蘆隱月，宋馨，夏永軍，王光強(qiáng)，艾連中，熊智強(qiáng)

(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)

乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是一類(lèi)能發(fā)酵碳水化合物生成乳酸的細(xì)菌總稱(chēng)，主要包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和明串珠菌屬(Leuconostoc)[1]。乳酸菌能夠減輕乳糖不耐癥、減輕病毒和藥物引起的腹瀉、輔助治療潰瘍、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[1]、防治齲齒、預(yù)防II型糖尿病和肥胖以及降低血清膽固醇水平[2]。乳酸菌在食品工業(yè)中應(yīng)用廣泛，例如生產(chǎn)乳制品、肉制品、泡菜、飲料和天然防腐劑。酸奶發(fā)酵劑主要菌種是保加利亞乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)，其他乳酸菌作為輔助，以不同比例共生形成用于酸奶發(fā)酵的微生物菌群[3]。

雙組分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(two-component signal transduction system, TCS)是細(xì)菌中重要的信號(hào)機(jī)制，經(jīng)典TCS由跨膜受體組氨酸蛋白激酶(histidine protein kinase, HPK)和同源胞質(zhì)內(nèi)應(yīng)答調(diào)控蛋白(response regulator protein, RR)組成，細(xì)菌通過(guò)TCS將環(huán)境刺激與適應(yīng)性反應(yīng)相結(jié)合，調(diào)控新陳代謝和運(yùn)動(dòng)等基本生理活動(dòng)以及發(fā)育和毒力等特殊過(guò)程。HPK感應(yīng)外界信號(hào)刺激后磷酸化自身保守的組氨酸殘基，將磷酸化基團(tuán)轉(zhuǎn)移到RR的保守天冬氨酸殘基上，從而激活RR效應(yīng)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行應(yīng)答調(diào)控[4](圖1)。目前已有許多有關(guān)TCS的報(bào)道，例如EnvZ/OmpR TCS調(diào)控大腸桿菌OmpC蛋白表達(dá)，在乙醇耐受中起關(guān)鍵作用[5]；SalK/SalR、Ihk/Irr、VirR/VirS、NisK/NisR、1910HK/RR等TCS與豬鏈球菌毒力相關(guān)[6]；PhoP/PhoQ TCS可以感知二價(jià)陽(yáng)離子、低pH和陽(yáng)離子抗菌肽的存在，調(diào)控大腸桿菌或沙門(mén)氏菌中Mg2+穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞膜組成、抗逆性和毒力[7]。

圖1 經(jīng)典TCSFig.1 Classical two-component signal transduction system

1 保加利亞乳桿菌TCS

作為最重要的工業(yè)乳酸菌，保加利亞乳桿菌能利用牛奶中乳糖厭氧發(fā)酵快速合成乳酸，因此在發(fā)酵乳制品生產(chǎn)中被廣泛使用。不同保加利亞乳桿菌的TCS數(shù)量有所差異，如保加利亞乳桿菌ATCC BAA 365具有7對(duì)完整的TCS，而ATCC 11842菌株僅有5對(duì)完整的TCS及1個(gè)孤立HPK和1個(gè)孤立RR[8-9]。

1.1 調(diào)控酸適應(yīng)性

在酸奶發(fā)酵過(guò)程中生長(zhǎng)環(huán)境明顯酸化，pH值從6.5下降到4.2左右。因此，酸適應(yīng)能力和耐受性對(duì)保加利亞乳桿菌具有重要意義[10]。CUI等[11]采用定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative PCR, qPCR)方法評(píng)估保加利亞乳桿菌CH3菌株TCS在酸適應(yīng)過(guò)程中的基因表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)2個(gè)TCSJN675228/JN675229和JN675230/JN675231及2個(gè)HPK編碼基因JN675236和JN675240表達(dá)量上調(diào)，推測(cè)其與酸適應(yīng)能力有關(guān)。為驗(yàn)證此推測(cè)，作者選取TCSJN675228(HPK編碼基因)/JN675229(RR編碼基因)進(jìn)行敲除，2個(gè)突變菌株的生長(zhǎng)能力均比野生型顯著下降；JN675228敲除對(duì)菌株酸適應(yīng)能力影響不大，而JN675229敲除使菌株酸適應(yīng)能力下降。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)也證實(shí)JN675228和JN675229編碼蛋白之間存在直接相互作用。這些結(jié)果表明保加利亞乳桿菌中TCSJN675228/JN675229與酸適應(yīng)能力密切相關(guān)。為進(jìn)一步研究JN675228/JN675229在保加利亞乳桿菌酸適應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，WANG等[10]采用二維凝膠電泳和飛行時(shí)間質(zhì)譜法，篩選出在自然發(fā)酵和酸適應(yīng)條件下JN675228/JN675229基因敲除突變株與野生菌株的差異表達(dá)蛋白，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)鑒定JN675228/JN675229的靶基因(表1)。結(jié)果表明TCSJN675228/JN675229通過(guò)多種途徑調(diào)控保加利亞乳桿菌的酸適應(yīng)能力，包括調(diào)控質(zhì)子泵相關(guān)蛋白、經(jīng)典應(yīng)激休克蛋白、碳水化合物代謝、核苷酸生物合成、DNA修復(fù)轉(zhuǎn)錄和翻譯、肽轉(zhuǎn)運(yùn)和降解及細(xì)胞壁生物合成。

表1 保加利亞乳桿菌CH3菌株TCS系統(tǒng)JN675228/JN675229靶基因Table 1 Target genes of two-component signal transduction system JN675228/ JN675229 in L.bulgaricus CH3

續(xù)表1

1.2 調(diào)控細(xì)胞自溶

乳酸菌自溶對(duì)乳制品加工至關(guān)重要，在干酪成熟過(guò)程，乳酸菌通過(guò)自溶將胞內(nèi)肽酶釋放到干酪中，降解氨基酸產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)[12]；而在生產(chǎn)酸奶時(shí)乳酸菌自溶則會(huì)降低起始菌株的活細(xì)胞數(shù)[13]。PANG等[14]通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)保加利亞乳桿菌BAA-365中TCS進(jìn)行功能預(yù)測(cè)(表2)，結(jié)果顯示BAA-365中5對(duì)TCS功能與細(xì)胞自溶無(wú)關(guān)，2個(gè)功能未知。對(duì)其RR(WP_011543855.1和WP_011677872.1)編碼基因敲除，細(xì)胞自溶評(píng)估實(shí)驗(yàn)表明WP_011543855.1編碼基因敲除對(duì)菌株的自溶率和菌落總數(shù)沒(méi)有明顯影響，而WP_011677872.1編碼基因敲除使菌株自溶率顯著降低，菌落總數(shù)顯著上升，基因回補(bǔ)后差異消除。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)WP_011677872.1和WP_011677871.1存在直接相互作用。因此，TCS WP_011677872.1/WP_011677871.1調(diào)控保加利亞乳桿菌細(xì)胞自溶。此外，這對(duì)TCS還參與群體感應(yīng)信號(hào)分子肽II調(diào)控細(xì)胞密度[15]。

表2 保加利亞乳桿菌BAA-365菌株TCS系統(tǒng)功能預(yù)測(cè)Table 2 Functional prediction of two-component signal transduction system in L.bulgaricus BAA-365

2 嗜熱鏈球菌TCS

嗜熱鏈球菌是一種同型發(fā)酵乳酸菌，在適應(yīng)牛奶環(huán)境過(guò)程中，嗜熱鏈球菌失去了許多與毒力和糖利用相關(guān)的基因，但保留了參與牛奶發(fā)酵所需的氮代謝和乳糖利用等功能基因[16]。另外，嗜熱鏈球菌的代謝產(chǎn)物胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)不僅具有降低膽固醇、抗腫瘤和促進(jìn)腸道黏附等生理功能，還能作為食品添加劑和穩(wěn)定劑顯著改善食品物性[17]。產(chǎn)EPS與核苷酸糖代謝和EPS生物合成相關(guān)基因的高轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)[18]，精氨酸代謝調(diào)控蛋白ArgR能特異性結(jié)合eps基因簇啟動(dòng)子，負(fù)調(diào)控EPS合成[19]。

不同嗜熱鏈球菌菌株具有6～8對(duì)完整TCS，例如嗜熱鏈球菌LMD-9菌株具有6對(duì)完整TCS(TCS02、04、05、06、07和09)及2個(gè)孤立RR(RR01和RR08)，其中TCS05對(duì)嗜熱鏈球菌生長(zhǎng)至關(guān)重要。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明嗜熱鏈球菌LMD-9菌株所有RR基因在牛奶發(fā)酵過(guò)程中表達(dá)，但其表達(dá)水平不同[20]。

2.1 調(diào)控生產(chǎn)特性

牛奶發(fā)酵中嗜熱鏈球菌產(chǎn)生乳酸，使環(huán)境pH迅速下降，有助于牛奶酸化；嗜熱鏈球菌合成EPS，有助于提高乳制品的黏度和改善質(zhì)地[21]；嗜熱鏈球菌蛋白水解活性與生長(zhǎng)能力、牛奶酸化速率和芳香化合物形成密切相關(guān)。HU等[22]從內(nèi)蒙古地區(qū)傳統(tǒng)酸奶樣品中分離鑒定出22株嗜熱鏈球菌，根據(jù)已公布的嗜熱鏈球菌TCS序列信息，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增22株嗜熱鏈球菌的TCS。結(jié)果表明，22株嗜熱鏈球菌均具有8對(duì)TCS，但不同菌株的TCS基因序列存在差異。聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn)菌株的不同生產(chǎn)特性與TCS差異存在相關(guān)性，其中系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)屬于Ⅰ-1組和主成分分析屬于A(yíng)簇菌株，它們具有較高的牛奶酸化活性、EPS合成能力、蛋白水解活性等相似的生產(chǎn)特性；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)屬于Ⅲ組和主成分分析屬于A(yíng)簇菌株，TCS數(shù)量和基因序列完全相同，表現(xiàn)出相似的碳水化合物利用能力及牛奶酸化活性；而系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)屬于Ⅳ-2組和主成分分析屬于B簇的菌株，與其他菌株相比具有獨(dú)特的TCS序列，表現(xiàn)出顯著不同的生產(chǎn)特性。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究嗜熱鏈球菌TCS與生產(chǎn)特性的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

2.2 調(diào)控細(xì)菌素生產(chǎn)

細(xì)菌素是細(xì)菌在代謝過(guò)程中通過(guò)核糖體途徑合成的一類(lèi)具有抗菌活性的多肽類(lèi)物質(zhì)。乳酸菌細(xì)菌素具有良好的生物安全性、穩(wěn)定性及適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[23]，在食品防腐保鮮方面應(yīng)用廣泛。HOLS等[20]在嗜熱鏈球菌基因組中發(fā)現(xiàn)II類(lèi)細(xì)菌素基因簇，與肺炎鏈球菌類(lèi)細(xì)菌素肽(bacteriocin-like peptide, blp)基因簇blpSp相似，命名為嗜熱鏈球菌blpSt。LMD-9blpSt基因簇包含23個(gè)基因，分為6個(gè)操縱子，包括肽轉(zhuǎn)運(yùn)基因和信息素基因blpABCSt，TCS基因blpRHSt(即TCS09，BlpHSt和BlpRSt分別為HPK和RR)，細(xì)菌素前體和免疫基因blpDSt-orf1、blpUSt-orf3和blpE-FSt及功能未知基因blpG-XSt。為研究blpSt基因簇功能，F(xiàn)ONTAINE等[24]構(gòu)建blpSt敲除突變株，在以BlpCSt為前體的成熟信息素誘導(dǎo)下通過(guò)spot-on-lawn法和覆蓋法觀(guān)察其細(xì)菌素生產(chǎn)和免疫力表型(表3)，結(jié)果表明blpSt基因簇與細(xì)菌素生產(chǎn)和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)。通過(guò)Northern印跡雜交進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，blpSt啟動(dòng)子中存在直接重復(fù)序列ACCATTCGGG和ACTTTTTGGG，作為BlpRSt假定結(jié)合位點(diǎn)；細(xì)菌素生產(chǎn)受BlpCSt濃度和生長(zhǎng)階段調(diào)控，表現(xiàn)出群體感應(yīng)特征。這些結(jié)果證明blpSt基因簇調(diào)控細(xì)菌素生產(chǎn)，通過(guò)信息素介導(dǎo)的群體感應(yīng)激活TCS09完成調(diào)控。FONTAINE等[25]后續(xù)證明blpSt基因簇編碼嗜熱鏈球菌素9多肽細(xì)菌素系統(tǒng)，能抑制鏈球菌、糞腸球菌、乳酸桿菌和部分李斯特菌等大多數(shù)與嗜熱鏈球菌密切相關(guān)的細(xì)菌生長(zhǎng)。另外，在嗜熱鏈球菌與保加利亞乳桿菌共培養(yǎng)條件下，blpRSt表達(dá)量增加6倍，表明TCS09的表達(dá)顯著受保加利亞乳桿菌的影響[20]。

表3 嗜熱鏈球菌LMD-9及其敲除突變株表型Table 3 Phenotype of S.thermophilus LMD-9 derivatives

2.3 調(diào)控桿菌肽耐藥性

桿菌肽是由芽孢桿菌產(chǎn)生的一種新型環(huán)狀肽抗生素[26]，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和陰性球菌及螺旋體均有殺菌作用，主要作用機(jī)制是抑制細(xì)菌肽聚糖合成，通過(guò)與膜受體十一烯丙基焦磷酸結(jié)合，阻止細(xì)胞壁的生物合成，抑制其去磷酸化，從而破壞十一烯丙基磷酸的再生[27]。因其具有廣譜抗菌活性、禽畜低吸收率、快速排泄率、高安全性和不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，在飼料行業(yè)被廣泛用作飼料添加劑[28]。嗜熱鏈球菌LMD-9中TCS06和TCS07在基因組上位置接近，TCS06同源物常在乳酸桿菌中被發(fā)現(xiàn)[29]，TCS07及其上游潛在的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與枯草芽孢桿菌解毒模塊BceRS/AB系統(tǒng)同源，推測(cè)TCS06和TCS07與嗜熱鏈球菌桿菌肽耐藥性相關(guān)。為驗(yàn)證此推測(cè)，THEVENARD[30]等采用qPCR方法評(píng)估TCS06和TCS07附近基因在桿菌肽耐藥中表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)rr07及其上游ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因STER_1 308-1307表達(dá)量上調(diào)，并且RR07顯著誘導(dǎo)STER_1308表達(dá)。生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，rr07和STER_1 308-1307敲除突變株對(duì)桿菌肽更敏感。這些結(jié)果表明TCS07及其ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白構(gòu)成一個(gè)解毒模塊，STER_1 308-1307在桿菌肽的泵出中發(fā)揮重要作用，且受TCS07正向調(diào)控。鼠李糖-葡萄糖多糖(rhamnose-glucose polysaccharide，RGP)合成途徑中，dTDP-4-脫氫鼠李糖3,5-差向異構(gòu)酶RmlC催化D-葡萄糖-1-磷酸生成dTDP -L-鼠李糖，葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶RgpI控制RGP鼠李糖骨架上形成葡萄糖分支。在桿菌肽脅迫下，野生型菌株rmlC和rgpI表達(dá)量顯著上調(diào)，rr06敲除菌株中3種RGP聚合酶編碼基因rgpA、rgpB和rgpC表達(dá)量也顯著上調(diào)。rmlC敲除突變株對(duì)桿菌肽的敏感性顯著提高，電鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞膜形態(tài)異常。以上結(jié)果表明TCS06可能通過(guò)調(diào)控RGP合成和細(xì)胞膜形態(tài)影響嗜熱鏈球菌的桿菌肽耐藥性。

2.4 調(diào)控抗逆性

嗜熱鏈球菌Sfi39發(fā)酵性能優(yōu)良，但抗逆性較差[31]。Sfi39對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞對(duì)酸和氧敏感，但對(duì)滲透壓和熱較為耐受；酸或熱適應(yīng)均使Sfi39耐熱性顯著提升，耐酸性略微提升，而氧耐受性不受酸或熱適應(yīng)的影響[32]。ZOTTA等[33]構(gòu)建covR同源基因rr01敲除突變株比較其耐受表型。與野生型菌株相比，rr01敲除菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期細(xì)胞的酸和氧耐受性均顯著提高，熱和滲透耐受性均顯著降低；與未經(jīng)適應(yīng)的rr01敲除株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞相比，酸或熱適應(yīng)均使其酸耐受性顯著提高，滲透耐受性顯著降低，酸適應(yīng)使熱耐受性略微提高，氧耐受性無(wú)明顯變化，熱適應(yīng)使熱耐受性和氧耐受性顯著降低；rr01敲除突變株的SDS-PAGE圖譜與野生型相似，但主成分分析表明兩者存在顯著差異。以上結(jié)果表明rr01敲除使熱和滲透耐受性降低，但機(jī)制仍有待研究。

3 總結(jié)與展望

作為細(xì)菌中最常見(jiàn)的信號(hào)機(jī)制，TCS一直是研究熱點(diǎn)。許多細(xì)菌TCS已有深入研究，尤其是致病菌TCS憑借其基因保守性特點(diǎn)，成為新興安全高效的藥物作用靶點(diǎn)。但乳酸菌TCS的研究偏少，例如保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌中多數(shù)TCS功能仍不清晰，而植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌等其他常見(jiàn)乳酸菌的TCS功能知之甚少，且乳酸菌TCS研究主要集中在RR，對(duì)HPK鮮有涉及。制約乳酸菌TCS研究的關(guān)鍵因素之一是其基因編輯方法缺乏。根據(jù)已有的研究表明，TCS與乳酸菌的生長(zhǎng)和功能活性息息相關(guān)。因此，研究乳酸菌TCS的調(diào)控機(jī)制，有助于利用傳統(tǒng)選育、分子生物學(xué)和代謝工程等方法改善乳酸菌的生長(zhǎng)和性能，開(kāi)發(fā)出更加優(yōu)良的酸奶發(fā)酵劑菌種。