李 梅，蔣錦梅，歐大明，黃麗芳，謝立虎，張 濟

作者單位：南華大學衡陽醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 1風濕免疫科、2風濕免疫實驗室，衡陽 421001

類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性炎癥性自身免疫病，臨床病理表現(xiàn)為以類纖維細胞樣化和膜細胞增殖浸潤，可導致滑膜增生和關節(jié)損害[1-2]。有研究[3-4]報道，lncRNA不僅在RA患者外周血或滑膜組織中表達異常，還能參與調(diào)控RA滑膜細胞炎癥、增殖、遷移和侵襲。新的研究[5]顯示，lncRNA CASC2(簡稱CASC2)在RA患者血漿中表達水平較低，且過表達CASC2可促進人RA滑膜成纖維細胞凋亡。同時，也有研究[6]發(fā)現(xiàn)，miR-218-5p在RA患者關節(jié)滑膜組織及骨性關節(jié)炎患者軟骨組織中高表達。但CASC2在RA滑膜組織中的表達情況及其是否可通過靶向調(diào)節(jié)miR-218-5p參與RA進程的調(diào)控，目前還未知。因此，該研究旨在檢測CASC2及miR-218-5p在RA患者滑膜組織中的表達水平，并探討CASC2對RA滑膜成纖維細胞炎癥反應、遷移、侵襲中的影響，以期為RA靶向治療提供新的潛在靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞與試劑 人RA滑膜成纖維細胞系MH7A來源于日本Tsukuba公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自上海TBD公司；CASC2過表達質(zhì)粒(pcDNA3.1-CASC2)及其空載質(zhì)粒(pcDNA3.1-)購自武漢天一輝遠生物公司；miR-218-5p模擬物(mimic)和陰性對照(mimic-NC)購自廣州銳博公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素(interleukin-6，IL-6)和IL-1β試劑盒購自美國Biovalue公司；基質(zhì)膠購自美國Corning公司；CCK-8試劑盒、BCA蛋白質(zhì)檢測試劑盒和雙螢光素酶報告基因試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Lipofectamine 2000試劑盒購自美國Introvigen公司；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser購自日本TaKaRa公司；GoTaq qPCR Master Mix試劑盒購自美國Promega公司； GAPDH抗體、MMP-2抗體、MMP-9抗體購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶(HPR)偶聯(lián)的二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；引物由武漢金凱瑞生物工程有限公司提供。

1.1.2臨床組織標本 45例RA滑膜組織收集于2019年2月—2020年7月在我院進行膝關節(jié)滑膜切除術或膝關節(jié)置換手術的RA患者。同期18例健康滑膜組織取自無急性或慢性關節(jié)異常病史的非RA患者膝關節(jié)組織。所有患者均簽署知情同意書，本研究獲得本院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組 RA滑膜成纖維細胞MH7A用含10%的血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。根據(jù)實驗需要，將細胞MH7A以5×105個細胞/孔鋪在6孔板中，當細胞密度達到70%～80%時，將細胞分為空白對照組(blank)、空載組(Vector，轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒)、CASC2過表達組(CASC2，轉(zhuǎn)染CASC2過表達質(zhì)粒)、CASC2+ mimic-NC組(共轉(zhuǎn)染CASC2過表達質(zhì)粒和mimic-NC)和CASC2+miR-218-5p mimic組(共轉(zhuǎn)染CASC2過表達質(zhì)粒和miR-218-5p mimic)。采用Lipofectamine 2000將CASC2過表達質(zhì)粒、空載質(zhì)粒pcDNA3.1、miR-218-5p mimic及mimic-NC轉(zhuǎn)染至MH7A中，6 h后更換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱48 h。

1.2.2qRT-PCR檢測lncRNA CASC2和miR-218-5p表達 使用TRIzol試劑提取滑膜組織及轉(zhuǎn)染48 h后的MH7A細胞中總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并使用GoTaq qPCR Master Mix試劑盒進行PCR擴增。將10 μl qPCR混合物及每種引物0.5 μl混合均勻，配制成最終的20 μl反應混合物。用于擴增的熱循環(huán)參數(shù)如下：94 ℃變性2 min；94 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 30s，40個循環(huán)；25 ℃ 5 min終止反應，構(gòu)建熔解曲線并在62 ℃和95 ℃之間進行分析，采用2-△△Ct法計算CASC2和miR-218-5p相對于對照基因GAPDH或U6的表達水平。所用qPCR引物參照表1所示。

表1 qPCR引物

1.2.3CCK-8檢測細胞增殖能力 取對數(shù)生長期MH7A細胞，調(diào)整細胞濃度為2×104個/ml，以100 μl/孔接種于96孔板中，放入培養(yǎng)箱中24 h，按照上述方法使用Lipofectamine 2000進行不同分組細胞轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)6 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24、48、72 h。在各個時間點提前4 h每孔加入10 μl CCK-8工作液，置于培養(yǎng)箱4 h后采用酶標儀測定450 nm處的吸光度(optical density, OD)值，以OD值來評判不同分組的細胞增殖情況。

1.2.4ELISA檢測 收集轉(zhuǎn)染后不同分組的MH7A細胞上清液，根據(jù)TNF-α、IL-6和IL-1β試劑盒說明書分別檢測上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平。

1.2.5Transwell檢測細胞遷移、侵襲能力 消化轉(zhuǎn)染后的MH7A細胞，用基礎培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為2.5×105個/ml，以100 μl/孔接種于上室中，下室加入700 μl含10% FBS的完全培養(yǎng)基。置于培養(yǎng)箱中24 h。棄培養(yǎng)基，取出小室用PBS清洗1次，加入固定液固定15 min，再用結(jié)晶紫染色15 min，擦除膜上方未穿過的細胞，晾干后使用顯微鏡觀察遷移細胞情況并拍照記錄。細胞侵襲實驗需要提前在上室中平鋪1mg/ml的基質(zhì)膠，其他實驗步驟同上。

1.2.6Western blot檢測MMP-2和MMP-9蛋白表達 消化收集各組細胞，使用RIPA緩沖液冰上充分裂解30 min，然后以12 000 r/min離心15 min，收集上清液，再使用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白質(zhì)含量。取25 μg蛋白經(jīng)沸水浴變性后，采用SDS-PAGE分離蛋白，再將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(PVDF)膜上，經(jīng)5%脫脂奶室溫封閉2 h，加入MMP-2、MMP-9和GAPDH一抗在4 ℃下孵育過夜。去除抗體，經(jīng)TBST洗滌3次(5 min/次)，將膜與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h，經(jīng)TBST洗滌3次后，滴加ECL顯影液顯色。目的蛋白相對表達量以目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值表示。

1.2.7熒光素酶報告基因驗證miR-218-5p 生物信息學在線軟件ENCORI預測CASC2與miR-218-5p靶向結(jié)合位點。設計并合成含miR-218-5p結(jié)合位點的CASC2野生型(Wt)和突變型(Mut)片段，并將其插入雙熒光素酶報告基因載體，獲得含有CASC2 Wt-3 ′-UTR和Mut-3 ′-UTR重組質(zhì)粒。使用Lipofectamine 2000將miR-218-5p mimic及其陰性對照(mimic NC)與CASC2 Wt-3 ′-UTR或Mut-3 ′-UTR共轉(zhuǎn)染至293T細胞中，48 h后收集細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書分別檢測海腎螢光素酶活性(renilla luciferase，RLU)和螢火蟲螢光素酶活性，相對熒光素酶活性=螢火蟲螢光素酶活性/海腎螢光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 RA患者滑膜組織中CASC2和miR-218-5p表達水平qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，在RA患者滑膜組織中CASC2的表達水平低于健康對照者，而miR-218-5p表達水平則高于健康對照者，差異性均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 CASC2和miR-218-5p在RA患者滑膜組織中表達

2.2 CASC2是miR-218-5p靶基因生物信息學在線軟件ENCORI預測顯示CASC2與miR-218-5p間存在靶向結(jié)合位點(圖2A)。實驗結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-218-5p mimic可以降低CASC2-Wt熒光素酶活性(P<0.05)，而對CASC2-Mut熒光素酶活性無影響(圖2B)。qRT-PCR實驗數(shù)據(jù)(圖3)顯示，與blank組比較，CASC2組細胞中CASC2表達水平升高(P<0.05)，而miR-218-5p表達水平降低(P<0.05)。

2.3 CASC2過表達對MH7A細胞增殖的影響qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，Vector、CASC2、CASC2+mimic-NC、CASC2+miR-218-5p mimic組細胞中miR-218-5p相對表達量分別為(1.01±0.07)、(0.16±0.13)、(0.17±0.11)和(0.77±0.08)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與Vector組比較，CASC2組細胞中miR-218-5p表達水平降低(P<0.05)；與CASC2組比較，CASC2+miR-218-5p mimic組細胞中miR-218-5p表達水平升高(P<0.05)，而CASC2+mimic-NC組差異無統(tǒng)計學意義。CCK-8結(jié)果(如表2)顯示，在24、48、72 h時間點，與Vector組比較，CASC2組細胞增值率降低(P<0.05)；與CASC2組比較，CASC2+miR-218-5p mimic組細胞增值率升高(P<0.05)，而CASC2+mimic-NC組差異無統(tǒng)計學意義。

圖2 CASC2與miR-218-5p在MH7A細胞系中的調(diào)控關系

圖3 各組細胞中CASC2和miR-218-5p表達水平

表2 CASC2過表達對MH7A細胞增殖影響

組別24 h48 h72 hVector0.77±0.061.12±0.031.42±0.03CASC20.41±0.02?0.71±0.05?0.92±0.05?CASC2+ mimic-NC0.43±0.040.71±0.080.93±0.09CASC2+miR-218-5p mimic0.70±0.03#1.00±0.04#1.25±0.03#F值60.08142.21155.142

2.4 CASC2過表達對MH7A細胞炎癥因子分泌的影響ELISA結(jié)果(表3)顯示，與Vector組比較，CASC2組炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平降低(P<0.05)；與CASC2組比較，CASC2+miR-218-5p mimic組炎癥因子水平TNF-α、IL-1β和IL-6升高(P<0.05)，而CASC2+mimic-NC組差異無統(tǒng)計學意義。

表3 CASC2過表達對MH7A炎癥反應的影響(n=3，pg/ml)

2.5 CASC2過表達對MH7A細胞遷移和侵襲的影響如圖4所示，與Vector組比較，CASC2組細胞遷移與侵襲數(shù)量明顯減少(P<0.05)；與CASC2組比較，CASC2+miR-218-5p mimic組細胞遷移與侵襲數(shù)量明顯增加(P<0.05)，而CASC2+mimic-NC組差異無統(tǒng)計學意義。

2.6 CASC2過表達對MH7A細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達水平的影響如圖5所示，與Vector組比較，CASC2組細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與CASC2組比較，CASC2+miR-218-5p mimic組MMP-2和MMP-9蛋白表達水平明顯增加(P<0.05)，而CASC2+mimic-NC組差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

RA是一種侵襲性、慢性自身免疫性疾病。RA滑膜成纖維細胞的異常激活是RA發(fā)生和發(fā)展的關鍵因素，并且RA滑膜成纖維細胞在一定炎性環(huán)境下會表現(xiàn)出類似腫瘤細胞的特性[7]。RA滑膜成纖維細胞能分泌許多炎癥因子、促血管生成的細胞因子和生長因子，促進炎癥發(fā)生和血管增生[8]，最終導致關節(jié)損壞。因此，探究RA發(fā)生的分子機制，尋找可行的分子靶點對RA的治療非常重要。

已有研究[9]證實：lncRNA可作為RA的生物學標志物，參與RA滑膜成纖維細胞增殖、炎癥反應、遷移和侵襲等過程。CASC2在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中扮演著抑癌基因的角色，例如Li et al[10]研究發(fā)現(xiàn)促進CASC2表達可以抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。劉露 等[11]研究報道CASC2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中過表達后可以抑制腫瘤發(fā)展。而關于CASC2在RA中的功能和作用機制的報道有限，并且其在滑膜組織中的表達情況尚未可知。Liu et al[7]研究顯示CASC2在RA患者血漿中表達下調(diào)，且過表達CASC2可促進人RA滑膜成纖維細胞凋亡，其機制可能與下調(diào)IL-17水平相關。Sun et al[12]研究稱，CASC2在OA患者軟骨細胞中表達下調(diào)，其過表達可促進LPS暴露下軟骨細胞的凋亡。由此可見，CASC2可能是治療RA的潛在靶點。本研究顯示RA患者滑膜組織中CASC2的低表達。實驗結(jié)果顯示，過表達CASC2可以抑制MH7A細胞的增殖能力，降低炎癥因子水平，減弱細胞遷移及侵襲能力，下調(diào)MMP-2和MMP-9蛋白表達水平，可見CASC2可以作為治療RA的潛在靶標。

圖4 CASC2過表達對MH7A細胞遷移與侵襲的影響 ×200

圖5 CASC2過表達對MH7A細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響

miR-218-5p在多種腫瘤中發(fā)揮著抑癌的作用，例如Yang et al[13]研究表明，miR-218-5p通過靶向SHMT1抑制肺腺癌的進展。也有研究[14]發(fā)現(xiàn)miR-218-5p會導致癌癥癥狀加劇，miR-218-5p在肺鱗狀細胞癌組織和細胞中低表達，使肌動蛋白、胞外基質(zhì)蛋白表達量增加，促進癌細胞的遷移與侵襲。目前，關于miR-218-5p在RA中作用機制的報道不多，Chen et al[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-218-5p在RA患者關節(jié)滑膜組織高表達，沉默其表達可抑制RA滑膜成纖維細胞的增殖。本研究顯示在RA患者滑膜組織中miR-218-5p高表達，降低其表達可以抑制RA滑膜成纖維細胞MH7A的增殖活性，降低炎癥因子水平，減弱細胞遷移及侵襲能力，下調(diào)MMP-2和MMP-9蛋白表達水平。除此之外，本研究通過雙熒光素酶報告證實CASC2與miR-218-5p之間存在靶向調(diào)控關系，miR-218-5p過表達可逆轉(zhuǎn)CASC2過表達對RA滑膜成纖維細胞MH7A的增殖、炎癥反應、遷移與侵襲的抑制作用。這一研究結(jié)果表明，CASC2靶向miR-218-5p影響細胞MH7A的增殖、炎癥反應、遷移與侵襲。

綜上所述，CASC2在RA患者滑膜組織中低表達，促進其表達可抑制RA滑膜成纖維細胞炎癥反應及遷移與侵襲能力，其作用機制可能與靶向負調(diào)節(jié)miR-218-5p表達相關。這些發(fā)現(xiàn)可以為RA的靶向治療提供參考靶點。