)量子效率（Fq′/Fm′），參數(shù)測定時(shí)光化學(xué)設(shè)置參見SHEN等［11］。

1.4 磷酸鹽濃度及APA檢測

磷酸鹽濃度采用磷鉬藍(lán)顯色法用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測［12］。APA測定參照OU等［13］測定方法。

1.5 數(shù)據(jù)處理

磷酸鹽初始濃度以實(shí)際測量值為準(zhǔn)（圖1）。數(shù)據(jù)以3次重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）表示。數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)化分布（Shapiro-Wilk）和方差齊性檢驗(yàn)（Levene），通過單因素方差分析（one-way ANOVA），采用Tukey HSD事后多重比較法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)之間的差異（P＜0.05）。所有數(shù)據(jù)使用Excel 2010和PASW Statistics 19.0軟件進(jìn)行分析，繪圖使用OriginPro 2018 v9.5.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 短期培養(yǎng)下不同磷酸鹽濃度對蟲黃藻生長及APA的影響

對培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)初始濃度為35.00μmol·L－1時(shí)，磷酸鹽濃度在培養(yǎng)初期（0～2 d）即呈下降趨勢，且第2天后下降幅度顯著增加（圖1-A）。當(dāng)初始濃度為10.00、20.00μmol·L－1時(shí)，在第0～2天磷酸鹽濃度降低不顯著，第2天后開始顯著下降。當(dāng)磷酸鹽初始濃度為0.15μmol·L－1時(shí)，盡管起始濃度較低，但磷酸鹽濃度在1 d后下降至0.05μmol·L－1，隨后無顯著變化（P＞0.05）。

培養(yǎng)過程中，4個(gè)試驗(yàn)組中藻細(xì)胞的APA變化趨勢存在差異（圖1-B），主要為低磷酸鹽初始濃度（0.15μmol·L－1）的試驗(yàn)組與其他3組變化趨勢不同。磷酸鹽初始濃度為10.00、20.00、35.00μmol·L－1的試驗(yàn)組APA均呈總體下降趨勢，不同的是前兩個(gè)試驗(yàn)組APA在接種后第1天出現(xiàn)了一定程度的降低，隨后上升，第2天后開始趨于穩(wěn)定。而磷酸鹽初始濃度為0.15μmol·L－1的試驗(yàn)組藻細(xì)胞中APA前期顯著上升，第2天達(dá)最大后緩慢下降，至第4天趨于穩(wěn)定。整個(gè)培養(yǎng)過程中，磷酸鹽初始濃度為10.00、20.00、35.00μmol·L－1的試驗(yàn)組中藻細(xì)胞的APA顯著低于濃度0.15μmol·L－1的試驗(yàn)組（P＜0.05），表明其與環(huán)境中無機(jī)磷濃度呈負(fù)相關(guān)［14］。由此可見，低無機(jī)磷條件可誘導(dǎo)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）活性增強(qiáng)。

由圖1-C可知，接種后到2 d時(shí)，各試驗(yàn)組藻細(xì)胞密度增長緩慢或呈下降趨勢，表現(xiàn)出了至少兩天的生長遲滯期，這與其他甲藻相似［15－16］。之后，除磷酸鹽初始濃度為0.15μmol·L－1的試驗(yàn)組外，其他試驗(yàn)組藻細(xì)胞在2 d后的生長趨勢較一致，即細(xì)胞密度在培養(yǎng)后期仍呈現(xiàn)增長的趨勢。培養(yǎng)至第7天，藻細(xì)胞密度因磷酸鹽初始濃度不同而出現(xiàn)差異，具體表現(xiàn)為：磷酸鹽初始濃度為35.00μmol·L－1時(shí)，藻細(xì)胞密度最高，且顯著高于其他組（P＜0.05）；初始濃度為10.00 μmol·L－1和20.00μmol·L－1時(shí)，藻細(xì)胞密度次之，且兩組間無顯著差異（P＞0.05）；磷酸鹽初始濃度為0.15μmol·L－1時(shí)，藻細(xì)胞密度最低，僅為最高試驗(yàn)組細(xì)胞密度的1/3。

圖1 不同磷酸鹽初始濃度處理下培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度（A）和蟲黃藻細(xì)胞APA（B）藻細(xì)胞密度（C）的變化Fig.1 Effects of different initial concentrations of phosphate treatment on the phosphate concentration in the medium（A），APA of alga（B）and cell density of Symbiodinium sp.（C）

2.2 長期培養(yǎng)下不同高磷酸鹽初始濃度對蟲黃藻生長的影響

當(dāng)磷酸鹽初始濃度為35.00μmol·L－1時(shí)，培養(yǎng)基中細(xì)胞濃度開始迅速增加，第20天達(dá)最高，為2.34×108個(gè)·L－1，此后出現(xiàn)波動(dòng)式下降（圖2-A）。而比生長速率在培養(yǎng)前5 d處于較高水平，之后有所下降，20 d后比生長速率常出現(xiàn)負(fù)值，與生長變化相符（圖2-B）。藻細(xì)胞葉綠素a含量在前15 d呈指數(shù)上升，第15天達(dá)最大值，為3 034.27μg·L－1，隨后開始下降，第40天后基本保持穩(wěn)定，為807.71～873.23μg·L－1（圖2-C）。對藻細(xì)胞的Fq′/Fm′分析結(jié)果顯示，F(xiàn)q′/Fm′在培養(yǎng)前5 d升高，隨后顯著下降，第25天后變化趨勢出現(xiàn)改變，呈波動(dòng)下降狀態(tài)（圖2-D）。

圖2 不同高磷酸鹽初始濃度長期培養(yǎng)下蟲黃藻細(xì)胞生長及光合作用特征變化情況Fig.2 Changes of cell growth and photosynthetic characteristics of Symbiodinium sp.cultured with long-term high initial phosphate concentration

2.3 長期培養(yǎng)下培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度及藻細(xì)胞APA的變化

長期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度迅速下降，第5天時(shí)降到0.04μmol·L－1，隨后一直處于較低水平，并呈現(xiàn)出小幅波動(dòng)，為0.04～0.53μmol·L－1（圖3-A）。藻細(xì)胞APA在培養(yǎng)前期維持在較低的水平，第20天顯著增加，至第30天時(shí)APA增加到最大，隨后呈現(xiàn)下降-上升的波動(dòng)趨勢（圖3-B）。分析發(fā)現(xiàn)20～55 d時(shí)藻細(xì)胞APA與數(shù)量的變化趨勢相反，推測藻細(xì)胞數(shù)量下降后的再次上升是由于藻細(xì)胞衰亡釋放有機(jī)磷為AP提供底物，使得藻細(xì)胞重新獲得無機(jī)磷而得以增殖。

圖3 不同高磷酸鹽初始濃度長期培養(yǎng)下培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度（A）和藻細(xì)胞APA（B）的變化Fig.3 Changes of DIP in the culture media of Symbiodinium sp.（A）and APA of microalgal cells（B）with long-term high initial phosphate concentration

3 討論

磷作為藻類生長所必須的營養(yǎng)物質(zhì)，在合成核苷酸、磷脂以及通過磷酸化調(diào)控蛋白質(zhì)的功能中起重要作用，是浮游植物生長的重要營養(yǎng)元素之一［17］。浮游蟲黃藻的細(xì)胞數(shù)量在高磷酸鹽初始濃度（35.00μmol·L－1）下顯著高于其他組，表明營養(yǎng)水平的提高促進(jìn)了該藻的生長。然而，對共生蟲黃藻的研究表明，單獨(dú)增加磷酸鹽濃度對共生體中蟲黃藻的密度無影響［18］；或在高磷酸鹽初始濃度（30.00μmol·L－1）環(huán)境下，共生體中蟲黃藻密度會(huì)隨著磷酸鹽濃度的提高而降低［5］。導(dǎo)致浮游蟲黃藻和共生蟲黃藻存在差異的原因可能是共生蟲黃藻生活的直接環(huán)境是共生體膜泡結(jié)構(gòu)，營養(yǎng)鹽為蟲黃藻吸收利用需穿過兩層膜，因此藻細(xì)胞可利用的磷酸鹽濃度較低，且宿主有能力限制共生蟲黃藻對磷酸鹽的吸收［8，19］。LIU等［9］比 較 了 高 磷 酸 鹽 初 始 濃 度（36.00μmol·L－1）和無磷酸鹽（＜0.01μmol·L－1）培養(yǎng)條件下離體蟲黃藻（Symbiodinium voratum）的生長特征，本研究與其結(jié)果一致，即藻細(xì)胞數(shù)量與環(huán)境中的磷酸鹽濃度呈正相關(guān)關(guān)系，表明共生蟲黃藻在離開宿主后對磷酸鹽的吸收能力與浮游蟲黃藻相似。

在高磷酸鹽初始濃度的長期培養(yǎng)過程中，隨著培養(yǎng)基中磷酸鹽的迅速消耗，浮游蟲黃藻細(xì)胞Fq′/Fm′顯著下降并伴隨著比生長速率下降，這是由于磷酸鹽缺乏會(huì)破壞藻類類囊體膜，從而降低細(xì)胞的光合效率影響藻類的生長［20］。藻細(xì)胞的密度比葉綠素a出現(xiàn)5 d的滯后下降趨勢，表明在磷酸鹽大量消耗后藻細(xì)胞呈現(xiàn)出衰敗態(tài)勢，雖然細(xì)胞數(shù)量增加但逐漸衰老的細(xì)胞中葉綠素a含量較正常生長細(xì)胞偏低［21］。此外，藻類的生長與N/P值密切相關(guān)，水體中N/P值過高會(huì)形成的磷限制狀態(tài)［19］。長期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中后期（20 d以后），培養(yǎng)基中N/P均值為340①中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所未發(fā)表數(shù)據(jù)，說明浮游蟲黃藻處于磷限制的生長環(huán)境中［22］。此時(shí)藻細(xì)胞雖呈現(xiàn)出下降-上升的波動(dòng)生長趨勢，但藻細(xì)胞數(shù)量上升時(shí)的比生長速率約為10～20 d的2倍，表明該藻與其他甲藻一樣具有耐低磷特性［23］。

雖然DIP是藻類吸收磷的首選形式，但當(dāng)DIP受到限制時(shí)，細(xì)胞也可利用溶解有機(jī)磷（dissolved organic phosphorus，DOP）和顆粒有機(jī)磷（particulate organic phosphorus，POP）［2，24］。堿性磷酸酶能水解DOP釋放DIP，被認(rèn)為是藻類最常見的DOP利用機(jī)制［14］，其活性與環(huán)境中無機(jī)磷濃度呈負(fù)相關(guān)［25］。當(dāng)磷酸鹽初始濃度為0.15 μmol·L－1時(shí)，浮游蟲黃藻APA顯著高于其他3個(gè)試驗(yàn)組。研究表明，藻類AP的表達(dá)受環(huán)境調(diào)控，一般認(rèn)為當(dāng)外界DIP濃度為0.05～3.70 μmol·L－1時(shí)可誘導(dǎo)APA增強(qiáng)［26］。在長期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)培養(yǎng)基中磷酸鹽濃度下降至0.04 μmol·L－1后，浮游蟲黃藻細(xì)胞APA并未立即升高（圖3），這是由于藻細(xì)胞APA還受細(xì)胞內(nèi)磷含量的調(diào)控。在環(huán)境磷酸鹽豐富的情況下，甲藻具有過量攝取磷并儲(chǔ)存于細(xì)胞內(nèi)部的能力，當(dāng)受到磷限制影響時(shí)藻細(xì)胞會(huì)啟用自身磷庫維持生長［27］。此外，該表現(xiàn)與短期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中低磷酸鹽初始濃度組（0.15μmol·L－1）的不同，可推測短期培養(yǎng)接種時(shí)細(xì)胞磷庫狀態(tài)處于較低水平。當(dāng)然，這需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。值得注意的是，在短期和長期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中AP活性的增強(qiáng)并未引起培養(yǎng)基中DIP濃度升高，可能是因?yàn)锳P水解與DIP的吸收是同時(shí)進(jìn)行的，這與東海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）對有機(jī)磷的利用形式相似，而與米氏凱倫藻（Karenia mikimotoi）相反［28－29］。目前，關(guān)于甲藻對磷的利用機(jī)制的研究頗多，但不同種類間具有較大差異［23］。浮游蟲黃藻是對珊瑚礁系統(tǒng)具有重要生態(tài)意義的種類，其對磷的利用途徑及在分子層面的機(jī)理解析將是今后需要重點(diǎn)研究的方向。