白艷麗 鄭玉峰 田笑笑

胃癌為常見(jiàn)惡性疾病。隨著人們的生活水平的提高，該病的發(fā)病率與死亡率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人們生命健康[1]。日本胃癌協(xié)會(huì)根據(jù)胃彎大小的分點(diǎn)連線，將胃癌分為近端胃癌、中段胃癌、遠(yuǎn)端胃癌，其中近端與遠(yuǎn)端胃癌更常見(jiàn)[2]。多數(shù)胃癌的發(fā)生由多因素導(dǎo)致，如環(huán)境、基因、吸煙、不良飲食習(xí)慣等飲食。但隨著基因擴(kuò)增測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，大量研究表明胃內(nèi)微生態(tài)與胃癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[3]。為此，分析近端、遠(yuǎn)端胃癌患者的胃內(nèi)微生態(tài)結(jié)構(gòu)與多樣性的特征，探尋近端、遠(yuǎn)端胃癌患者胃內(nèi)微生態(tài)特異菌種，為臨床治療提供參考信息，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年7月至2019年12月經(jīng)我院收治的胃癌患者83例，其近端胃癌患者55例，遠(yuǎn)端胃癌患者28例。本文經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)開(kāi)展。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合中華消化雜志《中國(guó)早期胃癌篩查流程專家共識(shí)意見(jiàn)(草案2017年，上海)》中相關(guān)胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為近端、遠(yuǎn)端胃癌者[4]；②無(wú)消化系統(tǒng)疾病或相關(guān)胃癌癥狀史；③無(wú)心血管、內(nèi)分泌、呼吸道等系統(tǒng)性疾病者；④入組前30 d內(nèi)未服用抑酸、微生態(tài)制劑、抗生素等藥物者；⑤患者在知曉研究目的的情況下，自愿加入本研究，簽署同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①呼氣試驗(yàn)結(jié)果顯示為幽門(mén)螺旋桿菌感染為陽(yáng)性者；②有家族腫瘤史。55例近端胃癌患者中，男性39例，女性16例；年齡54～68歲，平均(60.21±6.79)歲；28例遠(yuǎn)端胃癌患者中，男性20例，女性8例；年齡51～66歲，平均(57.23±7.65)歲；兩組患者一般資料(性別、年齡等)比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，有可比性。

1.2 方法

1.2.1 采集樣本及處理 取樣前囑咐患者行胃鏡檢查前8 h禁飲禁食，早晨不可刷牙。將胃鏡頭完全置入胃內(nèi)，用150 mL無(wú)菌生理鹽水沖洗胃壁，再將沖洗液全部吸入無(wú)菌吸引瓶?jī)?nèi)，取出吸引瓶，放入冰盒內(nèi)，將收集好樣本送于實(shí)驗(yàn)室，將樣本在生物安全柜中分為3部分，并做標(biāo)記，將其中2份放入冰箱中保存?zhèn)溆?，另一份待用。采用差速離心和超濾法將樣本細(xì)胞與細(xì)菌分離。將50 mL無(wú)菌離心管裝滿樣本混勻，用4 ℃低溫低速離心機(jī)，離心10 min，除沉淀，在生物安全柜內(nèi)將上清液移入新50 mL離心管內(nèi)，將上清液在5 μm無(wú)菌濾膜上濾過(guò)，僅留濾液，再將濾液濾過(guò)0.22 μm無(wú)菌濾膜，保留濾膜，濾膜上有富集的樣本細(xì)菌，于生物安全柜內(nèi)，用剪刀將處理好后的濾膜剪碎為0.25 cm2碎片，裝入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，便于樣本微生物提取DNA。

1.2.2 DNA提取 用Mo-BIO Power-Soil DNA isolation kit試劑盒提前DNA。將處理后的濾膜碎片用無(wú)菌鑷子放入PowerBead Tubes中混勻，在65 ℃條件下10 min金屬浴后渦旋PowerBead Tubes 2 min；再將70 μL Solution C1加入PowerBead Tubes中，充分混勻后，再渦旋振蕩15 min。將PowerBead Tubes室溫高速離心30 s，移500 μL上清液至2 mL收集管內(nèi)，并加入250 μL Solution C2，振蕩5 s后，在4 ℃條件下孵育5 min，離心1 min，取600 μL上清液于收集管內(nèi)，加入200 μL Solution C3，振蕩5 s后，在4 ℃條件下孵育5 min，離心2 min，取約740 μL上清液至2 ml收集管內(nèi)；加1200 μL Solution C4，振蕩5 s后；將670 μL上述混合液移至Spin Filter中，室溫高速離心1min，去除流過(guò)液，DNA結(jié)合于柱上；再重復(fù)3次DNA上柱步驟，則混合液所有DNA上柱；加500 μL Solution C5至SpinFilter內(nèi)，離心1 min，去除流過(guò)液，再空離心2 min，完全分離SolutionC5；將Spin Filter 置入1.5 mL DNA LoBind tube 上，將30 μL UltraPure DNase/RNase-free ditlledl water加入到SpinFilter白色濾膜中心，孵育2 min后離心1 min，DNA樣本洗脫于DNA Lo-Bind tube 溶液內(nèi)備用。將提取的1 μL樣本基因組DNA經(jīng)Qubit dsDNA HS Assay kits試劑盒處理后，采用Qubit熒光定量?jī)x檢測(cè)其濃度；再取樣本DNA 3 μL，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳，25 min，檢驗(yàn)提取DNA的完整性。

1.2.3 基因擴(kuò)增 將16S rRNA基因V3-V4可變區(qū)視為PCR擴(kuò)增靶標(biāo)。引物：338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')。反應(yīng)體系(30 μL)：PCR MasterMix 15 μL；Primer 3 μL；DNA 10 μL；ddH2O 2 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s；執(zhí)行27個(gè)循環(huán)，72 ℃維持10 min。

1.2.4 高通測(cè)序和生信分析 用Qubit 2.0 DNA Assay Kit對(duì)處理后的DNA進(jìn)行定量的PCR擴(kuò)增，按1∶1混合體積上機(jī)開(kāi)展測(cè)序。在核酸多聚酶作用下對(duì)產(chǎn)物突出端修為鈍端。將3'端腺苷酰作用后的DNA片段與PE頭相連。連接后的產(chǎn)物經(jīng)核酸純化柱、瓊脂電泳進(jìn)行分離，并取其適中段，用illumina 二代測(cè)序系統(tǒng)對(duì)兩端有連接頭的DNA段經(jīng)10循環(huán)PCR開(kāi)展富集，組成為300～400 bp插入小片段庫(kù)，再完成后續(xù)上機(jī)測(cè)序操作。利用系統(tǒng)將圖像轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)，并識(shí)別分析。在Miseq序列標(biāo)記上標(biāo)簽、引物、接頭。用軟件對(duì)引物接頭序列進(jìn)行去除后，根據(jù)具有重疊關(guān)系的PE序列特性，把成雙序列拼為一條完整序列，再對(duì)拼接后的序列進(jìn)行識(shí)別、區(qū)分樣本數(shù)據(jù)，再將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控過(guò)濾留其有效數(shù)據(jù)。在PCR反應(yīng)過(guò)程中，一些不完整的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)循環(huán)擴(kuò)增，與序列相近的同源板一同退火，繼續(xù)延伸得更雜合DNA片段稱為“嵌合體”；同時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增序列。為此，用USEARCH軟件剔除非特異性序列，并校正測(cè)序，檢測(cè)嵌合體。刪除嵌合體后序列可用BLAST法與參考數(shù)據(jù)庫(kù)中有代表性序列對(duì)比。剔除低于閾值的靶區(qū)外序列。

操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units,OTUs)，將所有序列聚類(lèi)后，按照序列與序列的相似性分為不同OTUs。并將相似性閾值設(shè)為97%進(jìn)行分化。用Bergey分類(lèi)法將菌群分為界、門(mén)、綱、目、科、屬水平。

1.2.5 多樣性分析 微生物多樣性通過(guò)單樣本多樣性分析完成，其中常用方法包括Alpha多樣性，α-多樣性，用兩者對(duì)菌落中物種的豐富度與多樣性進(jìn)行分析。校正OTU數(shù)目，評(píng)估菌落的豐富度指數(shù)(包括Chaol、ACE指數(shù))與多樣性指數(shù)(包括Shannon、Simpson指數(shù))。再用QIIME軟件內(nèi)的PCoA作圖，分析樣本見(jiàn)差距。

2 結(jié)果

2.1 兩組樣本α-多樣性參數(shù)比較

兩組樣本經(jīng)過(guò)濾后平均共獲得序列30256條，用于構(gòu)建OTUs，取得分類(lèi)Tags數(shù)平均為24201條。兩組患者總數(shù) Tags、分類(lèi)單元tags、Total OTUS數(shù)目、Species OTUS數(shù)目、Genus OTUS數(shù)目、Species Chao 1、Genus Chao 1、Species Shannon指數(shù)均無(wú)顯著差異(P>0.05)，近端胃癌組Genus Shannon指數(shù)水平高于遠(yuǎn)端胃癌組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 兩組樣本α-多樣性參數(shù)比較

2.2 胃癌患者胃內(nèi)相關(guān)細(xì)菌群落分類(lèi)水平分析

近端胃癌組胃內(nèi)相對(duì)豐度前8位菌門(mén)依次為:變形菌門(mén)為57.10%，泉古菌門(mén)為14.27%，擬桿菌門(mén)為8.29%，厚壁菌門(mén)為7.86%，放線菌門(mén)為5.29%，疣微菌門(mén)為3.00%，酸桿菌門(mén)為2.25%，芽單胞菌門(mén)為0.86%。遠(yuǎn)端胃癌組胃內(nèi)相對(duì)豐度前8位菌門(mén)依次為:變形菌門(mén)為56.42%，泉古菌門(mén)為14.11%，擬桿菌門(mén)為8.12%，厚壁菌門(mén)為7.79%，放線菌門(mén)為5.24%，疣微菌門(mén)為3.03%，酸桿菌門(mén)為2.27%，芽單胞菌門(mén)為0.84%。再分析近、遠(yuǎn)端胃癌組樣本胃內(nèi)相關(guān)細(xì)菌群落門(mén)水平構(gòu)成情況，基于相對(duì)豐度在前10位的菌門(mén)，構(gòu)建了樣本門(mén)水平的物種相對(duì)豐度柱形圖，兩組胃內(nèi)細(xì)菌群落中，變形菌門(mén)豐度比例最高。分析近、遠(yuǎn)端胃癌患者胃內(nèi)細(xì)菌群落在屬水平的構(gòu)成情況，近端胃癌豐度較高的菌屬依次為:不動(dòng)桿菌屬占5.22%,斯瓦尼菌屬占3.74%，普里沃菌屬占2.43%，嗜鹽菌屬占1.78%，擬桿菌屬占1.61%，乳桿菌屬占1.52%，韋榮球菌占1.23%，螺桿菌屬占1.24%，棒桿菌屬占0.75%；遠(yuǎn)端胃癌：不動(dòng)桿菌屬占5.34%,斯瓦尼菌屬占3.73%，普里沃菌屬占2.41%，嗜鹽菌屬占1.75%，擬桿菌屬占1.63%，乳桿菌屬占1.50%，韋榮球菌占1.24%，螺桿菌屬占1.25%，棒桿菌屬占0.81%；兩組胃內(nèi)細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度無(wú)明顯差異。

2.3 兩組樣本細(xì)菌群落PCoA分析

近端、遠(yuǎn)端胃癌組胃內(nèi)相關(guān)細(xì)菌群落構(gòu)成的PCoA分析顯示，橫坐標(biāo)PC1變化率解釋為12.83%，縱坐標(biāo)PC2變化率解釋為8.01%；經(jīng)PCoA分析無(wú)法將近端、遠(yuǎn)端胃癌組相關(guān)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有效區(qū)分，見(jiàn)圖1。

圖1 近端、遠(yuǎn)端胃癌組患者胃內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的PCoA分析

3 討論

3.1 本研究意義

近年來(lái)，隨著胃內(nèi)幽門(mén)螺旋桿菌和其他螺桿菌屬的發(fā)現(xiàn)，及隨后進(jìn)行一系列人體與胃內(nèi)幽門(mén)螺旋桿菌的深入研究證實(shí)，人體內(nèi)胃內(nèi)環(huán)境與腸道環(huán)境具有較強(qiáng)的相似性，均有特殊微生物生存環(huán)境[5]。目前多數(shù)研究對(duì)胃內(nèi)菌群分析，并證實(shí)機(jī)體胃內(nèi)除幽門(mén)螺旋桿菌外，還有其他大量復(fù)雜的菌群結(jié)構(gòu)存在[6]。胃癌的發(fā)生發(fā)展是由多因素共同作用下導(dǎo)致，如遺傳、環(huán)境因素等。近端、遠(yuǎn)端胃癌患者胃內(nèi)真實(shí)的菌群構(gòu)成情況并不清楚。此外，目前對(duì)近端、遠(yuǎn)端胃癌的系統(tǒng)性研究較少見(jiàn)，多集中于口腔、胃內(nèi)微生物對(duì)胃癌的影響。目前已有研究在正常人群與胃癌患者的胃內(nèi)微生物進(jìn)行分析證實(shí)，胃癌患者與正常受試者胃內(nèi)菌落結(jié)構(gòu)、多樣性均有明顯差異[7]。表明，胃癌患者胃內(nèi)菌群結(jié)果與多樣性正發(fā)生改變，且與病情發(fā)展有關(guān)[8]。故本研究設(shè)計(jì)本課題，通過(guò)16SrDNA高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析方法分析近端、遠(yuǎn)端胃癌患者胃內(nèi)微生物群落構(gòu)成和多樣性差異。

3.2 近端與遠(yuǎn)端胃癌患者胃內(nèi)微生態(tài)結(jié)構(gòu)與多樣性分析

采用16SrDNA高通量測(cè)序進(jìn)行胃內(nèi)相關(guān)細(xì)菌群落的高通量測(cè)序，質(zhì)控所得數(shù)據(jù)，對(duì)合格序列行OTUs注釋與樣本間α多樣性分析，總得來(lái)說(shuō)，胃內(nèi)共有鑒定多個(gè)菌門(mén)的細(xì)菌種系型[9]。α多樣性分析結(jié)果顯示，兩組患者總數(shù) Tags、分類(lèi)單元tags、OTUS數(shù)目、 Chao 1、Species Shannon指數(shù)均無(wú)顯著差異，近端胃癌組Genus Shannon指數(shù)水平高于遠(yuǎn)端胃癌組(P<0.05)；表明近端、遠(yuǎn)端胃癌組患者菌群總數(shù)、種類(lèi)多樣性無(wú)明顯差異，且具有較高的豐富度[10]。近端胃癌組相對(duì)豐度大于1%細(xì)菌門(mén)共7種，包括變形菌門(mén)為57.10%，泉古菌門(mén)為14.27%，擬桿菌門(mén)為8.29%，厚壁菌門(mén)為7.86%，放線菌門(mén)為5.29%，疣微菌門(mén)為3.00%，酸桿菌門(mén)為2.25%。遠(yuǎn)端胃癌組相對(duì)豐度大于1%細(xì)菌門(mén)共7種，包括變形菌門(mén)為56.42%，泉古菌門(mén)為14.11%，擬桿菌門(mén)為8.12%，厚壁菌門(mén)為7.79%，放線菌門(mén)為5.24%，疣微菌門(mén)為3.03%，酸桿菌門(mén)為2.27%。兩組相對(duì)豐度大于1%細(xì)菌門(mén)均為共同擁有菌。此外對(duì)兩組患者胃內(nèi)菌落屬水平相對(duì)豐度分析，顯示相對(duì)豐度前5位為近端胃癌組：不動(dòng)桿菌屬占5.22%,斯瓦尼菌屬占3.74%，普里沃菌屬占2.43%，嗜鹽菌屬占1.78%，擬桿菌屬占1.61%。遠(yuǎn)端胃癌：不動(dòng)桿菌屬占5.34%,斯瓦尼菌屬占3.73%，普里沃菌屬占2.41%，嗜鹽菌屬占1.75%，擬桿菌屬占1.63%。兩組胃內(nèi)細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度無(wú)明顯差異。本研究對(duì)胃內(nèi)細(xì)菌種屬的分類(lèi)后發(fā)現(xiàn)患者胃內(nèi)有大量細(xì)菌種型無(wú)法歸類(lèi)于目前已知細(xì)菌序列，對(duì)于這些未知細(xì)菌種屬的生物學(xué)特性與臨床作用目前尚不清楚。此外，近端胃癌與遠(yuǎn)端胃癌者胃內(nèi)菌群測(cè)序結(jié)果總體對(duì)比，胃內(nèi)菌落在物種門(mén)、屬等水平相對(duì)豐度值無(wú)顯著差異。有研究對(duì)不同地域、種族的人群胃內(nèi)菌群進(jìn)行分析，顯示胃內(nèi)菌群構(gòu)成極其相似，其中分別77.4%、79.8%的克隆片段可共享的[11]。還有學(xué)者對(duì)10例胃癌患者胃內(nèi)菌群構(gòu)成行多態(tài)技術(shù)與16SrDNA測(cè)序技術(shù)聯(lián)合分析，認(rèn)為胃癌患者與消化不良胃黏膜正?；颊呶竷?nèi)菌群構(gòu)成比較結(jié)果顯示，其無(wú)明顯差異[12]。我們利用PCoA聚類(lèi)分析方法對(duì)近端、遠(yuǎn)端胃癌患者胃內(nèi)總體細(xì)菌群落進(jìn)行比對(duì)分析后顯示兩組間的胃內(nèi)細(xì)菌群落構(gòu)成和多樣性較相似。進(jìn)一步說(shuō)明近端、遠(yuǎn)端胃內(nèi)菌群構(gòu)成和多樣性相似。

研究為樣本量小的單中心研究，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量證實(shí)本研究結(jié)論。

綜上所述，近端與遠(yuǎn)端胃癌患者胃內(nèi)微生態(tài)結(jié)構(gòu)和多樣性無(wú)顯著差異，且據(jù)有較高相似。