袁秀秀，趙鵬偉，王煜

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，呼和浩特 010000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)研究室，呼和浩特 010000；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，呼和浩特 010000)

早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)，曾稱卵巢早衰(premature ovarian faliure，POF)，是指女性在40歲之前出現(xiàn)卵巢功能減退，常伴月經(jīng)紊亂、FSH水平升高(FSH>25 U/L)，而POF為POI的終末階段，F(xiàn)SH升高更為顯著(FSH>40 U/L)，患者常伴閉經(jīng)、潮熱多汗、性功能減退、骨質(zhì)疏松等圍絕經(jīng)期臨床表現(xiàn)[1]。近年來，隨著生活方式改變和婚育年齡的推遲，POI的發(fā)病率逐年升高，發(fā)病趨于年輕化，是女性不孕的重要原因之一。POI病因復(fù)雜，90%以上病因不明。POI按卵巢功能下降程度分為隱匿期、生化異常期和臨床衰竭期3個階段。目前，臨床用激素替代療法來改善癥狀，但POI患者卵巢功能減退不可逆轉(zhuǎn)，故POI發(fā)病機(jī)制研究成為國內(nèi)外熱點(diǎn)。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，其通過完全互補(bǔ)或不完全互補(bǔ)結(jié)合方式與靶基因3’UTR miRNA結(jié)合，抑制靶基因表達(dá)。miRNA可調(diào)控人類1/3的基因，值得注意的是，1個miRNA可調(diào)節(jié)多個基因，而多個miRNAs也可調(diào)控同一個基因[2]。近年來，隨著轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制研究迅速興起，miRNA為生殖系統(tǒng)的研究帶來了新視角，許多功能性miRNAs被證實(shí)參與調(diào)控卵巢功能。miRNA在女性生殖疾病中的作用，尤其是在POI中的作用正逐漸被深入研究。本文將對miRNA調(diào)控POI分子機(jī)制的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、miRNA多態(tài)性與POI

POI是常見的異質(zhì)性性腺病，遺傳因素約占POI總病因的10%～20%。POI的遺傳物質(zhì)異常不僅發(fā)生在染色體水平，還可能源于單基因異常。單核苷酸多態(tài)性(SNP)是由單個核苷酸堿基的轉(zhuǎn)換或顛換而引起的DNA序列多態(tài)性，是人類可遺傳變異中最常見的一種。目前，已發(fā)現(xiàn)基因突變和SNP通過不同的致病途徑影響卵巢功能，且SNP與POI密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在POI中起著重要的調(diào)控作用，其通過靶向與卵巢功能相關(guān)的基因如，調(diào)控細(xì)胞色素P450家族17亞家族A成員1(CYP17a1)、抗苗勒管激素(AMH)、抑制素亞基βA(INHBa)、細(xì)胞色素P450家族19亞家族A成員1(CYP19a1)、透明帶(ZPS)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP-15)和生長分化因子9(GDF-9)等發(fā)揮作用[3]。Cho等[4]研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a的SNP(C>G)轉(zhuǎn)染人顆粒細(xì)胞后，miR-146a的表達(dá)水平降低并影響叉頭框蛋白O3(FOXO3)、叉頭框蛋白 L2(FOXL2)和Cyclin蛋白家族(CCND2)等POI相關(guān)基因的表達(dá)。Cho等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在143例POI患者血漿中miR-938的正常和變異等位基因與GnRHR3’UTR的識別存在差異，與miR-938的正?；蛐?GG)相比，雜合型(GA)變異有更高的POI發(fā)生風(fēng)險，此外，miR-938多態(tài)性影響人顆粒細(xì)胞中GnRHR的表達(dá)，推測miR-938多態(tài)性通過調(diào)控靶基因從而參與調(diào)控POI發(fā)生?？梢?，miRNA多態(tài)性研究可為POI遺傳性病因機(jī)制的研究提供新思路。

二、miRNA參與調(diào)控POI 的途徑

1.miRNA在顆粒細(xì)胞中參與調(diào)控POI：卵巢顆粒細(xì)胞是卵巢的主要功能細(xì)胞，miRNAs通過調(diào)控顆粒細(xì)胞的生物功能參與POI的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，POF模型小鼠卵巢顆粒細(xì)胞中miR-181b、miR-15a和miR-30d表達(dá)顯著升高，其中miR-15a表達(dá)升高最為顯著；熒光素酶報(bào)告證實(shí)miR-15a的靶基因?yàn)長ast1，當(dāng)miR-15a表達(dá)升高時，抑制Hippo-YAP/TAZ通路及效應(yīng)器Lats1的表達(dá)，抑制顆粒細(xì)胞的增殖，促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡，促進(jìn)POF發(fā)生[6]。在高脂高糖飲食建立的POF小鼠模型中，高糖高脂飲食激活Dab2ip/Ask1/p38-Mapk信號通路，抑制miR-146b-5p表達(dá)，誘導(dǎo)γH2A.X磷酸化，誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞老化和POF發(fā)生[7]。Klotho基因是一種抗衰老基因，位于人類第13條染色體上，其中α-Klotho是一種主要的Klotho蛋白。在環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的POF小鼠模型中α-Klotho基因表達(dá)顯著降低，敲除α-Klotho基因后卵巢中閉鎖卵泡數(shù)顯著增加而正常卵泡數(shù)量顯著減少，miR-15b表達(dá)上調(diào)時，內(nèi)源性α-Klotho基因表達(dá)水平降低并激活下游TGF-β1/Smad信號通路，誘導(dǎo)POF發(fā)生[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在牛顆粒細(xì)胞中過表達(dá)miR-424和miR-503時，Smads家族蛋白7(SMAD7)和激活素A受體ⅡA(ACVR2A)表達(dá)顯著下降，促進(jìn)牛顆粒細(xì)胞增殖[9]。用微陣列分析生化卵巢功能不全(bPOI)患者顆粒細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，miR-379-5p表達(dá)上調(diào)，miR-379-5p靶向作用于聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP1)和X射線修復(fù)互補(bǔ)缺陷修復(fù)基因6(XRCC6)調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖，為bPOI提供表觀遺傳學(xué)依據(jù)[10]。miR-127-5p在bPOI患者血漿中表達(dá)上調(diào)，miR-127-5p直接靶向高遷移率族蛋白 B2(HMGB2)調(diào)控顆粒細(xì)胞增殖，證實(shí)miR-127-5p在POI中有預(yù)測價值，HMGB2可作為POI的新候選基因[11]。研究發(fā)現(xiàn)，在豬、鼠、羊等不同物種中miR-1306、miR-30d-5p、miR-202-5p、miR361-5p、miR-1275、miR-126*分別靶向作用于轉(zhuǎn)化生長因子-β受體II(TGFβR2)、Smad2、TGFβR2、血管內(nèi)皮生長因子(VEGFA)、肝受體源蛋白-1(LRH-1)、促卵泡激素受體(FSHR)，并調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞凋亡[12-17]。在化療誘導(dǎo)的小鼠POF模型中Let-7a表達(dá)下調(diào)，體外實(shí)驗(yàn)將Let-7a模擬物轉(zhuǎn)染到出生后第3天的小鼠卵巢中，發(fā)現(xiàn)Let-7a的表達(dá)上調(diào)抑制跨膜蛋白分子配體(FASL)表達(dá)，使化療誘導(dǎo)的凋亡顆粒細(xì)胞數(shù)減少，表明Let-7a可能在化療誘導(dǎo)的卵巢損傷中起關(guān)鍵作用[18]。研究發(fā)現(xiàn)，在POI患者血清中miR-483-5p表達(dá)顯著升高，在人和小鼠顆粒細(xì)胞系中過表達(dá)FK506結(jié)合蛋白(FKBP4)可以抑制miR-483-5p升高，引起的顆粒細(xì)胞凋亡[19]。從POI患者血中檢測到的差異表達(dá)miRNAs可做為預(yù)測POI發(fā)生發(fā)展的非侵入性生物標(biāo)志物。研究發(fā)現(xiàn)，功能性miRNA通過作用于相應(yīng)靶基因參與調(diào)控顆粒細(xì)胞自噬，如miR-21a和miR-21-3p分別靶向于自噬小體標(biāo)志物蛋白輕鏈3(LC3B-II)和VEGFA，從而影響卵巢功能[20-21]。但尚無研究報(bào)道證實(shí)這些與顆粒細(xì)胞自噬相關(guān)的miRNA是否在人卵巢內(nèi)也有類似功能進(jìn)而影響POI的發(fā)生。在卵巢中與類固醇激素合成和分泌有關(guān)的miRNA，如miR-4463和miR-214-3p分別靶向作用于CYP19A1、雌激素受體α(ESR1)和核受體亞家族5A成員(NR5A1)，調(diào)控雌激素的合成[22-23]。上述與POI相關(guān)的miRNAs在卵巢顆粒細(xì)胞中的具體調(diào)控機(jī)制總結(jié)見表1。

表1 miRNA在顆粒細(xì)胞中的調(diào)控作用

2.miRNA在卵泡膜細(xì)胞中的作用：卵泡膜細(xì)胞參與構(gòu)成卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞發(fā)育的微環(huán)境。在哺乳動物中miRNA參與調(diào)節(jié)卵泡膜細(xì)胞的增殖、分化、合成等功能。牛卵泡膜細(xì)胞中miR-221表達(dá)水平顯著高于顆粒細(xì)胞，卵泡膜細(xì)胞可能是牛卵泡中miR-221的主要來源，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)用成纖維細(xì)胞生長因子9(FGF9)治療牛卵泡膜細(xì)胞后，卵泡膜細(xì)胞中miR-221的表達(dá)水平增加，可抑制類固醇激素生成[24]。當(dāng)雞卵泡膜細(xì)胞中miR-135a-5p的表達(dá)受到抑制時，Krüppel樣因子4(KLF4)、ATP酶磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)8A1(ATP8A1)和復(fù)合蛋白-1(CPLX1)表達(dá)水平顯著上調(diào)，參與調(diào)控雞卵巢卵泡膜細(xì)胞的增殖和分化[25]。目前，影響卵泡膜細(xì)胞功能的miRNA是否參與調(diào)控POI的發(fā)病機(jī)制的研究報(bào)道還比較少。在哺乳動物中被證實(shí)的有功能的miRNAs需要繼續(xù)在人類細(xì)胞中進(jìn)行研究，探討其在POI中的發(fā)病機(jī)制。

3.miRNA在卵泡發(fā)育中參與調(diào)控POI：POI是常見的卵泡發(fā)育障礙性疾病之一，POI患者卵巢儲備功能降低。卵泡發(fā)育是指原始卵泡發(fā)育為成熟卵泡的過程，卵泡成熟障礙或卵泡閉鎖加速影響卵泡發(fā)育，致使卵巢功能下降。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs調(diào)控卵泡發(fā)育[26-27]。在小鼠卵泡中用慢病毒轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-378后，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(Bax/Bcl2)表達(dá)水平顯著增加而卵泡發(fā)育相關(guān)基因BMP15和GDF9表達(dá)顯著降低，推測miR-378可能通過調(diào)控其靶基因影響卵泡的成熟[28]。在人卵丘細(xì)胞中miR-145-5p的表達(dá)水平與卵母細(xì)胞成熟呈負(fù)相關(guān)[29]。miR-21過表達(dá)促進(jìn)豬卵母細(xì)胞成熟[30]。miR-23a-3p可能靶向調(diào)控縫隙連接蛋白43(Gja1)的表達(dá)，調(diào)控大鼠卵泡發(fā)育及閉鎖[31]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-378-3p的表達(dá)隨著原始卵泡的增多而升高，過表達(dá)miR-378-3p后可使原始卵泡百分比增加，敲除miR-378-3p后可使原始卵泡百分比降低，并證實(shí)miR-378-3p通過靶向磷酸肌醇依賴的蛋白激酶 1(PDK1)和半胱氨酸蛋白酶(Caspase9)，參與調(diào)節(jié)原始卵泡池的大小，影響POI發(fā)生[32]。研究發(fā)現(xiàn)，牛閉鎖卵泡中miR-21-5p/-3p、miR-150、miR-409a、miR-142-5p、miR-378、miR-222、miR-155和miR-199a-5p的表達(dá)水平顯著高于健康卵泡，以上這些miRNAs在卵泡膜細(xì)胞中的表達(dá)水平均顯著高于顆粒細(xì)胞[33]。在牛卵泡膜細(xì)胞中miR-155和miR-222的靶基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子(ETS1)，miR-199a-5p和miR-155的靶基因分別為Jagged1和錯配修復(fù)蛋白(MSH2)，在顆粒細(xì)胞中miR-199a-5p、miR-150和miR-378的靶基因?yàn)閂EGFA[33]，上述與卵泡發(fā)育過程密切相關(guān)的miRNAs及其靶基因可能參與調(diào)控 POI的發(fā)生發(fā)展，但具體調(diào)控機(jī)制有待深入研究。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，在自身免疫性POI患者血清中miR-21的表達(dá)顯著降低，miR-21與E3泛素連接酶(Pellino-1)呈正相關(guān)，推測miR-21在卵巢卵泡發(fā)生中可能發(fā)揮重要作用[34]。

三、miRNA在POI治療中的潛在價值

目前，國內(nèi)外學(xué)者試圖通過調(diào)控miRNA來改善患者的卵巢功能。Zhang等[35]研究發(fā)現(xiàn)，在POF小鼠模型中注射人羊膜上皮細(xì)胞(hAECs)來源的外泌體后小鼠卵泡數(shù)量增加且卵巢功能可得到改善，hAECs外泌體通過轉(zhuǎn)移功能性miRNA(如miR-1246)顯著抑制化療誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，從小鼠中分離得到的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體攜帶的主要功能性miRNA有miR-644-5p[36]和miR-144-5p[37]，其分別作用于p53和磷酸酶(PTEN)基因，從而抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，改善卵巢功能。Ding等[38]研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體富集miR-17-5p后，沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT7)、基因修復(fù)關(guān)鍵基因PARP1、磷酸化的染色體組蛋白H2A(γH2AX)和XRCC6的表達(dá)下調(diào)，抑制活性氧的積累，改善POF小鼠卵巢功能。綜上所述，干細(xì)胞來源的外泌體作為POI的新治療方法，其主要機(jī)制是通過miRNA調(diào)控顆粒細(xì)胞功能從而改善卵巢功能，這為使用miRNA替代直接使用干細(xì)胞治療POI的無細(xì)胞治療方案成為可能。

四、總結(jié)和展望

隨著基因測序技術(shù)及再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，miRNAs在POI中的分子調(diào)控機(jī)制逐漸被認(rèn)識。其中，miRNAs多態(tài)性與POI靶基因表達(dá)密切相關(guān)，使得miRNA在POI遺傳性病因中的調(diào)控機(jī)制不斷被證實(shí)。學(xué)者們通過體內(nèi)、外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在POI患者卵巢中存在差異表達(dá)miRNAs，這些miRNAs通過作用于特定的靶基因參與卵泡成熟和閉鎖等過程，但它們是否與人POI發(fā)生有關(guān)有待繼續(xù)驗(yàn)證。隨著與POI相關(guān)的功能性miRNAs、靶基因及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)不斷被發(fā)現(xiàn)，證實(shí)miRNAs在POI發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色。此外，通過外泌體轉(zhuǎn)移的miRNAs可以通過調(diào)控顆粒細(xì)胞功能從而改善卵巢功能。以上研究說明，miRNAs在POI發(fā)生發(fā)展及中起關(guān)鍵作用，與POI密切相關(guān)的miRNAs可能成為潛在治療靶點(diǎn)。