龔 麗，米紫玥，孔玉潔，徐海霞，田 力，劉 忠

作者單位：1安徽醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，合肥 2300322中國醫(yī)學科學院/北京協(xié)和醫(yī)學院輸血研究所，成都 6100523中國醫(yī)學科學院輸血不良反應(yīng)研究重點實驗室，成都 610052

血小板在保存期間可發(fā)生儲存損傷(platelet storage lesion，PSL)[1]，分泌細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)。EVs數(shù)量隨血小板保存時間延長而增加[2]。EVs已被證明具有促凝和促炎活性[3]，參與類風濕性關(guān)節(jié)炎和動脈粥樣硬化等血栓并發(fā)癥[4]。血小板EVs主要包括兩類：外泌體、微囊泡[5]。外泌體、微囊泡均為雙層膜結(jié)構(gòu)，粒徑大小分別為30 ～ 150 nm，100 ～ 1 000 nm[6]。外泌體攜帶有豐富的蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)[7]。近年來，研究者們關(guān)注于外泌體在各種生理病理狀態(tài)下生物活性物質(zhì)的變化及可能的影響機制，而對于隨著血小板保存時間延長，外泌體濃度變化及其對凝血功能的影響的研究較少，血小板保存期間產(chǎn)生的外泌體是否參與EVs的促凝作用有待研究。因此，該研究著重探討手工血小板中外泌體濃度與保存時間的關(guān)系，并在此基礎(chǔ)上探究其對凝血功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料手工血小板，來自四川省德陽市中心血站。

1.2 儀器與試劑超速離心機(Beckman Coulter，美國貝克曼庫爾特公司)；納米流式分析儀(福流，成都智予醫(yī)學檢驗有限公司)；透射電子顯微鏡(FEI TecnaiTMG 2 Spirit，捷克FEI公司)；化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(CLINX ChemiScope 3000 mini，上海勤翔科學儀器有限公司)；全自動凝血分析儀(Sysmex CS-2000 i，成都協(xié)和生物技術(shù)有限責任公司)；血栓彈力圖儀(CFMS LEPU-8800，北京樂普醫(yī)療科技有限責任公司)；化學發(fā)光成像分析儀(ImageQuantTMLAS 4000，美國通用電氣醫(yī)療公司)；單克隆兔抗人CD 9抗體、多克隆鼠抗人TSG 101抗體、鈣聯(lián)蛋白Calnexin抗體、羊抗兔IgG抗體、羊抗鼠IgG抗體(Abcam，英國)；PT檢測試劑盒、APTT檢測試劑盒(Simens，德國)；血栓彈力圖檢測試劑盒(樂普，北京)；多克隆兔抗人F 7抗體、單克隆鼠抗人β-actin抗體(美國Proteintech公司)；5% BSA封閉液(Solarbio，北京)。

1.3 方法

1.3.1樣本采集 先后分別取10人份、5人份手工血小板(每人份約50 ml)，分別置于血小板常溫[(22±2)℃]震蕩保存箱中保存0(采集當天)、3、5 d(D 0、D 3、D 5)后在無菌條件下從血小板樣本中取15 ml。血小板樣本以5 480 r/min離心10 min，去除大部分血小板。取上清液至離心管中，-80 ℃保存。

1.3.2外泌體提取 血小板上清液4 ℃解凍后經(jīng)1 380 r/min離心10 min，再經(jīng)3 580 r/min離心10 min后吸取上清液，7 750 r/min離心30 min，去除大細胞碎片及微囊泡。吸取上清液至超速離心管中，使用0.45 μm濾膜進行過濾以去除小細胞碎片及微囊泡。使用超速離心機4 ℃下40 000 r/min離心1 h 30 min，保留沉淀，再加入一定量無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)，4 ℃下40 000 r/min離心1 h 30 min 進行洗滌[8]。用200 μl無菌PBS重懸沉淀，-80 ℃凍存。

1.3.3外泌體的鑒定

1.3.3.1Western blot外泌體免疫標志物的鑒定 經(jīng)RIPA 裂解后，吸取外泌體蛋白質(zhì)溶液于EP管中，加入上樣緩沖液(Loading buffer)，98 ℃ 5 min金屬浴進行蛋白變性，4 ℃下12 000 r/min離心5 min。以10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，使用濕式轉(zhuǎn)膜裝置進行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜；采用5%脫脂奶粉TBST封閉液對PVDF膜室溫下封閉1 h；于封閉液稀釋的一抗TSG 101(1 ∶1 000)、CD 9(1 ∶1 000)以及陰性對照蛋白標志物Calnexin(1:1 000)中4 ℃孵育過夜；1×TBST 充分洗膜后，于封閉液稀釋的相應(yīng)二抗(1 ∶5 000)中室溫孵育1 h，1× TBST充分洗膜。加入化學發(fā)光工作液反應(yīng)5 min，采用CLINX化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進行曝光、顯影。同時以Hela細胞裂解液作為對照樣品。

1.3.3.2透射電鏡鑒定外泌體形態(tài) 吸取外泌體樣本10 μl滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min，濾紙吸去殘液。吸取10 μl磷鎢酸滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min，濾紙吸去殘液。常溫下干燥幾分鐘。于100 KV下進行電鏡檢測成像。

1.3.3.3外泌體粒徑大小的鑒定 吸取外泌體懸液于EP管中，按一定比例加入PBS進行稀釋后，充分混勻。按照納米流式儀器操作說明設(shè)置檢測參數(shù)，進行測量分析。

1.3.4不同保存時間血小板中外泌體對凝血功能的影響

1.3.4.1外泌體對血漿凝血功能的影響 取10 ml全血于枸櫞酸鹽抗凝管中(全血與枸櫞酸鹽的比例為9 ∶1)，室溫下靜置5 min，水平離心機中 4 000 r/min 離心15 min，取180 μl離心后上層血漿于若干EP管中，分別向其中加入20 μl D 0、D 5血小板外泌體樣本。同時，向180 μl新鮮血漿中加入20 μl無菌PBS作為對照組。室溫下孵育30 min后使用全自動凝血儀檢測加入外泌體、PBS后血漿的血漿凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)指標，以秒(s)為單位。共采集5份不同健康人新鮮全血，以避免個體差異影響。其中每2份外泌體樣本使用同一份血漿。

1.3.4.2外泌體中凝血因子VII定量檢測 使用含有1% PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液分別對50 μl D 0、D 5外泌體進行蛋白裂解，加入Loading buffer，98 ℃金屬浴5 min，4 ℃下12 000 r/min離心5 min。以10% SDS-PAGE電泳分離蛋白，濕式轉(zhuǎn)膜裝置進行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜；按照蛋白Maker條帶說明書將PVDF膜剪開；使用5% BSA封閉液對PVDF膜室溫下封閉1 h；于封閉液稀釋的一抗F 7(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶10 000)中4 ℃孵育過夜；1×TBST充分洗膜后，于封閉液稀釋的相應(yīng)二抗(1 ∶10 000)中室溫孵育1 h，經(jīng)1×TBST充分洗膜后加入化學發(fā)光工作液反應(yīng)5 min，采用ImageQuant化學發(fā)光成像分析儀進行顯影。使用ImageJ軟件對其進行半定量分析。

1.3.4.3外泌體對全血凝血功能的影響 靜脈采集五份不同健康人新鮮全血至枸櫞酸鈉的抗凝管中，顛倒混勻。取50 μl PBS及D 0、D 5外泌體樣本分別加至1 ml新鮮全血中，室溫下孵育1 h。在血栓彈力圖儀的通道上裝載普通杯，取上述含有外泌體、PBS的全血1 ml至試劑1瓶中，顛倒使之充分混勻，室溫下靜置4 min以激活血液，取340 μl試劑1瓶中血液至盛有20 μl試劑2的普通杯中。按照操作說明書使用血栓彈力圖儀進行各樣本的凝血時間(blood clotting time，R)、凝血速率(clotting rate，α角)、血塊形成時間(clot formation time，K)、血塊強度(clot intensity，MA)、凝血綜合指數(shù)(blood clotting index，CI)等指標的檢測。

圖1 血小板外泌體鑒定 ×10 000

2 結(jié)果

2.1 血小板外泌體的鑒定血小板中外泌體經(jīng)Western blot法鑒定顯示，特異性免疫學標志物TSG 101和CD 9在外泌體中出現(xiàn)富集，而非特異性免疫學標志物Calnexin蛋白則在外泌體中未檢出(圖1A)。透射電鏡分析顯示為雙層膜結(jié)構(gòu)、類杯狀外形(圖1B)。納米流式粒徑分析表明血小板中外泌體粒徑分布集中于60～80 nm，符合外泌體顆粒大小(圖1C)。

2.2 血小板外泌體濃度隨保存時間的變化納米流式結(jié)果顯示(表1、圖 2)，保存D 0、D 3、D 5血小板中外泌體顆粒濃度不同，分別為(13.86±7.93)×1012、(23.69±12.80)×1012、(45.81±25.87)×1012個/L。外泌體濃度隨保存時間延長而增加，且不同保存時間的外泌體濃度差異有統(tǒng)計學意義；D 3外泌體濃度為D 0的1.8倍(P<0.01)，D 5外泌體的顆粒濃度為D 0的4.0倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。D 5外泌體濃度約為D 3的2.2倍(P<0.05)。

2.3 不同保存時間血小板中外泌體對凝血功能的影響

2.3.1血小板中外泌體對血漿凝血功能的影響 不同保存時間血小板外泌體對凝血功能的影響結(jié)果如表2所示。與對照組相比，D 0與D 5組外泌體分別可使PT減小，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01、P<0.001)；同時，與對照組相比，D 0與D 5組外泌體分別使APTT減小，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05、P<0.001)。

表1 不同保存時間手工血小板外泌體濃度

圖2 血小板中外泌體濃度隨保存時間的變化

2.3.2血小板外泌體中凝血因子VII的定量檢測 Western blot實驗結(jié)果顯示凝血因子VII在血小板保存0 d與5 d所分泌的外泌體中表達量存在差異。進一步通過半定量軟件ImageJ檢測各條帶灰度值驗證了該結(jié)果，相較于D 0，D 5組VII因子含量是D 0組的1.4倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)。

表2 不同保存時間血小板外泌體對PT、APTT的影響

表3 不同保存時間血小板外泌體的凝血作用

圖3 血小板外泌體中凝血因子VII表達差異

2.3.3血小板中外泌體對全血凝血功能的影響 D 5與D 0血小板外泌體對新鮮全血凝血指標的影響見表3。凝血時間R值提示凝血因子活性，與PBS組、D 0組相比，D 5組外泌體使全血凝血時間降低，差異有統(tǒng)計學意義[(t=3.21，P<0.05)、(t=2.82，P<0.05)]，表明外泌體樣本具有促凝作用；與PBS組相比，D 0、D 5組外泌體可使K值減小，α角增大，CI指數(shù)升高，但差異無統(tǒng)計學意義。與PBS、D 0組相比，D5組外泌體樣本可使血液中MA值變大，但差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

已有相關(guān)文獻[9]證明血小板制備與保存過程中高離心力、劇烈震蕩、產(chǎn)生的激動劑(二磷酸腺苷、凝血酶)、低溫(4 ℃)、堿性環(huán)境(pH >7.6)及酸性環(huán)境(pH<6.2)等因素都可使血小板發(fā)生活化，導(dǎo)致血小板EVs增加。微囊泡與外泌體作為血小板EVs兩種主要組成成分，Gao et al[10]研究了常溫震蕩保存條件下單采血小板中微囊泡的變化，結(jié)果顯示保存5 d時微囊泡含量是保存1 d時的3倍。而在本研究中則檢測了常溫震蕩保存手工血小板時其外泌體隨時間的變化，結(jié)果顯示外泌體隨著保存時間延長也呈增加趨勢，與上述文獻報道一致。

Sinauridze et al[11]研究顯示血小板EVs促凝活性為活化血小板的50～100倍，其認為這不僅歸因于促凝血磷脂的表面暴露，促凝血蛋白受體的密度增加也放大了促凝活性。研究[12]指出創(chuàng)傷導(dǎo)致的凝血障礙(trauma-induced coagulopathy，TIC)患者存活率降低時血小板EVs下降，Lopez et al[13]通過向出血大鼠模型輸注血小板EVs證明其在體內(nèi)發(fā)揮了促凝和改善酸中毒的作用。上述研究均未將微囊泡與外泌體分離，故無法明確二者作用大小。外泌體作為EVs重要組成部分，對其凝血功能的單獨研究較少。在本研究中，通過比較保存D 0與D 5血小板中外泌體對血漿的凝血作用顯示兩組PT、APTT與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義，血小板保存期間產(chǎn)生的外泌體可能通過內(nèi)、外源性凝血途徑發(fā)揮促凝作用。進一步檢測兩組血小板外泌體對全血凝血功能的影響，結(jié)果顯示R值減小，提示凝血酶生成時間縮短，D 0與D 5外泌體中凝血因子活性存在差異。盡管兩組的K值、α角、MA等數(shù)值上存在差異，但P值顯示差異無統(tǒng)計學意義，可能是樣本量不足的原因。盡管外泌體與微囊泡均含有血小板來源蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、RNA等成分，但這些生物活性物質(zhì)在外泌體與微囊泡上的表達并不一致。文獻[14]已證明促凝物質(zhì)PS在外泌體中不表達，外泌體可能存在與微囊泡相同的Va、Xa等各種凝血因子成分參與促凝作用。

本課題前期進行了不同保存時間血小板中外泌體蛋白譜學的研究，結(jié)果顯示凝血因子VII在保存5天血小板外泌體中表達上調(diào)，因此對其進行定量檢測以分析因子VII在促凝反應(yīng)中的作用，結(jié)果顯示因子VII在D 5組外泌體中含量是D 0組的1.4倍，因此可以推測血小板在保存過程中分泌的外泌體可富集因子VII發(fā)揮促凝作用。因子III與VIIa形成復(fù)合物后促進因子Xa形成，導(dǎo)致凝血酶生成。這些凝血酶可促進內(nèi)源性凝血途徑中凝血酶的生成。因子VII還可直接使因子IX裂解為IXa，從而進一步擴大內(nèi)源性凝血途徑的作用。因此，血小板保存過程中產(chǎn)生的外泌體發(fā)揮促凝作用，可能是由凝血因子VII參與內(nèi)、外源性凝血途徑介導(dǎo)的。此外，外泌體中富含的非編碼RNA等生物活性物質(zhì)可能也對其凝血作用產(chǎn)生調(diào)控作用。外泌體含量隨著血小板保存時間的延長而增加，脂質(zhì)在外泌體中不斷積累[15]，某些脂質(zhì)成分也有可能導(dǎo)致其凝血作用增強。外泌體可能通過凝血因子、脂質(zhì)、RNA等多種物質(zhì)同時調(diào)節(jié)促凝作用，因此，對于血小板外泌體中調(diào)節(jié)促凝功能的某種或多種生物活性物質(zhì)仍需進一步探究。