李敏，朱莉，詹曉北*

1(教育部糖化學(xué)與生物技術(shù)重點實驗室，江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(無錫格萊克斯生物科技有限公司，江蘇 無錫，214125)

低分子質(zhì)量β-1,3-葡聚糖是一種葡萄糖以β-1,3-糖苷鍵連接而成的同型寡糖[1]，相比于高聚合度的β-1,3-葡聚糖，低分子質(zhì)量β-1,3-葡聚糖水溶性較好，具有抗菌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)以及調(diào)節(jié)血糖血脂等生物活性和醫(yī)藥活性[2-4]，且其生物活性隨著分子質(zhì)量的降低而增高[5]。低分子質(zhì)量β-1,3-葡聚糖多樣的生物活性使其市場需求逐漸增加，如何低成本、綠色環(huán)保地生產(chǎn)低分子質(zhì)量β-1,3-葡聚糖已經(jīng)成為研究熱點。

目前，制備低分子質(zhì)量β-1,3-葡聚糖主要通過酶法降解[6-7]、物理降解[8]以及化學(xué)降解[9-10]等方法，但這些方法存在工藝復(fù)雜、化學(xué)廢液排放以及成本較高等問題[11-13]，限制了其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。近些年來，已有利用微生物共培養(yǎng)發(fā)酵獲得低分子質(zhì)量β-1,3-葡聚糖的方法[14-15]，但共培養(yǎng)技術(shù)工藝較為困難，菌體培養(yǎng)流程較為復(fù)雜。王冰等[16]對產(chǎn)熱凝膠菌種Agrobacteriumsp.ATCC 31749進行甘油適應(yīng)性馴化，得到1株可產(chǎn)低分子質(zhì)量β-1,3-葡聚糖的菌株Agrobacteriumsp.WS-8E3T，但產(chǎn)量僅有1.648 g/L。

發(fā)酵過程中的碳源、氮源、pH等因素都會對產(chǎn)量造成影響，本文利用該菌株，在搖瓶水平進行發(fā)酵條件的優(yōu)化，并進行7 L發(fā)酵罐的驗證實驗，為進一步大規(guī)模生產(chǎn)低分子質(zhì)量β-1,3-葡聚糖提供理論基礎(chǔ)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種

Agrobacteriumsp.WS-8E3T，保藏于江南大學(xué)糖生物制造與生物反應(yīng)器研究室。

1.1.2 培養(yǎng)基

平板培養(yǎng)基(g/L)：甘油100.0，酵母粉10.0，魚粉蛋白胨2.0，胰蛋白胨2.0，瓊脂粉20.0，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：甘油40.0，酵母粉6.0，KH2PO41.5，MgSO40.5，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

基礎(chǔ)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油100.0，酵母粉6.0，KH2PO43.0，MgSO41.5，(NH4)2SO42.0，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

所有優(yōu)化實驗均在此基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進行，7 L發(fā)酵罐培養(yǎng)基為優(yōu)化后的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.2 主要試劑

甘油、魚粉蛋白胨、胰蛋白胨、酵母粉、無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、三氟乙酸、甲醇，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；巖藻糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖，Sigma公司。

1.3 儀器與設(shè)備

Y15型Enology全自動葡萄酒分析儀，西班牙Biosystems公司；TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；NEXUS型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Nicolet公司；ICS5000型離子色譜儀，美國Thermo科技公司；Ultrafle Xtreme型基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀，美國Bruck公司；BF115型7 L發(fā)酵罐，美國NBS公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 不同起始甘油濃度對發(fā)酵的影響

保持基礎(chǔ)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變，起始甘油質(zhì)量濃度分別設(shè)置為20、40、60、100 g/L，30 ℃，200 r/min，發(fā)酵96 h，考察碳源濃度對發(fā)酵的影響。

1.4.2 甘油補料對發(fā)酵的影響

起始甘油質(zhì)量濃度為20 g/L，分別在36 h補加10或20 g/L甘油，在48 h補加10或20 g/L甘油，考察甘油補料對發(fā)酵的影響。

1.4.3 單一氮源對發(fā)酵的影響

分別使用酵母粉或硫酸銨作為單一氮源，將起始質(zhì)量濃度分別設(shè)置為1、2、3、4、5、6 g/L，30 ℃，200 r/min，發(fā)酵96 h，考察單一氮源對發(fā)酵的影響。

1.4.4 復(fù)合氮源對發(fā)酵的影響

設(shè)置酵母粉質(zhì)量濃度為4 g/L，分別在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1、2、3、4、5、6 g/L硫酸銨，30 ℃，200 r/min，發(fā)酵96 h，考察復(fù)合氮源對發(fā)酵的影響。

1.4.5 裝液量對發(fā)酵的影響

在500 mL三角瓶中將裝液量分別設(shè)置為25、50、75、100 mL，30 ℃，200 r/min，發(fā)酵96 h，考察轉(zhuǎn)速對發(fā)酵的影響。

1.4.6 轉(zhuǎn)速對發(fā)酵的影響

將搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為160、180、200、220 r/min，30 ℃，發(fā)酵96 h，考察裝液量對發(fā)酵的影響。

1.4.7 pH對發(fā)酵過程的影響

在培養(yǎng)基中分別添加0、1、2、3、4、5 g/L CaCO3，30 ℃，發(fā)酵96 h，考察pH對發(fā)酵的影響。

1.4.8 低聚糖的提取

將發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min離心20 min，取上清液加3倍體積乙醇，4 ℃過夜后，4 ℃、8 000 r/min離心20 min，取上清液補加3倍體積無水乙醇，4 ℃過夜后，4 ℃、8 000 r/min離心20 min，得到的白色沉淀為低分子質(zhì)量β-1,3-葡聚糖(以下簡稱低聚糖)。

1.4.9 糖的純化

配制Sevag試劑[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1]，按照V(糖溶液)∶V(Sevag試劑)=3∶1比例，將二者混合振蕩30 min，4 ℃，8 000 r/min離心10 min，取上清液重復(fù)除蛋白后，采用Sep-Pak C18固相萃取柱(1 g，Waters)再次除蛋白。用紫外分光光度計在200～500 nm進行波長掃描，確保多糖中沒有蛋白質(zhì)殘留。

1.4.10 分析方法

1.4.10.1 發(fā)酵液中甘油殘余量的測定

將2 mL發(fā)酵液于4 ℃，8 000 r/min離心10 min后，取上清液用全自動葡萄酒分析儀測定發(fā)酵液中的甘油殘余量。

1.4.10.2 發(fā)酵液中無機氮、伯胺氮殘余量的測定

將2 mL發(fā)酵液于4 ℃，8 000 r/min離心10 min后，取上清液用全自動葡萄酒分析儀測定發(fā)酵液中的無機氮及伯胺氮殘余量。

1.4.10.3 生物量的測定

取3 mL發(fā)酵液充分混勻后，稀釋一定倍數(shù)，以未接種的培養(yǎng)基為空白，用紫外分光光度計在600 nm處測定吸光度。另取3 mL發(fā)酵液于4 ℃，8 000 r/min離心10 min后，沉淀中加入3 mL 0.5 mol/L的NaOH，充分混勻30 min，4 ℃，8 000 r/min離心10 min后，取沉淀于60 ℃烘干，恒重3次后測干重。測得菌體干重與OD600換算得回歸方程為y=0.335 7x-0.251 7。

1.4.10.4 紅外光譜分析

產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)采用全反射傅里葉變換紅外光譜儀(Fourier transform infrared spectrometer, FT-IR)，在波數(shù)范圍400～4 000 cm-1進行掃描，分辨率為0.5 cm-1。

1.4.10.5 單糖組成分析

單糖組分的測定參考LIU等[17]的方法并略作改動：用2 mol/L三氟乙酸溶解5 mg產(chǎn)品，120 ℃金屬浴酸解12 h，利用高效離子交換層析色譜柱(CarboPacPA20柱，3 mm×150 mm)結(jié)合脈沖電流檢測器進行產(chǎn)品單糖組分分析。

1.4.10.6 聚合度分析

利用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight-mass spectrometer, MALDI-TOF MS)在正離子模式下對產(chǎn)品的質(zhì)荷比進行分析[18]。

1.4.11 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5軟件繪制圖表并進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基組分優(yōu)化

2.1.1 甘油濃度對發(fā)酵的影響

碳源濃度對發(fā)酵至關(guān)重要，過低或過高都不利于菌體生長及產(chǎn)物累積。甘油是具有高滲作用的物質(zhì)，作為碳源使用時，濃度過高帶來的高滲環(huán)境可能會抑制菌體生長及代謝產(chǎn)物的累積[19]。

由圖1和表1可知，當(dāng)起始甘油質(zhì)量濃度分別為60、100 g/L時，0～24 h內(nèi)OD600平均上升速率及甘油平均消耗速率較低，這直接導(dǎo)致了最終低聚糖的產(chǎn)量較低(分別為2.010和1.648 g/L)。而當(dāng)起始甘油質(zhì)量濃度分別為20及40 g/L時，0～24 h內(nèi)OD600平均上升速率及甘油平均消耗速率相對較高，最終低聚糖的產(chǎn)量較高(分別為2.210、2.421 g/L)。這可能是因為甘油濃度過高時，菌體產(chǎn)生的能量要用于抵御外界高滲環(huán)境對自身的迫害[20]，同時用于合成葡聚糖前體物質(zhì)，導(dǎo)致能量因子多段消耗，菌株的生長和產(chǎn)糖能力因此降低[16]。從圖1及表1可見，20 g/L甘油起始質(zhì)量濃度，無論是OD值的上升速率還是甘油的利用速率都高于40 g/L甘油起始質(zhì)量濃度。但是甘油起始質(zhì)量濃度為20 g/L時，發(fā)酵液中的甘油殘余量在36 h降低到8 g/L，48 h已低至6 g/L。綜上，20 g/L甘油前期對菌體生長更有利。

a-生物量(OD600)；b-甘油消耗情況圖1 不同甘油濃度對生物量及甘油消耗的影響Fig.1 Biomassand consumption of glycerol under different glycerol concentration

表1 不同甘油濃度下的生物量(OD600)增長速率、甘油消耗速率及低聚糖產(chǎn)量Table 1 Biomass(OD600)growth rate, glycerol consumption rate and yield at different concentration of glycerol

2.1.2 甘油補料對發(fā)酵的影響

由甘油濃度實驗可知，將初始甘油質(zhì)量濃度設(shè)置為20 g/L時，菌體前期生長速率最快，因此將初始甘油質(zhì)量濃度設(shè)置為20 g/L，分別采用在發(fā)酵36或48 h補加甘油的策略，結(jié)果如表2所示。

表2 不同甘油補料策略下的產(chǎn)糖速率及最終低聚糖產(chǎn)量Table 2 Rate of oligosaccharide production and yield at different supplementation strategies of glycerol

發(fā)酵36 h分別向發(fā)酵液中補加10或20 g/L甘油，36～48 h產(chǎn)糖速率與未補料相比均有不同程度的提升，分別為0.029以及0.038 g/(L·h)。發(fā)酵結(jié)束低聚糖產(chǎn)量分別為3.176及2.92 g/L。發(fā)酵48 h分別向發(fā)酵液中補加10或20 g/L甘油，48～60 h產(chǎn)糖速率分別為0.018及0.023 g/(L·h)，最終產(chǎn)量分別為2.812及2.686 g/L，皆低于在36 h補加甘油。分析原因可能是48 h時體系中甘油殘余量極低，對菌體的正向推動力減弱，產(chǎn)糖能力降低，補加甘油導(dǎo)致菌體不耐受環(huán)境中突然增高的滲透壓，因此在48 h時補加甘油不利于菌體生長及低聚糖的累積。

2.1.3 單一氮源對發(fā)酵的影響

通常情況下，氮源主要在發(fā)酵前期用于菌體生長，構(gòu)成細胞物質(zhì)及含氮代謝產(chǎn)物，發(fā)酵中后期菌體需要在限制氮源或維持較高C/N的條件下產(chǎn)胞外多糖[21]。但菌體在反復(fù)、長時間馴化過程中，微生物許多生理機制也會發(fā)生相應(yīng)的變化以幫助其適應(yīng)外界環(huán)境的變化[22-23]。研究不同氮源及濃度對馴化菌的發(fā)酵影響是十分必要的。

分別利用酵母粉或硫酸銨作為單一氮源，分別設(shè)置初始質(zhì)量濃度為1、2、3、4、5、6 g/L，研究單一氮源對發(fā)酵的影響。結(jié)果如圖2及表3所示，當(dāng)酵母粉作為單一氮源時，隨著酵母粉質(zhì)量濃度的增高，生物量與產(chǎn)量皆提高，伯胺氮消耗速率越快，氮源耗盡后，菌體會產(chǎn)水不溶性膠體，酵母粉為4 g/L時，低聚糖產(chǎn)量為1.603 g/L，當(dāng)酵母粉質(zhì)量濃度繼續(xù)增高時，產(chǎn)量的提高不再明顯，因此，以4 g/L酵母粉添加量較好。當(dāng)以硫酸銨作為單一氮源時，隨著硫酸銨質(zhì)量濃度提高，生物量與產(chǎn)量皆提高，但相較于使用酵母粉作為單一氮源時，無論是菌體的生物量還是低聚糖的產(chǎn)量都整體偏低。

a, b-酵母粉作為單一氮源時的生物量(OD600)及伯胺氮消耗情況；c, d-硫酸銨作為單一氮源時的生物量(OD600)及無機氮消耗情況圖2 單一氮源時生物量及氮源消耗情況Fig.2 Biomass and consumption of nitrogen at different single nitrogen source

表3 單一氮源時低聚糖產(chǎn)量 單位：g/L

2.1.4 復(fù)合氮源對發(fā)酵的影響

根據(jù)前述實驗結(jié)果，選擇添加4 g/L酵母粉作為有機氮源，分別添加1、2、3、4、5、6 g/L硫酸銨，考察復(fù)合氮源對發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖3及表4所示。當(dāng)硫酸銨為1 g/L時，菌體產(chǎn)生了少量的低聚糖并在氮源耗盡后產(chǎn)水不溶性膠體。當(dāng)硫酸銨質(zhì)量濃度為3 g/L時，菌體緩慢消耗無機氮并產(chǎn)低聚糖，產(chǎn)量達到2.612 g/L且不產(chǎn)水不溶性膠體。但當(dāng)發(fā)酵體系中硫酸銨濃度進一步增加時，菌體的生長和產(chǎn)低聚糖能力都降低。綜上，選擇4 g/L酵母粉，3 g/L硫酸銨作為初始復(fù)合氮源較益。

表4 復(fù)合氮源時低聚糖產(chǎn)量 單位：g/L

a-生物量(OD600)；b-無機氮消耗情況圖3 復(fù)合氮源時的生物量及無機氮消耗情況Fig.3 Biomass and consumption of nitrogen at compound nitrogen source

2.2 裝液量對發(fā)酵的影響

以甘油為碳源合成低分子質(zhì)量β-1,3-葡聚糖屬于高耗能過程[24]，改善發(fā)酵體系中的溶氧水平可有效促進三羧酸循環(huán)合成ATP，為菌體生長及產(chǎn)糖提供能量[25]。搖瓶實驗中，裝液量是溶氧的直接影響因素。為考察溶氧對發(fā)酵的影響，在500 mL搖瓶中將裝液量分別設(shè)置為25、50、75、100 mL，考察裝液量對發(fā)酵的影響，結(jié)果如圖4所示。裝液量從25 mL增加到50 mL時，菌體濃度及低聚糖產(chǎn)量幾乎相當(dāng)，當(dāng)裝液量為75 mL時，低聚糖產(chǎn)量顯著提高，為2.636 g/L。當(dāng)裝液量繼續(xù)增加至100 mL時，低聚糖產(chǎn)量隨之降低。這是因為高溶氧時菌體對底物的利用速率較快，后期底物濃度偏低，不利于產(chǎn)物的累積；而高裝液量會限制搖瓶中的氧氣擴散，使發(fā)酵體系中溶氧水平降低，從而限制了菌體的生長與產(chǎn)物的累積。因此，裝液量為75 mL/500 mL時的溶氧可能是該菌株的較佳溶氧水平。

a-低聚糖產(chǎn)量；b-生物量(OD600)圖4 不同裝液量的產(chǎn)量及生物量Fig.4 Yield and biomass at different medium volume

2.3 pH對發(fā)酵的影響

發(fā)酵是一種多酶復(fù)合反應(yīng)體系，體系中的pH值影響菌體細胞內(nèi)各種酶的活性進而影響菌體的生長和產(chǎn)物的合成。多數(shù)微生物生長繁殖所需pH與產(chǎn)物累積所需pH不同，兩階段pH控制策略在發(fā)酵生產(chǎn)微生物多糖中被廣泛利用[26-27]。在發(fā)酵過程中分別設(shè)置CaCO3質(zhì)量濃度為0、1、2、3、4、5 g/L，以維持不同pH值，考察發(fā)酵過程中pH的變化與菌體生長、產(chǎn)物累積之間的關(guān)系。發(fā)酵前24 h各組菌體生長OD600值與pH值幾乎相同，24 h以后各組OD600值、pH值及低聚糖產(chǎn)量出現(xiàn)了差異(數(shù)據(jù)未顯示)，其中添加2 g/L CaCO3時的低聚糖產(chǎn)量最高，為2.510 g/L(圖5-a)。添加2 g/L CaCO3時，菌體在發(fā)酵過程中產(chǎn)糖與pH的關(guān)系如圖5-b所示。在24～36 h ，pH為6.5～6.3時，產(chǎn)糖速率最快，為0.060 g/(L·h)。綜上所述，菌體的最佳產(chǎn)糖pH可能為6.3左右。

a-低聚糖終產(chǎn)量； b-添加2 g/L CaCO3時發(fā)酵過程中產(chǎn)糖量與pH變化圖5 不同pH下產(chǎn)糖情況Fig.5 Yield at different pH

2.4 7 L發(fā)酵罐驗證實驗

在7 L發(fā)酵罐上進行搖瓶實驗結(jié)果的初步驗證。初始甘油質(zhì)量濃度為20 g/L，發(fā)酵液甘油殘量為10 g/L時補加甘油；以4 g/L酵母粉以及3 g/L硫酸銨作為復(fù)合氮源；菌體生長階段0～24 h控制pH為7，菌體產(chǎn)糖階段24～96 h控制pH為6.3；維持通氣比2 vvm-1；攪拌速率150 r/min；發(fā)酵96 h。

如圖6所示，發(fā)酵0～24 h為菌體生長階段，此階段菌體快速生長，OD600平均上升速率為0.395；發(fā)酵24～36 h已有少量低聚糖產(chǎn)生，產(chǎn)糖速率為0.066 g/(L·h)；36～48 h產(chǎn)糖速率顯著提升，為0.117 g/(L·h)；發(fā)酵48～60 h，產(chǎn)糖速率為0.119 g/(L·h)；60 h后，產(chǎn)糖速率隨發(fā)酵時間的延長逐漸減緩直到96 h發(fā)酵結(jié)束，低聚糖的產(chǎn)量達到8.03 g/L，結(jié)果表明，生長期甘油質(zhì)量濃度為20 g/L，產(chǎn)糖期甘油濃度為30 g/L并控制產(chǎn)糖期pH為6.3，可大幅度提高低聚糖產(chǎn)量。

a-生物量(OD600)、產(chǎn)糖量及pH變化； b-甘油、無機氮以及伯胺氮殘余量圖6 7 L發(fā)酵罐發(fā)酵過程中參數(shù)變化Fig.6 Changes of parameters during the fermentation in a 7 L fermenter

2.5 產(chǎn)品結(jié)構(gòu)解析

對7 L發(fā)酵罐所得產(chǎn)品進行結(jié)構(gòu)分析。產(chǎn)品的紅外光譜特征吸收峰與熱凝膠標(biāo)準(zhǔn)品一致(如圖7-a所示)，樣品在波數(shù)891.2 cm-1處有典型的β-糖苷鍵特征吸收峰，而在840和、790 cm-1處無β-糖苷鍵的特征吸收峰，另外在波數(shù)為3 340.4、1 640.5、2 900.1 cm-1處有多糖特征吸收峰，1 030.7、1 160.4 cm-1處有吡喃型糖環(huán)構(gòu)型的特征吸收峰。離子色譜單糖組成分析結(jié)果如圖7-b所示，樣品中只含有一組峰，其保留時間與標(biāo)準(zhǔn)單糖混合液中葡萄糖的保留時間一致，說明產(chǎn)品僅由葡萄糖組成。MALDI-TOF MS聚合度分析結(jié)果如圖7-c所示，出現(xiàn)了m/z為2 956.8、3 118.8、3 280.9、3 442.9、3 605.1的峰，分別對應(yīng)聚合度為18，19，20，21和22。優(yōu)化后的產(chǎn)品為低分子質(zhì)量β-1,3-葡聚糖，聚合度在18～22。其結(jié)構(gòu)特征與優(yōu)化前搖瓶發(fā)酵產(chǎn)物結(jié)構(gòu)一致(詳見參考文獻[16])。

a-FT-IR；b-單糖組成分析(1～7分別是巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖)；c-MALDI-TOF MS圖7 低聚糖的結(jié)構(gòu)及聚合度分析Fig.7 Analysis of structure and degree of polymerization of oligosaccharides

3 結(jié)論

以甘油為碳源，發(fā)酵馴化菌Agrobacteriumsp.WS-8E3T產(chǎn)β-1,3-低聚糖，分別進行了碳源、氮源初始濃度的優(yōu)化，并在搖瓶水平進行補料發(fā)酵的初步探索，優(yōu)化得到起始甘油質(zhì)量濃度為20 g/L，并在低于10 g/L時補加20 g/L，確定最佳酵母粉與硫酸銨的初始質(zhì)量濃度分別為4和3 g/L，最佳裝液比為75 mL/500 mL，產(chǎn)糖期最適pH為6.3左右。通過7 L發(fā)酵罐的驗證實驗，最終低聚糖產(chǎn)量達到8.03 g/L，相比于未優(yōu)化前提高386.7%，通過結(jié)構(gòu)鑒定，判定該低聚糖為β-1,3-葡聚糖，聚合度范圍在18～22。