王含必，竇帥杰，劉思邈，張婉玉，劉美芝，鄧成艷*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院婦科內(nèi)分泌與生殖中心，疑難重癥及罕見病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家婦產(chǎn)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100730；2.北京致成生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，北京 100176)

大量研究證明，子宮內(nèi)膜厚度和形態(tài)是影響妊娠結(jié)局的獨(dú)立因素[1-2]。子宮內(nèi)膜分為功能層和基底層，當(dāng)基底層受到損傷后，將使子宮內(nèi)膜上皮及間質(zhì)組織中的細(xì)胞及腺體數(shù)量減少，子宮內(nèi)膜的血流阻力增加、血流量減少，使子宮內(nèi)膜處于缺氧微環(huán)境，損傷子宮內(nèi)膜的生理功能，這將導(dǎo)致子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞(endometrial glandular epithelial cells，EEC)發(fā)育受損[3]，出現(xiàn)上皮細(xì)胞再生障礙，對(duì)激素刺激無(wú)反應(yīng)，而導(dǎo)致薄型子宮內(nèi)膜。

微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)是包含20～25個(gè)核苷酸的小型非編碼調(diào)控 RNA[4]。miRNA幾乎在生物學(xué)的所有方面都發(fā)揮作用，如增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成。miRNA通過(guò)識(shí)別mRNA的3′非翻譯區(qū)(UTR)中的互補(bǔ)靶位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄后抑制基因表達(dá)[5]。在胚胎種植過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生超過(guò)500種miRNAs[6]，這些miRNAs的表達(dá)受環(huán)境因素(如缺氧、信號(hào)通路、表觀遺傳修飾和植入的不同階段)的影響而調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜功能[7]。

有研究發(fā)現(xiàn)，在異位子宮內(nèi)膜中miR-488表達(dá)降低，其靶基因卷曲類受體7(frizzled class receptor 7，F(xiàn)ZD7)表達(dá)升高，促進(jìn)Wnt信號(hào)通路激活，從而增加子宮內(nèi)膜的增殖、遷移和侵潤(rùn)[8]，而阻斷Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)將減少細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞凋亡[9]。Wnt(Wingless/Integrated，Wnt)信號(hào)通路在成體細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中的增殖、分化以及干細(xì)胞更新和維持的發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[10]，它直接影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡和組織穩(wěn)態(tài)等多種關(guān)鍵的生物過(guò)程[11]。Wnt信號(hào)通路可分為β-連環(huán)蛋白依賴性(典型)信號(hào)通路及β-連環(huán)蛋白非依賴性(非典型)信號(hào)通路，而Wnt 家族成員8b(Wnt8b)是典型的Wnt配體之一。在體外和體內(nèi)Wnt8b敲低都可以抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，從而抑制細(xì)胞的增殖[12]。

本研究將觀察缺氧環(huán)境下EEC miRNAs的表達(dá)，并探究其差異性表達(dá)是否通過(guò)影響Wnt信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控子宮內(nèi)膜的增殖機(jī)制，為薄型子宮內(nèi)膜的發(fā)生及治療提供理論依據(jù)。

資料與方法

一、細(xì)胞來(lái)源

子宮內(nèi)膜腺上皮原代細(xì)胞(CM-H058)購(gòu)于武漢普諾賽生物。

二、試劑和主要儀器

DMEM培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))；多聚甲醛(國(guó)藥試劑)；小牛血清(Gibco，美國(guó))；TRizol(Sigma，美國(guó))；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning，美國(guó))；兔抗Wnt8b抗體、鼠抗β-Tubulin(Cell Signaling，美國(guó))；5×M-MLV Buffer、M-MLV(200 U/μl)、RNase Inhibitor(40 U/μl)(TaKaRa，日本)；q-PCR Μltra Master Mix、dNTP(康為世紀(jì))。

培養(yǎng)箱、低溫離心機(jī)、PCR儀、酶標(biāo)儀(Thermo Fisher，美國(guó))；顯微鏡(Nikon，日本)。

三、研究方法

1.子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞(EEC)的培養(yǎng)：EEC使用普諾賽(Procell)配套的專用生長(zhǎng)培養(yǎng)基及細(xì)胞培養(yǎng)操作方法。采用胰酶消化法進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待EEC密度增長(zhǎng)至80%～90%，使用胰酶消化、計(jì)數(shù)接種至六孔板，每組5×106/孔，分別在常氧(21%氧濃度)和缺氧(1%氧濃度)條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度至80%左右時(shí)，分別用胰酶消化，收集兩組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

2.高通量測(cè)序分析miRNAs的變化：Trizol法提取兩種氧濃度培養(yǎng)條件下EEC的總RNA。miRNA測(cè)序由蘇州貝康醫(yī)療股份有限公司完成。

3.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(qPCR)法檢測(cè)miRNA的表達(dá)：Trizol法提取兩種氧濃度培養(yǎng)條件下EEC的總RNA。采用2 μg定量逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，反應(yīng)體系A(chǔ)為miRNA-RT、Sno-202 RT、dNTP各1 μl，反應(yīng)條件70℃、10 min一次；反應(yīng)體系B為5×M-MLV Buffer 4 μl、M-MLV(200 U/μl)、RNase Inhibitor(40 U/μl)各1 μl、DTT(0.1 mmol/L)2 μl，反應(yīng)條件42℃ 60 min、70℃ 15 min。qPCR檢測(cè)基因表達(dá)量，反應(yīng)體系為miRNA-Forward、URP-Reverse引物(10 μmol/L)各1 μl，RT-PCR Master Mix 10 μl和無(wú)RNA酶水8 μl；snoRNA202為內(nèi)參基因；采用2-△△Ct表示待測(cè)基因mRNA表達(dá)水平。qPCR所用引物(表1)由上海生工有限公司合成。

表1 引物序列

4.采用細(xì)胞計(jì)數(shù)(cell counting kit-8，CCK8)檢測(cè)子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞增殖：分別收集在常氧條件下EEC和缺氧條件(1%氧濃度)的EEC，混勻成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/100 μl，接種至96孔板，100 μl/孔。37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在12 h、24 h、48 h，每孔加入10 μl CCK8，培養(yǎng)1～4 h上機(jī)檢測(cè)，酶標(biāo)儀設(shè)置吸光度450 nm，每組6重復(fù)。

5.免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)Wnt8b蛋白的表達(dá)：分別收集常氧條件下EEC和缺氧條件(1%氧濃度)的EEC，加入100 μl細(xì)胞裂解液4℃環(huán)境下裂解細(xì)胞25 min，低溫離心機(jī)離心25 min，采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑進(jìn)行蛋白定量，加入5×loading buffer煮沸后離心，取30 μg 蛋白上樣到10%SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；用封閉液進(jìn)行封閉，室溫30 min；4℃過(guò)夜孵育一抗(兔抗Wnt8b及鼠抗β-Tubulin，稀釋度1∶1 000)；用TBST洗膜3次，每次10 min；加入二抗(山羊抗兔及山羊抗鼠抗體，稀釋度1∶1 000)，室溫孵育 1 h；再用 TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、缺氧環(huán)境下EEC的miRNAs表達(dá)差異

在常氧和缺氧條件(1%氧濃度)下分別培養(yǎng)EEC，通過(guò)高通量測(cè)序分析探究缺氧條件下EEC的miRNAs表達(dá)變化。分析測(cè)序結(jié)果顯示，缺氧條件下EEC的miR-7851-3p、miR-125a-3p、miR-215-5p、miR-516a-5p、miR-3605-3p、miR-141-5p等miRNAs表達(dá)升高(圖1)，提示缺氧損傷導(dǎo)致了子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞miRNAs表達(dá)譜的改變。

圖1 子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞在常氧和缺氧(1%氧濃度)條件下miRNAs差異表達(dá)熱圖

二、缺氧引起子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的miR-7851-3p表達(dá)上調(diào)

高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)缺氧引起EEC多種miRNAs表達(dá)上調(diào)，為進(jìn)一步證實(shí)上述差異miRNAs表達(dá)，利用qPCR檢測(cè)差異miRNAs的表達(dá)。結(jié)果顯示，與常氧組相比，miR-7851-3p、miR-141-5p、miR-125a-3p在缺氧的EEC中表達(dá)升高(P<0.05～0.001)，其中miR-7851-3p表達(dá)豐度更高(P<0.001)(圖2)，提示miR-7851-3p顯著升高可能在缺氧損傷中起主導(dǎo)地位。

三、缺氧條件子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞增殖能力被抑制

缺氧可以引起細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，因此我們采用CCK8分別檢測(cè)常氧條件和缺氧條件(1%氧濃度)的EEC增殖情況，發(fā)現(xiàn)在兩種環(huán)境下EEC都可以增殖，但在缺氧環(huán)境下，EEC的增殖較常氧環(huán)境下增殖緩慢(P<0.05)，尤其在培養(yǎng)36 h時(shí)差異極為顯著(P<0.001)(圖3)，說(shuō)明缺氧抑制了EEC的增殖。

與同時(shí)間點(diǎn)常氧組比較，*P<0.05，**P<0.01，#P<0.001。

四、缺氧環(huán)境誘導(dǎo)miR-7851-3p的靶基因Wnt8b表達(dá)降低

通過(guò)對(duì)TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)miR-7851-3p的靶基因?yàn)閃nt8b，同時(shí)我們通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則發(fā)現(xiàn)miR-7851-3p可與Wnt8b的3’UTR連續(xù)7個(gè)堿基相匹配(圖4 A)。于是采用Western blot分別檢測(cè)常氧條件下和缺氧環(huán)境(1%氧濃度)下的兩組EEC的Wnt8b蛋白變化情況。結(jié)果顯示，在缺氧條件中，EEC上調(diào)miR-7851-3p表達(dá)的同時(shí)，Wnt8b蛋白的表達(dá)降低(圖4 B)。綜合以上結(jié)果，我們認(rèn)為缺氧誘發(fā)EEC的miR-7851-3p表達(dá)上調(diào)，可能通過(guò)下調(diào)靶基因Wnt8b表達(dá)，抑制EEC的增殖活動(dòng)。

A：生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示W(wǎng)nt8b是miR-7851-3p的潛在靶基因；B：Western blot檢測(cè)Wnt8b的表達(dá)。

討 論

恒定的氧氣供應(yīng)對(duì)于正常的組織功能、發(fā)育和體內(nèi)平衡至關(guān)重要。通過(guò)提供足以滿足組織代謝輸出產(chǎn)生需求的氧濃度來(lái)控制組織中的氧穩(wěn)態(tài)是必不可少的。但在缺氧微環(huán)境下，細(xì)胞的代謝將會(huì)重編程，激活不同的分子信號(hào)通路以適應(yīng)缺氧環(huán)境[13-14]，包括血管生成、葡萄糖代謝和細(xì)胞增殖等過(guò)程[15]。經(jīng)陰道彩色脈沖多普勒超聲檢查發(fā)現(xiàn)“薄”子宮內(nèi)膜的特點(diǎn)是子宮橈動(dòng)脈的血流阻抗高，血供減少致使子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)不良、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)降低和血管發(fā)育不良[16]，子宮內(nèi)膜血流阻力增加，內(nèi)膜血供減少使得EEC及血管內(nèi)皮細(xì)胞處于缺氧微環(huán)境，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜血管生長(zhǎng)不良，EEC增殖受損，反之進(jìn)一步影響子宮內(nèi)膜的血流，這一惡性循環(huán)過(guò)程最終的結(jié)果是子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)受到限制，腺上皮生長(zhǎng)受損[17]。

缺氧是腫瘤微環(huán)境的基本特征，研究發(fā)現(xiàn)在缺氧環(huán)境下培養(yǎng)人類癌細(xì)胞系(MDA-MB231、MCF7、HT29和HCT116)，27 種miRNA在24 h至少上調(diào)1.5倍，由此證明缺氧微環(huán)境下可導(dǎo)致miRNAs表達(dá)譜的改變[16]。為此我們用缺氧損傷模型模擬體內(nèi)的薄型子宮內(nèi)膜的內(nèi)部環(huán)境，通過(guò)RNA測(cè)序及RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)缺氧環(huán)境下的EEC中miR-7851-3p表達(dá)豐度高，而且與常氧環(huán)境下的EEC間表達(dá)存在顯著差異(P<0.001)。同時(shí)采用Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示W(wǎng)nt8b蛋白表達(dá)顯著減低，提示缺氧環(huán)境下miR-7851-3p上調(diào)，從而下調(diào)靶基因Wnt8b的表達(dá)的可能。

Wnt8b是經(jīng)典Wnt配體之一，Wnt信號(hào)通路首先在黑腹果蠅的發(fā)育過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，是一種復(fù)雜的蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過(guò)程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[18]，Wnt信號(hào)通路可分為β-連環(huán)蛋白依賴性(典型)信號(hào)通路，其中β-連環(huán)蛋白易位至細(xì)胞核并上調(diào)癌基因，以及β-連環(huán)蛋白非依賴性(非典型)信號(hào)通路。經(jīng)典和非經(jīng)典途徑都需要 Wnt 配體與相應(yīng)的膜受體卷曲蛋白(Frizzled)結(jié)合以激活信號(hào)級(jí)聯(lián)[8]。Wnt8基因是Wnt基因超家族的成員，包括Wnt8a、Wnt8b和Wnt8c。Wnt8b 蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)由350個(gè)氨基酸殘基組成，研究發(fā)現(xiàn)鋅指轉(zhuǎn)錄因子191(zinc finger transcription factor 191，ZNF191)可以直接與Wnt8b啟動(dòng)子結(jié)合，激活Wnt8b基因，隨后激活Wnt通路促進(jìn)細(xì)胞增殖[19]。通常miRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)原則與靶基因的mRNA的3′非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合，阻斷mRNA的翻譯或降解 mRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白的調(diào)控。而本研究發(fā)現(xiàn)EEC在缺氧環(huán)境下細(xì)胞增殖能力明顯被抑制，同時(shí)缺氧使得EEC高表達(dá)miR-7851-3p，可能靶向抑制調(diào)控細(xì)胞增殖的靶基因Wnt8b表達(dá)，這可能是缺氧引起薄型子宮內(nèi)膜的重要誘因之一。

總之，我們推測(cè)缺氧微環(huán)境上調(diào)EEC的miR-7851-3p表達(dá)，可能通過(guò)抑制Wnt8b蛋白的表達(dá)，阻斷Wnt信號(hào)通路傳導(dǎo)，抑制EEC增殖，這可能是薄型子宮內(nèi)膜潛在的發(fā)病機(jī)制之一。