李蕾，陳娟，史宏暉，朱蘭

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院普通婦科中心，國(guó)家婦產(chǎn)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100730)

盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse，POP)是盆底支持結(jié)構(gòu)缺陷、損傷及退化等因素，導(dǎo)致支持薄弱，使生殖器官與其相鄰臟器發(fā)生移位，引起一系列功能紊亂，臨床上表現(xiàn)為子宮脫垂、陰道壁膨出等[1]。隨著人口老年化進(jìn)程加快，該類疾患已成為嚴(yán)重影響中老年婦女健康和生活質(zhì)量的醫(yī)療問題和突出的社會(huì)問題，給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。該病的病因和發(fā)病機(jī)制并不十分清楚。

根據(jù)Dellancy的三水平理論[2]，宮骶韌帶是承托盆腔器官的第一水平支持結(jié)構(gòu)，主要由成纖維細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，成纖維細(xì)胞是組織塑型的關(guān)鍵細(xì)胞。WNT通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞極性和細(xì)胞命運(yùn)決定的重要信號(hào)通路，WNT家族蛋白共有19種[3]。我們先期研究發(fā)現(xiàn)POP患者宮骶韌帶成纖維細(xì)胞中分泌型糖蛋白WNT16B表達(dá)量減少，且細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖活性下降[4]，推測(cè)與盆底支持結(jié)構(gòu)薄弱有關(guān)，但是兩者之間是否有關(guān)聯(lián)目前尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過轉(zhuǎn)染W(wǎng)NT16B至體外培養(yǎng)的原代成纖維細(xì)胞，觀察WNT16B信號(hào)通路持續(xù)激活對(duì)宮骶韌帶成纖維細(xì)胞增殖和膠原分泌的影響，探討其在POP發(fā)病中的作用機(jī)制。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選擇2018年10月至2021年6月在北京協(xié)和醫(yī)院婦產(chǎn)科行陰式子宮全切除術(shù)的絕經(jīng)后POP患者4例，取同期因婦科良性疾病行全子宮切除術(shù)的絕經(jīng)后非POP患者2例作為對(duì)照。對(duì)照患者的年齡、絕經(jīng)時(shí)間和產(chǎn)次與POP患者相匹配。

POP患者和對(duì)照患者既往均無(wú)慢性盆腔炎癥、子宮內(nèi)膜異位癥、婦科惡性腫瘤、結(jié)締組織疾病等。POP患者由資深臨床醫(yī)師按照POP定量分度(POP-Q)法進(jìn)行診斷，均為子宮脫垂合并陰道前壁膨出Ⅲ～Ⅳ度，不伴有壓力性尿失禁。對(duì)照患者為腹腔鏡輔助陰式全子宮切除的婦科良性疾病患者(宮頸癌前病變、無(wú)功能卵巢囊腫等)，無(wú)POP及尿失禁癥狀。

本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

二、主要試劑與儀器

RNeasy Micro Kit提取試劑盒(Qiagen，德國(guó))；AMV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑(Promega，美國(guó))；SYBR Premix Ex Taq IIRR820A熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa，日本)；PCR引物由上海生工生物工程公司合成；E-Plate 16培養(yǎng)板(艾森生物，美國(guó))；培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco，美國(guó))。

BX51型正立式顯微鏡(Olympus，日本)；7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI，美國(guó))；LEICA SP8激光共聚焦顯微鏡(LEICA，德國(guó))；低速離心機(jī)(Thermo，美國(guó))；Maestro Z實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析儀(RTCA)(AxionBiosystems，美國(guó))。

三、研究方法

1.細(xì)胞來源：由資深醫(yī)師在婦科子宮全切術(shù)中取材，宮骶韌帶取自韌帶與宮頸連接處以外0.5～1.0 cm處。取后的組織標(biāo)本用1% Ⅰ型膠原酶消化2 h，離心后，用含15%胎牛血清的M199培養(yǎng)基進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。差時(shí)貼壁法對(duì)培養(yǎng)出的宮骶韌帶成纖維細(xì)胞進(jìn)行純化，3代至8代的宮骶韌帶成纖維細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：將分離自不同患者的宮骶韌帶成纖維細(xì)胞用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，以0.25% 胰酶消化細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

3.宮骶韌帶成纖維細(xì)胞中WNT16B和I型膠原蛋白(COLI)mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)：將體外培養(yǎng)的宮骶韌帶成纖維細(xì)胞消化后，使用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，使用RT-PCR方法檢測(cè)WNT16B和I型膠原蛋白基因的表達(dá)水平，3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因。用相對(duì)定量的方法(2-ΔΔCt)，比較POP各病例與對(duì)照各病例之間WNT16BmRNA表達(dá)，以及轉(zhuǎn)染細(xì)胞前后WNT16B和COLImRNA的表達(dá)水平。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。引物序列見表1。

表1 引物序列

4.實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析系統(tǒng)(RTCA)檢測(cè)細(xì)胞增殖：將培養(yǎng)至第3代的宮骶韌帶成纖維細(xì)胞以0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為30 000/ml，取100 μl細(xì)胞懸液加入預(yù)處理過的E-Plate 16培養(yǎng)板，選取細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞的倍增時(shí)間。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

5.WNT16B過表達(dá)載體構(gòu)建：人WNT16B編碼區(qū)由上海捷瑞生物工程有限公司合成，一個(gè)自剪切序列2A被引入到WNT16B基因的N端。將合成的2A-WNT16B序列插入到pEGFP-C1質(zhì)粒的BamHI位點(diǎn)。之后將CMV-EGFP-2A-WNT16B-polyA表達(dá)框插入慢病毒表達(dá)載體PLKO-puro的ClaI和EcoRI位點(diǎn)之間，得到慢病毒表達(dá)載體pLKO-CMV-EGFP-2A-WNT16B(圖1)。

將人WNT16B編碼區(qū)插入到ClaI和EcoRI位點(diǎn)，得到慢病毒表達(dá)載體pLKO-CMV-EGFP-2A-WNT16B。

6.病毒包裝以及細(xì)胞感染：轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的前一天，將(1.5～2.5)×106對(duì)數(shù)期293T細(xì)胞種到60 mm培養(yǎng)皿中，使用5 ml含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。將慢病毒表達(dá)載體pLKO-CMV-EGFP-2A-WNT16B與包裝質(zhì)粒delta8.9及水泡性口炎包裝質(zhì)粒(VSVG)以2∶2∶1的比例混合，以脂質(zhì)體lipofectamine LTX 轉(zhuǎn)染進(jìn)入293T細(xì)胞，4～6 h后，將培養(yǎng)基更換為含有30%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)基上清，以0.45 μm濾膜過濾后分裝備用。將制備的病毒上清加入培養(yǎng)的宮骶韌帶成纖維細(xì)胞上清，同時(shí)加入聚凝胺(polybrene)至終濃度為8 μg/ml。48 h后，更換為新鮮培養(yǎng)基，使用中濃度(1 μg/ml)的嘌呤霉素篩選7 d后收集細(xì)胞，用RT-PCR方法檢測(cè)WNT16B和COLImRNA表達(dá)水平(詳見前述)。

四、統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?；颊邇蓛砷g比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、樣本信息

收集POP患者4例(編號(hào)121029、121127、130115以及121123am)，非POP對(duì)照患者2例(編號(hào)130129、121207)?；颊唛g年齡、絕經(jīng)時(shí)間和產(chǎn)次相匹配(表2)。

表2 患者收樣信息

二、POP患者與非POP對(duì)照患者宮骶韌帶成纖維細(xì)胞WNT16B基因的表達(dá)

消化培養(yǎng)宮骶韌帶組織成纖維細(xì)胞，提取細(xì)胞的總RNA，使用RT-PCR檢測(cè)非POP對(duì)照患者2例(編號(hào)130129和121207)以及POP患者4例(編號(hào)121029、121127、130115以及121123am)的宮骶韌帶成纖維細(xì)胞中WNT16B的mRNA的表達(dá)水平。與對(duì)照病例比較，所檢測(cè)的4例POP病例中3例的宮骶韌帶成纖維細(xì)胞WNT16BmRNA水平均顯著低于2例對(duì)照病例(P<0.001)(圖2)。

與對(duì)照病例121207比較，*P<0.001；與對(duì)照病例130129比較，#P<0.001。

三、WNT16B慢病毒轉(zhuǎn)染原代成纖維細(xì)胞

由于POP患者宮骶韌帶成纖維細(xì)胞WNT16B表達(dá)水平低于非POP對(duì)照患者，以WNT16B慢病毒轉(zhuǎn)染POP患者宮骶韌帶成纖維細(xì)胞后，提取總RNA，以RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中WNT16BmRNA的水平。結(jié)果顯示病毒轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞，WNT16BmRNA水平均比轉(zhuǎn)染前有顯著提高(P<0.001)(圖3)。

與各自轉(zhuǎn)染前比較，*P<0.001。

四、WNT16B慢病毒轉(zhuǎn)染原代成纖維細(xì)胞后細(xì)胞的增殖情況

以WNT16B慢病毒轉(zhuǎn)染POP患者宮骶韌帶成纖維細(xì)胞后，以實(shí)時(shí)無(wú)標(biāo)記細(xì)胞分析系統(tǒng)(RTCA)檢測(cè)細(xì)胞的倍增時(shí)間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，POP患者宮骶韌帶成纖維細(xì)胞在WNT16B慢病毒轉(zhuǎn)染后倍增時(shí)間均比未轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯著縮短(P<0.05)(圖4)，說明WNT16B能夠顯著提高POP患者成纖維細(xì)胞的增殖活性。

與各自轉(zhuǎn)染前比較，*P<0.05，#P<0.001。

五、WNT16B慢病毒轉(zhuǎn)染原代宮骶韌帶成纖維細(xì)胞后膠原I的表達(dá)

以WNT16B慢病毒感染POP患者宮骶韌帶成纖維細(xì)胞后，提取總RNA，以RT-PCR法檢測(cè)感染前后細(xì)胞中膠原I(COLⅠ)mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示慢病毒感染后的成纖維細(xì)胞COLImRNA水平均比轉(zhuǎn)染前有顯著提高(P<0.05)(圖5)。

與各自轉(zhuǎn)染前比較，*P<0.05，#P<0.01。

討 論

在盆底的支撐系統(tǒng)中，盆腔器官周圍的纖維結(jié)締組織形成筋膜和韌帶，對(duì)抗腹壓和重力，維持陰道及其鄰近器官的解剖位置。有關(guān)POP的發(fā)病機(jī)制中，盆底支持結(jié)構(gòu)中細(xì)胞外基質(zhì)的組成和功能異常被人們所熟知，但是有關(guān)成纖維細(xì)胞的形態(tài)及功能研究還非常有限[5]。

成纖維細(xì)胞是結(jié)締組織中主要細(xì)胞，能分泌細(xì)胞外基質(zhì)及相關(guān)代謝酶(如金屬基質(zhì)蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制劑)，參與膠原纖維合成、成熟和降解過程。盆底支持結(jié)構(gòu)中的成纖維細(xì)胞能感受機(jī)械力和局部生物化學(xué)刺激，維持細(xì)胞外基質(zhì)合成代謝和分解代謝的動(dòng)態(tài)平衡，在組織塑型中起關(guān)鍵作用[6]。因此成纖維細(xì)胞的功能狀態(tài)是影響盆底功能的重要環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，與非POP患者盆底組織相比，POP患者盆底支持韌帶中成纖維細(xì)胞的增殖能力降低、細(xì)胞存活率低，POP患者盆底組織宮骶韌帶胞外基質(zhì)的Ⅰ型、Ⅲ型膠原以及彈性蛋白水平下降，對(duì)異常牽拉產(chǎn)生的應(yīng)力反應(yīng)性降低[7-9]。

WNT為分泌型糖蛋白，WNT信號(hào)通路可以在不同發(fā)育階段調(diào)節(jié)細(xì)胞基本功能，如增殖、分化、遷移和細(xì)胞極性等。目前已鑒定出至少19個(gè)人類WNT基因，WNT16是WNT家族的新成員，有WNT16A和WNT16B兩種異構(gòu)體，WNT16B能在人體多種組織中表達(dá)[10-11]，且在體外能夠通過載體進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和表達(dá)[12]。我們先期的研究通過基因組表達(dá)芯片，在國(guó)內(nèi)外首次發(fā)現(xiàn)POP患者的WNT16相關(guān)信號(hào)通路的基因表達(dá)與年齡、絕經(jīng)狀態(tài)相匹配的正常對(duì)照相比有明顯異常[13]。Xie等[14]通過RNA-seq的方法也篩選到POP患者有異常的WNT16表達(dá)，并與POP分度有關(guān)。目前已有的研究表明，WNT16B與細(xì)胞的增殖、衰老和腫瘤進(jìn)展相關(guān)，可能是通過經(jīng)典或非經(jīng)典的β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路調(diào)節(jié)[11，15]。另外，WNT16B信號(hào)通路還參與組織修復(fù)和組織纖維化異常性疾病，比如成人關(guān)節(jié)軟骨機(jī)械性損傷后，WNT16信號(hào)通路的激活使關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞過度分泌膠原纖維，與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生密切相關(guān)[16]。但是在WNT16B信號(hào)通路對(duì)盆底支持結(jié)構(gòu)中成纖維細(xì)胞的增殖和膠原分泌功能有無(wú)影響，目前尚無(wú)報(bào)道。

本研究中，POP病例原代培養(yǎng)的宮骶韌帶成纖維細(xì)胞與非POP對(duì)照病例相比，WNT16B的表達(dá)水平顯著下降，這與我們以往已經(jīng)發(fā)表的結(jié)果[4]一致。本研究的主要工作是成功構(gòu)建了WNT16B過表達(dá)慢病毒載體，在POP病例過表達(dá)目的蛋白，以挽救POP患者宮骶韌帶成纖維細(xì)胞WNT16B的低表達(dá)水平。在WNT16B的持續(xù)激活狀態(tài)下，成纖維細(xì)胞的倍增時(shí)間縮短，分泌膠原I功能增加，能潛在增強(qiáng)組織的支撐功能，提示W(wǎng)NT16B可能是調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞功能、治療POP的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，值得我們擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步探索。