吳 偉，程 龍，王 杰，楊傳蕾，尚玉強

作者單位：華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院心臟大血管外科，武漢 430000

血管鈣化(vascular calcification，VC)是動脈粥樣硬化、慢性腎病、糖尿病、高血壓、絕經(jīng)后綜合征、動脈狹窄和老年患者的常見病理表現(xiàn)[1]。VC的病理異常是導致心血管發(fā)病率和病死率高的重要因素之一[2-3]。骨保護素(osteoprotegerin，OPG)為腫瘤壞死因子受體超家族的成員之一，主要作用是抑制破骨細胞形成，促進破骨細胞調亡，細胞核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL)能夠與破骨細胞表面的RANK結合，促進破骨細胞前體分化和活化形成成熟的破骨細胞[4-5]。大量的研究表明VC主要表現(xiàn)為血管平滑肌(vascular smooth muscle cell，VSMC)發(fā)生向成骨細胞的表型轉化過程，目前的研究[6-7]認為OPG/RANKL/RANK在血管壁平滑肌細胞收縮表型向成骨表型轉化中發(fā)揮了重要作用。結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)是一種由349個氨基酸組成，分子量為34～38 ku的富含半胱氨酸的分泌肽。有研究[8]表明，CTGF可促進成骨細胞OPG分泌，并抑制RANKL的表達，提示CTGF可能間接抑制成熟破骨細胞活化的作用。但是CTGF是否在血管鈣化過程中能夠通過調控OPG/RANK/RANKL信號通路來影響疾病發(fā)生的進展需要進一步的研究。因此，該研究通過沉默細胞中CTGF基因，構建體外血管鈣化模型，驗證血管鈣化過程中CTGF對OPG/RANK/RANKL信號通路的調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器大鼠胸大動脈平滑肌A7r5來源于中國科學院上海細胞庫；胎牛血清購自天津TBD公司；Opti-MEM和DMEM購自美國Gibco公司；CaCl2和10 mmol/L β-甘油磷酸鹽購自美國sigma公司；LipofectamineTMRNAiMAX購自美國Invitrogen公司；茜素紅法鈣質染色試劑盒購自上海歌凡生物技術有限公司；Boldine和AR234960購自美國MCE公司；堿性磷酸酶測定試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；TRIzol試劑購自美國Ambion公司。SYBR FAST qPCR Master Mix購自美國KAPA Biosystems公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京solarbio公司；LBS#111112100 CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國LabServTM公司；BM-38XD倒置熒光顯微鏡購自上海析域儀器設備有限公司；CFX-Connect 96熒光定量PCR 儀購自美國Bio-Rad公司；AMR-100酶標儀購自杭州奧盛儀器有限公司；Tanon-5200全自動化學發(fā)光分析儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)將凍存的A7r5細胞從液氮罐中取出，在37 ℃水浴中完全融化后，將細胞懸液吸至離心管中，加入4 ml完全培養(yǎng)基(90%DMEM+10%FBS)，1 337 r/min離心3 min，棄上清液，細胞重新懸浮于1 ml培養(yǎng)基中，轉移至培養(yǎng)瓶中，加入4 ml完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 細胞轉染檢測轉染前24 h，將5×105個細胞重懸于1.5 ml完全培養(yǎng)基中。分別取100 pmol siRNA和5 μl Lipofectamine?RNAiMAX稀釋于250 μl Opti-MEM中，輕輕吹吸5次混勻，室溫下靜置5 min。兩種稀釋液混勻后室溫孵育20 min。將500 μl混合物加到含有細胞和1.5 ml新鮮完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)板中，最后將細胞板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，轉染4 h后換新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。采用RT-PCR和Western blot檢測轉入基因CTGF的表達情況。

1.4 細胞鈣化模型構建及分組收集A7r5細胞，調整細胞懸液濃度為1×105個/ml，將1 ml細胞懸液加入12孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁。鈣化培養(yǎng)基[DMEM+10 mmol/L β-甘油磷酸鹽(BGP)+3 mmol /L CaCl2]誘導A7r5細胞鈣化，誘導0、12、24、48、72 h。取出細胞培養(yǎng)板進行后續(xù)檢測。為了驗證CTGF在主動脈血管鈣化中的作用，將實驗分為7組。對照組：不進行任何處理；模型組：A7r5細胞誘導鈣化；AR234960激動劑組：A7r5細胞誘導鈣化后，AR234960激動劑(10 μmol/L，12 h)處理；CTGF-siRNA組：A7r5細胞誘導鈣化后，CTGF-siRNA轉染處理；siRNA-NC組：A7r5細胞誘導鈣化后，siRNA-NC轉染處理；Boldine抑制劑組：A7r5細胞誘導鈣化后，Boldine抑制劑(80 μmol/L，12 h)處理；Boldine+AR234960組：VSMC細胞誘導鈣化后，先進行Boldine(80 μmol/L，12 h)抑制劑處理，再進行AR234960激動劑(10 μmol/L，12 h)處理。

1.5 茜素紅染色將12孔板中的A7r5細胞干預后棄去上清液，各組細胞用PBS洗3次。用4%多聚甲醛固定30 min后吸去4%多聚甲醛溶液。加入2 ml茜素紅染液，室溫染色30 min，蒸餾水速洗。在倒置熒光顯微鏡下觀察染色效果并拍照。

1.6 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測將12孔板中的A7r5細胞干預后棄去上清液，設定空白管、標準管和測定管?？瞻坠芗尤?.03 ml雙蒸水，測定管中加入0.03 ml樣本，標準管加入0.03 ml標準液；每管加入0.5 ml緩沖液和0.5 ml基質液，充分混勻，37 ℃水浴15 min后加入1.5 ml顯色液；在520 nm的波長下測各管吸光度。

1.7 熒光定量qRT-PCR取1 ml的TRIzol加入細胞培養(yǎng)板中提取總RNA，然后將RNA逆轉錄為cDNA，最后將制備好的cDNA進行PCR擴增，反應程序為：預變性95 ℃、3 min；95 ℃、5 s，56 ℃、10 s，72 ℃、25 s(40 cycles)，記錄數(shù)據(jù)，實驗重復3次。采用2-ΔΔt計算mRNA的相對含量。PCR引物由武漢天一華煜基因科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 Western blot提取各組細胞的蛋白，采用BCA試劑盒測定蛋白質的含量。20 μg蛋白加入凝膠中(配制12%的分離膠和5%的濃縮膠)，濃縮膠恒壓80 V 40 min,分離膠恒壓120 V 50 min。恒壓90 V轉膜50 min，5 %脫脂奶粉室溫封閉 4 ℃過夜，加入一抗(CTGF 1 ∶500；GAPDH 1 ∶1 000)室溫孵育1 h，洗膜后二抗(Goat anti-Rabbit IgG 1 ∶10 000)室溫孵育1 h。加入ECL發(fā)光液后置于全自動化學發(fā)光分析儀中顯色。實驗重復3次。

2 結果

2.1 細胞鈣化模型構建茜素紅染色結果顯示如圖1，鈣化模型誘導12 h后能夠看到少量橘紅色的鈣化結節(jié)(圖中細胞外的紅色可能是由于細胞鈣化時添加的CaCl2未清洗干凈造成的)，鈣化模型誘導時間為48 h時，鈣化結節(jié)增多，而誘導時間為72 h時，鈣化誘導過度，產(chǎn)生的鈣化結節(jié)過多。因此鈣化模型誘導的最佳時間為48 h。

2.2 轉染后細胞中CTGF表達水平檢測結果轉染CTGF-siRNA表達質粒后，與對照組比較，陰性對照組A7r5細胞中CTGF相對表達量差異無統(tǒng)計學意義，CTGF-siRNA-1、，CTGF-siRNA-2和CTGF-siRNA-3組A7r5細胞中CTGF相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，結果如表2。結果表明轉染siRNA表達質粒后能有效降低CTGF的表達量。

圖1 A7r5細胞的鈣化表達情況 茜素紅×200

圖2 CTGF-siRNA對細胞鈣化的影響 茜素紅×200

表2 CTGF-siRNA和Western blot檢測轉染后細胞中CTGF的表達水平(n=3)

2.3 CTGF-siRNA對細胞鈣化的影響由圖2可知，與模型組相比，siRNA-NC組鈣化結節(jié)的量基本沒有變化，CTGF-siRNA、AR234960 + Boldine和Boldine抑制組的鈣化結節(jié)減少，AR234960激動劑組的鈣化結節(jié)增多。

2.4 CTGF-siRNA對細胞的ALP活性影響ALP活性測定結果顯示如圖3(F=204.3)，與模型組相比，siRNA-NC組ALP的活性基本沒有變化，CTGF-siRNA組，AR234960+Boldine組和Boldine抑制組的ALP的活性降低(P<0.05)，AR234960激動劑組的ALP的活性升高(P<0.05)。

圖3 A7r5細胞中的ALP活性

2.5 CTGF-siRNA對細胞中OPG、RANK、RANKL表達的影響由表3可知，與模型組相比，siRNA-NC組OPG、RANK、RANKL的表達量基本沒有變化，CTGF-siRNA、AR234960+Boldine和Boldine抑制組的CTGF、RANK、RANKL的表達量降低(P<0.05)，OPG表達量升高(P<0.05)。AR234960激動劑組 CTGF、RANK、RANKL的表達量升高(P<0.05)，OPG表達量降低(P<0.05)。

表3 A7r5細胞中CTGF、OPG、RANK和RANKL的表達水平

3 討論

VC是指在血管中以磷酸鈣復合物的形式沉積的礦物，近年來的研究[9-10]表明，VC與動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病腎病、心肌梗死等多種疾病密切相關，是心血管疾病高發(fā)病率和高病死率的重要原因。隨著我國人口老齡化趨勢的加重和人們生活水平的提高，血管鈣化的發(fā)生率也在逐漸提高，與其相關的許多心血管疾病已嚴重危害到人類的健康。血管鈣化是一種與骨發(fā)育類似的主動的、可預防和可逆轉的高度可調控的生物學過程，因此，研究血管鈣化的發(fā)生、發(fā)展及其發(fā)病機制，為血管鈣化的有效防治具有重要臨床意義。本研究按照已報道的鈣化模型[11]，即采用10 mmol/L β-甘油磷酸鹽(BGP)和3 mmol/L CaCl2誘導A7r5細胞鈣化，證明了沉默CTGF能夠減少A7r5細胞的鈣化。

ALP是一種在堿性條件下能夠分解磷酸二甲苯生成游離的酚和磷酸，廣泛分布于人體骨骼、腸、腎和胎盤等組織。它能夠通過調節(jié)礦化抑制劑PPi的水平來促進血管鈣化，目前已被證明是血管鈣化病理生理焦磷酸途徑中的一個具有促進作用的因子[12]。有研究[13]表明，血清中ALP水平與冠狀動脈鈣化和斑塊易損性具有相關性。并且有研究[14]表明ALP是血清中膠原蛋白鈣化所必需的因子。因此，降低ALP的活性能夠有效預防血管鈣化的發(fā)生，本實驗顯示CTGF-siRNA能夠有效降低ALP的活性。

OPG/RANK/RANKL信號通路在調控成骨細胞形成及骨重建中發(fā)揮重要作用。OPG 通過與 RANKL 結合，阻斷 RANK 與其結合，從而抑制骨吸收，維持骨代謝平衡[15]。課題組在實驗中使用腺病毒轉染A7r5使CTGF基因沉默，顯示RANK、RANKL基因水平降低，OPG基因水平上升，說明沉默CTGF基因能夠通過調節(jié)OPG/RANK/RANKL信號通路從而減輕細胞鈣化程度。同時， Liu et al[16]研究發(fā)現(xiàn)，補腎活血湯能夠通過調節(jié)OPG/RANK/RANKL抑制血管平滑肌的成骨分化，有效防止VSMCs從收縮型到成骨表型的表型轉換過程，進而影響細胞鈣化的形成。為了進一步明確上述猜測，本研究使用OPG/RANK/RANKL信號通路的激動劑(AR234960)和抑制劑(Boldine)干預，測定OPG/RANK/RANKL信號通路對細胞鈣化的影響。本實驗結果顯示，加入AR234960后，RANK和RANKL基因水平上升，OPG基因水平下降，細胞鈣化結節(jié)增多。但加入Boldine后，RANK和RANKL基因水平下降，OPG基因水平上升，細胞鈣化結節(jié)減少，這說明沉默CTGF基因與Boldine有相同的作用，進一步證明了CTGF基因是通過調節(jié)OPG/RANK/RANKL信號通路從而達到抑制細胞鈣化的目的。

綜上所述，本研究成功建立了A7r5細胞的鈣化模型，通過實驗確定沉默CTGF基因能夠減輕血管平滑肌的鈣化程度，降低ALP活性，調控OPG/RANK/RANKL信號通路，從而抑制主動脈血管鈣化的進展，為血管鈣化的治療提供了新的靶點。