冀紅芹，甄玉國(guó)，2 *，劉乙辰，趙小麗，陳 雪

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)吉農(nóng)博瑞奶牛飼料研發(fā)中心，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.長(zhǎng)春博瑞飼料集團(tuán)有限公司技術(shù)中心，吉林 長(zhǎng)春 130114）

隨著我國(guó)及世界飼料工業(yè)的發(fā)展和蛋白質(zhì)資源的日益匱乏[1]，酵母越來(lái)越多的受到人們的關(guān)注。酵母的應(yīng)用極為廣泛，主要是因?yàn)槠錉I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富：優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)含量達(dá)40%～60%，氨基酸成分含量較高且比例均衡，還含有酵母菌分泌的蛋白酶、消化酶、核苷酸、B族維生素、小肽等具有生物活性的成分[2]。酵母細(xì)胞壁的主要活性成分β-葡聚糖和甘露寡糖具有通過(guò)刺激機(jī)體細(xì)胞和體液免疫來(lái)提高免疫性能、促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)以及抑制有害菌生長(zhǎng)的作用，維持腸道和動(dòng)物機(jī)體健康[3]。

然而，其獨(dú)特而堅(jiān)固的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)使酵母的利用率較低。本試驗(yàn)通過(guò)不同方式的自溶，將酵母細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)釋放出來(lái)。產(chǎn)物富含核苷酸、B族維生素、活性小肽、游離氨基酸及酵母細(xì)胞壁多糖等多種成分，兼有酵母原生質(zhì)成分和酵母細(xì)胞壁多糖兩部分的營(yíng)養(yǎng)性能和生物活性功能。

酵母細(xì)胞自溶通過(guò)改變環(huán)境條件，激活酵母細(xì)胞本身含有的蛋白酶、核酸酶、碳水化合物水解酶和葡聚糖酶等多種內(nèi)源酶，將細(xì)胞內(nèi)的大分子化合物水解成小分子，然后通過(guò)細(xì)胞壁的孔隙滲透到細(xì)胞外。由于酵母細(xì)胞內(nèi)源酶活力有限，并且在自溶過(guò)程中不斷降低，自溶率很難提高[4]。

提高酵母細(xì)胞自溶率的方法主要有3種，（1）運(yùn)用物理方法如高壓均質(zhì)、超聲波、溫差法等將酵母細(xì)胞破壁，使內(nèi)容物溢出；（2）化學(xué)方法：通過(guò)添加NaCl、乙醇、硫胺素等化學(xué)物質(zhì)，調(diào)節(jié)酵母細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓、改變細(xì)胞膜通透性、刺激酵母細(xì)胞內(nèi)源酶的活性，提高酵母自溶的得率；（3）生物學(xué)手段：采用外加酶促進(jìn)酵母細(xì)胞壁或胞內(nèi)大分子的水解來(lái)提高酵母自溶得率[5]。

通過(guò)研究添加不同促溶劑（NaCl、木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶等），探討其對(duì)酵母細(xì)胞在發(fā)酵液中自溶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酵母發(fā)酵液（自制）；NaCl、木瓜蛋白酶（活力＞800U/mg）、β-葡聚糖酶（活力＞5 000 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-2C型數(shù)字式酸度計(jì)：上海SANXIN公司；MS分析天平：美國(guó)梅特勒-托利多公司；島津UV-1201分光光度計(jì)：日本島津公司；Eppendorf 5810R高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)艾本德股份公司；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋：金南儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)工藝

取高密度流加發(fā)酵所得酵母發(fā)酵液（菌體密度為干質(zhì)量30g/L），控制條件（NaCl添加量/酶添加量、溫度、時(shí)間、pH）自溶后，置于85℃水浴保持15min滅酶活，5 000r/min離心10min，測(cè)定酵母細(xì)胞自溶后胞內(nèi)物質(zhì)的得率。

1.3.2 指標(biāo)測(cè)定方法

將自溶后的發(fā)酵液5 000r/min 離心后，分離上清液和沉淀，將上清液烘干至質(zhì)量恒定，胞內(nèi)物溶出率計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與討論

2.1 以NaCl為促溶劑的自溶

據(jù)報(bào)道[6]，氯化物、乙醇、乙酸乙酯、硫胺素、脂肪酸鈉、甲苯、硫醇類試劑、氮酮、酵母抽提物、右旋糖等都能起到促進(jìn)酵母自溶的作用。其中NaCl作為安全經(jīng)濟(jì)的促溶劑，經(jīng)常被用在酵母自溶中。NaCl可以通過(guò)提高酵母細(xì)胞外環(huán)境中的滲透壓，促進(jìn)酵母細(xì)胞內(nèi)的原生質(zhì)體為達(dá)到與環(huán)境中滲透壓平衡而失水，形成了質(zhì)壁分離，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外溢。質(zhì)壁分離達(dá)到一定時(shí)間后會(huì)引起細(xì)胞死亡，酵母細(xì)胞由此開(kāi)始降解。NaCl可以加速酵母自溶，縮短生產(chǎn)時(shí)間，同時(shí)對(duì)核糖核酸（ribose nucleic acid，RNA）的降解也有促進(jìn)作用，可以增大底物對(duì)核糖體核糖核酸（ribo somal RNA）裂解酶的敏感程度，且核糖體吸附核糖核酸酶的能力會(huì)因NaCl濃度的提高而下降，從而使核糖核酸酶活性增強(qiáng)[7]。

2.1.1 NaCl添加量對(duì)酵母自溶的影響

添加NaCl能使酵母細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生滲透壓差，有利于胞內(nèi)物質(zhì)的外溢，并且具有一定程度的防腐作用。

取發(fā)酵液30mL，將pH調(diào)節(jié)為5.0，添加不同含量的NaCl，在55℃自溶24h，測(cè)定酵母細(xì)胞胞內(nèi)物的溶出率。酶添加量分別為酵母細(xì)胞干質(zhì)量的0%、3%、6%、9%、12%。

由圖1可知，NaCl添加量為0%～12%時(shí)，酵母細(xì)胞胞內(nèi)物的溶出率有先升高后降低的趨勢(shì)，在NaCl添加量為9%時(shí)達(dá)到最大值。隨后稍有降低，可能由于NaCl添加量較高時(shí)，影響酵母細(xì)胞內(nèi)源酶的活性。因此，酵母細(xì)胞在發(fā)酵液中的自溶，NaCl為最適宜添加量為9%。

圖1 NaCl添加量對(duì)酵母自溶的影響Fig.1 Effect of NaCl addition on yeast autolysis

2.1.2 pH對(duì)酵母自溶的影響

酵母自溶是一個(gè)在多種內(nèi)源酶共同參與并協(xié)同作用的酶促反應(yīng)過(guò)程，各種酶（蛋白酶、核酸酶、β-葡聚糖酶等）的最適pH值各不相同。蛋白酶作為酵母自溶中最重要的內(nèi)源酶，其適宜的pH值分別為7.5、6.5、6.2 和3.5[8]；核酸酶的最適pH值為5～7[9]，β-葡聚糖酶的最適pH值為4.5～4.8。據(jù)報(bào)道，酵母自溶時(shí)的最適pH值為5～8，當(dāng)pH＞8時(shí)自溶液易產(chǎn)生不良?xì)馕渡踔磷冑|(zhì)。

取發(fā)酵液30mL，添加9%NaCl，調(diào)節(jié)pH分別為3、4、5、6、7，在55℃自溶24h，測(cè)定酵母細(xì)胞胞內(nèi)物的溶出率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 pH對(duì)以NaCl為促溶劑的酵母自溶的影響Fig.2 Effect of pH on yeast autolysis based on NaCl as cosolvent

由圖2可知，pH對(duì)酵母細(xì)胞的自溶具有顯著影響。當(dāng)pH值為3～5時(shí)，隨著pH值的逐漸增大，酵母細(xì)胞胞內(nèi)物溶出率明顯上升，當(dāng)pH值為5時(shí)達(dá)到最大。這是因?yàn)楫?dāng)pH值為5時(shí)，達(dá)到了酵母體內(nèi)自溶酶系的最適pH值，自溶酶可以充分水解底物；隨著pH的降低，內(nèi)源酶系對(duì)底物的水解的作用受到抑制，影響自溶效果，過(guò)低的pH會(huì)使酶的三維結(jié)構(gòu)改變進(jìn)而致其失活，pH值為3時(shí)，胞內(nèi)物的溶出率低于其他各組；當(dāng)pH值＞5時(shí)，隨著pH值的增加自溶效果下降。因此，酵母在發(fā)酵液中自溶的pH選擇5為最適宜。

2.1.3 溫度對(duì)酵母自溶的影響

自溶內(nèi)源酶的活性受到環(huán)境溫度的影響，而酵母細(xì)胞內(nèi)源酶系中的每種酶都需要不同的最適溫度。如酵母核酸酶的最適宜溫度為55℃，蛋白酶的最適溫度范圍在30～60℃[10]。

取發(fā)酵液30mL，添加9%NaCl，調(diào)節(jié)pH值為5，分別在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃自溶24 h，測(cè)定酵母細(xì)胞胞內(nèi)物的溶出率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 溫度對(duì)以NaCl為促溶劑的酵母自溶的影響Fig.3 Effect of temperature on yeast autolysis based on NaCl as cosolvent

由圖3可知，當(dāng)溫度為55℃時(shí)，酵母細(xì)胞內(nèi)容物溶出率最高，酵母細(xì)胞內(nèi)源酶系統(tǒng)可以發(fā)揮最大的活性。因此，酵母在發(fā)酵液中的自溶的溫度選擇55℃為最適宜。

2.1.4 時(shí)間對(duì)酵母自溶的影響

在50℃、pH 5.0、NaCl添加量為9%條件下自溶，測(cè)其酵母細(xì)胞胞內(nèi)物的溶出率，結(jié)果如圖4所示。酵母細(xì)胞死亡需要一定的時(shí)間，只有細(xì)胞死亡后，胞內(nèi)的各類水解酶系才能被活化發(fā)揮作用。由圖4可知，在本試驗(yàn)所選的時(shí)間內(nèi)自溶過(guò)程中酵母細(xì)胞內(nèi)容物是不斷溢出的，16h內(nèi)增加迅速，而16h后一直緩慢增加，與寧正祥[11]的研究酵母細(xì)胞的自溶可以在5d內(nèi)持續(xù)進(jìn)行一致。由于酵母細(xì)胞自溶自溶時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致染菌而時(shí)間過(guò)短不能有效的獲取酵母細(xì)胞內(nèi)容物，因此選擇48h為宜。

圖4 時(shí)間對(duì)以NaCl為促溶劑的酵母自溶的影響Fig.4 Effect of time on yeast autolysis based on NaCl as cosolvent

2.1.5 以NaCl為促溶劑的酵母自溶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

為得到影響酵母細(xì)胞內(nèi)容物得率的主次因素，獲得以NaCl為促溶劑的酵母自溶最佳工藝條件，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 以NaCl為促溶劑的自溶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal test for autolysis condition optimization using NaCl as cosolvent

由表1可知，4個(gè)因素對(duì)自溶影響的大小順序?yàn)閜H值＞溫度＞時(shí)間＞NaCl添加量。由正交試驗(yàn)得出以NaCl為促溶劑的酵母發(fā)酵液內(nèi)的自溶條件為A2B2C1D2，即pH5，溫度50℃、時(shí)間48h、NaCl添加量為9%。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得酵母細(xì)胞在發(fā)酵液內(nèi)自溶，酵母細(xì)胞胞內(nèi)物溶出率達(dá)到49.30%。

2.2 以葡聚糖酶為促溶劑的自溶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

由酵母細(xì)胞自溶原理可以得知，影響酵母自溶的主要因素是其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)[12]。細(xì)胞壁一般占酵母干質(zhì)量的25%左右，并且由三層組成類似三明治的結(jié)構(gòu)，由內(nèi)層向外分別為β-葡聚糖、蛋白質(zhì)和甘露寡糖。β-葡聚糖是維持酵母細(xì)胞壁剛性的主要功能性成分，其中大部分為β-1，3-葡聚糖。β-葡聚糖酶的主要作用是水解細(xì)胞壁的β-葡聚糖，使其多聚糖鏈斷裂，擴(kuò)大細(xì)胞壁上的孔隙[13]。由此促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)容物外溢，從而提高了酵母自溶時(shí)酵母細(xì)胞內(nèi)容物的得率。

2.2.1 酶的添加量對(duì)酵母自溶的影響

取發(fā)酵液30mL，將pH調(diào)節(jié)為5.0，添加不同含量的β-葡聚糖酶，在55℃下自溶24h，測(cè)定酵母細(xì)胞胞內(nèi)物的溶出率。酶添加量分別為酵母細(xì)胞干質(zhì)量的0%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著酶添加量的增加，酵母細(xì)胞胞內(nèi)物溶出率逐漸增高，添加量在0～0.6%范圍內(nèi)，酵母細(xì)胞胞內(nèi)物溶出率顯著增加，而0.6%～1.2%范圍內(nèi)胞內(nèi)物溶出率無(wú)顯著差異。因此，從經(jīng)濟(jì)上考慮，β-葡聚糖酶的添加量為0.6%。

圖5 葡聚糖酶添加量對(duì)酵母自溶的影響Fig.5 Effect of β-glucanas addition on yeast autolysis

2.2.2 溫度對(duì)酵母自溶的影響

取發(fā)酵液30mL，將pH調(diào)節(jié)為5.0，添加0.6%的β-葡聚糖酶，在不同溫度條件下自溶24h，測(cè)定酵母細(xì)胞胞內(nèi)物的溶出率。溫度分別為45℃、50℃、55℃、60℃和65℃，結(jié)果如圖6所示。

圖6 溫度對(duì)以β-葡聚糖酶為促溶劑的酵母自溶的影響Fig.6 Effect of temperature on yeast autolysis based on β-glucanas as cosolvent

由圖6可知，溫度為50～55℃時(shí)，酵母細(xì)胞胞內(nèi)物溶出率顯著高于其他溫度，其中50℃時(shí)最高。因此，以β-葡聚糖酶在此自溶體系中的最適溫度為50℃，此結(jié)果與以NaCl為促溶劑的結(jié)果一致，說(shuō)明在此溫度下，外加β-葡聚糖酶與酵母細(xì)胞內(nèi)源酶系在此發(fā)酵液中可以共同保持反應(yīng)活性。

2.2.3 pH對(duì)酵母自溶的影響

取發(fā)酵液30mL，添加0.6%的β-葡聚糖酶，分別調(diào)節(jié)pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，在，50℃溫度條件下自溶24h，測(cè)定酵母細(xì)胞胞內(nèi)物的溶出率，結(jié)果見(jiàn)圖7所示。

由圖7可知，β-葡聚糖酶的最適pH為6.0～6.5[14]，從以NaCl為促溶劑的酵母細(xì)胞自溶結(jié)果可以得到酵母細(xì)胞內(nèi)源酶進(jìn)行自溶的最適宜pH值為5，結(jié)果在pH值為5和6分別有一個(gè)峰值，由在NaCl為促溶劑的酵母細(xì)胞自溶結(jié)果可知，pH為5.0 的時(shí)候酵母細(xì)胞內(nèi)源酶起主要作用；所以pH為6.0時(shí)，外加酶起主要作用。因此，以β-葡聚糖酶為促溶劑的酵母細(xì)胞自溶最適宜pH為6。

圖7 pH對(duì)以β-葡聚糖酶為促溶劑的酵母自溶的影響Fig.7 Effect of pH on yeast autolysis based on β-glucanas as cosolvent

2.2.4 時(shí)間對(duì)酵母自溶的影響

在50℃、pH 6.0、β-葡聚糖酶添加量為1%條件下自溶，測(cè)其酵母細(xì)胞內(nèi)容物隨時(shí)間推移的溢出量變化曲線見(jiàn)圖8。

圖8 時(shí)間對(duì)以β-葡聚糖酶為促溶劑的酵母自溶的影響Fig.8 Effect of time on yeast autolysis based on β-glucanas as cosolvent

由圖8可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酵母細(xì)胞內(nèi)容物的溶出率不斷增加，作用16h時(shí)還在顯著增加。作用時(shí)間超過(guò)24h后則緩慢增加。

為使酵母細(xì)胞內(nèi)容物有效的溶出，且不會(huì)由于作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而導(dǎo)致染菌，選取48h為最佳自溶時(shí)間。

2.2.5 以β-葡聚糖為促溶劑的酵母自溶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)以β-葡聚糖酶為促溶劑的酵母自溶方案進(jìn)行綜合優(yōu)化。選取β-葡聚糖酶添加量、pH值、溫度、時(shí)間進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析見(jiàn)表2。

由表2可知，4因素對(duì)自溶影響的大小順序?yàn)樘砑恿浚緯r(shí)間＞溫度＞pH值。由正交試驗(yàn)得出以β-葡聚糖酶為促溶劑的酵母發(fā)酵液內(nèi)的自溶條件為：pH 6.5，溫度55℃、時(shí)間24h、酶添加量為0.6%。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得酵母細(xì)胞在發(fā)酵液內(nèi)自溶，酵母細(xì)胞胞內(nèi)物溶出率達(dá)到49.98%。

表2 以β-葡聚糖酶為促溶劑的自溶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析為促溶劑的自溶正交表Table 2 Results and analysis of orthogonal test for autolysis condition optimization using β-glucanas as cosolvent

2.3 以木瓜蛋白酶為促溶劑的自溶

外加蛋白酶可以降解酵母細(xì)胞壁和細(xì)胞膜表面的蛋白、增大細(xì)胞壁孔隙，并且將細(xì)胞內(nèi)的大分子蛋白水解為可以通過(guò)細(xì)胞壁孔隙的小肽和氨基酸，溶進(jìn)自溶液中。據(jù)報(bào)道，最有效的促進(jìn)酵母水解的酶類是巰基蛋白酶，主要有木瓜蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶等，木瓜蛋白酶效果最顯著[15]。

木瓜蛋白酶（papain）簡(jiǎn)稱木瓜酶，又稱為木瓜酵素。是利用未成熟的番木瓜（carica papaya）果實(shí)中的乳汁，采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)提煉而成的純天然生物酶制品，其是一種含疏基（-SH）肽鏈內(nèi)切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對(duì)動(dòng)植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強(qiáng)的水解能力。

魏丕芳等[16]研究結(jié)果顯示，啤酒廢酵母正常自溶對(duì)細(xì)胞壁甘露聚糖有一定的水解作用，加鹽可減緩甘露糖的游離，外加木瓜蛋白酶可強(qiáng)烈的破壞甘露聚糖。

2.3.1 木瓜蛋白酶的添加量對(duì)胞內(nèi)物溶出率的影響

取發(fā)酵液30mL，將pH調(diào)節(jié)為5.0，添加不同含量的木瓜蛋白酶，在55℃下自溶24h，測(cè)定酵母細(xì)胞胞內(nèi)物的溶出率，結(jié)果見(jiàn)圖9。酶添加量分別為酵母細(xì)胞干質(zhì)量的0%、0.5%、1%、2%。

由圖9可知，添加木瓜蛋白酶的試驗(yàn)組結(jié)果均高于不添加酶的對(duì)照組。酶的添加量為0.5%時(shí)，酵母細(xì)胞胞內(nèi)物溶出率達(dá)到最大值，增加酶的添加量并不能進(jìn)一步提高溶出率。因此，酵母細(xì)胞在發(fā)酵液中自溶時(shí)所需木瓜蛋白酶的最適添加劑量為酵母細(xì)胞干質(zhì)量的0.5%。

2.3.2 溫度對(duì)胞內(nèi)物溶出率的影響

取發(fā)酵液30mL，將pH調(diào)節(jié)為5.0，添加0.5%的木瓜蛋白酶，在不同溫度條件下自溶24h，測(cè)定酵母細(xì)胞胞內(nèi)物的溶出率。溫度分別為45℃、50℃、55℃、60℃和65℃，結(jié)果如圖10所示。

圖9 木瓜蛋白酶添加量對(duì)酵母自溶的影響Fig.9 Effect of papain addition on yeast autolysis

圖10 溫度對(duì)以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母自溶的影響Fig.10 Effect of temperature on yeast autolysis based on papain as cosolvent

由圖10可知，在45～65℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酵母細(xì)胞胞內(nèi)物溶出率出現(xiàn)兩個(gè)峰值，分別在50℃、60℃，這是因?yàn)橐阅竟系鞍酌笧榇偃軇┑慕湍讣?xì)胞自溶是一個(gè)酵母內(nèi)生酶和外加酶聯(lián)合作用的反應(yīng)過(guò)程，木瓜蛋白酶的適宜作用溫度為60～65℃，而酵母細(xì)胞內(nèi)源酶系的最佳反應(yīng)溫度為50℃。

2.3.3 pH值對(duì)胞內(nèi)物溶出率的影響

取發(fā)酵液30mL，添加0.5%的木瓜蛋白酶，分別調(diào)節(jié)pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5，在50℃溫度條件下自溶24h，測(cè)定酵母細(xì)胞胞內(nèi)物的溶出率，結(jié)果如圖11所示。

圖11 pH對(duì)以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母自溶的影響Fig.11 Effect of pH on yeast autolysis based on papain as cosolvent

由圖11可知，木瓜蛋白酶的最適pH為6.0～6.5，結(jié)果在pH為6.0時(shí)達(dá)到最大值。因此，以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母細(xì)胞自溶最適宜pH為6.0。

2.3.4 時(shí)間對(duì)酵母自溶的影響

在50℃、pH 6.0、木瓜蛋白酶添加量為1%條件下自溶，測(cè)其酵母細(xì)胞內(nèi)容物隨時(shí)間推移的溢出量變化曲線，以確定其自溶時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)圖12。由圖12可知，72h內(nèi)隨著自溶時(shí)間的延長(zhǎng)，酵母細(xì)胞胞內(nèi)物溶出率不斷增加。為使酵母細(xì)胞內(nèi)容物有效的溶出，且不會(huì)由于作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而導(dǎo)致染菌，選取48h為最佳自溶時(shí)間。

圖12 時(shí)間對(duì)以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母自溶的影響Fig.12 Effect of time on yeast autolysis based on papain as cosolvent

2.3.5 以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母自溶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母自溶方案進(jìn)行優(yōu)化。選取木瓜蛋白酶添加量、pH值、溫度、時(shí)間進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析見(jiàn)表3。

表3 以木瓜蛋白酶為促溶劑的自溶條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal test for autolysis condition optimization using papain as cosolvent

由表3可知，4因素對(duì)自溶影響的大小順序?yàn)闇囟龋緋H值＞添加量＞時(shí)間。由正交試驗(yàn)得出以木瓜蛋白酶為促溶劑的酵母發(fā)酵液內(nèi)的自溶條件為pH 6，溫度60℃、時(shí)間72 h、酶添加量為1%。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得酵母細(xì)胞在發(fā)酵液內(nèi)自溶，胞內(nèi)物溶出率達(dá)到51.53%。

比較3種不同促溶劑下酵母細(xì)胞在發(fā)酵液中自溶所得酵母細(xì)胞胞內(nèi)物的溶出率，結(jié)果表明木瓜蛋白酶作為促溶劑時(shí)酵母細(xì)胞內(nèi)容物的得率最高，比NaCl為促溶劑時(shí)提高2%左右，即外加酶促進(jìn)酵母細(xì)胞自溶的效果較小。由于應(yīng)用高密度發(fā)酵所得酵母菌直接自溶，與啤酒廢酵母泥相比本試驗(yàn)中的酵母菌具有較高活性，細(xì)胞壁厚且堅(jiān)固，自溶率難以提高，試驗(yàn)結(jié)果與陶興無(wú)[5]所得面包酵母酶促自溶結(jié)果一致。

3 結(jié)論

綜合以上結(jié)果可以如下結(jié)論：木瓜蛋白酶和β-葡聚糖酶均可以促進(jìn)酵母細(xì)胞自溶，酵母細(xì)胞內(nèi)容物溶出率提高2%左右。

[1]饒應(yīng)昌，譚鶴群.我國(guó)飼料資源的缺口原因及其對(duì)策的探討[J].飼料工業(yè)，2000（3）：5-6.

[2]謝幼梅.飼用酵母的質(zhì)量鑒別[J].農(nóng)業(yè)知識(shí)，2000（16）：42.

[3]趙芳芳，張日俊.酵母細(xì)胞壁生理功能及其應(yīng)用[J].中國(guó)飼料，2003，（17）：17-19.

[4]李 祥，彭 莉，王 毅，等.酵母自溶研究[J].中國(guó)釀造，2001，20（5）：17-19.

[5]陶興無(wú).外加酶提高酵母自溶抽提物得率的研究[J].中國(guó)釀造，2004，23（12）：13-16.

[6]江 凌，田小群，朱明軍，等.自溶-酶聯(lián)技術(shù)制備啤酒廢酵母抽提物工藝及產(chǎn)物理化參數(shù)研究[J].現(xiàn)代食品科技，2008，124（5）：444-447.

[7]李 楊，包清彬，孔 凌，等.酵母抽提物自溶工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)，2011（5）：62-65.

[8]王治權(quán)，陳遠(yuǎn)何，尚水英.啤酒酵母實(shí)用技術(shù)[M].上海：上?？茖W(xué)普及出版社，1990.

[9]陳 潔，王 璋.酵母抽提物中呈味核苷酸含量偏低的原因探討（1）啤酒酵母中核酸酶性質(zhì)研究[J].食品科學(xué)，2005，25（1）：108-111.

[10]楊建梅，李 紅，杜金華.啤酒廢酵母自溶條件的研究[J].中國(guó)釀造，2012，31（2）：95-99.

[11]寧正祥.酵母細(xì)胞自溶動(dòng)力學(xué)研究[J].微生物學(xué)報(bào)，1994，34（3）：213-219.

[12]鄒東恢，江 潔.β-葡聚糖酶的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2005（8）：7-9.

[13]MADDOX IS，HOUGH JS.Proteolytic enzymes ofSaccharomyces carlsbergensis[J].Biochem J，1970，117（5）：843-852.

[14]宮春波，謝麗源.β-葡聚糖酶及在啤酒工業(yè)中的應(yīng)用[J].廣州食品工業(yè)科技，2002，18（1）：58-59.

[15]MILIC T V,RAKIN M,MARINKOVIC S S.Utilization of baker's yeast(Saccharomyces cerevisiae) for the production of yeast extract:effects of different enzymatic treatments on solid,protein and carbohydrate recovery[J].J Serb Chem Soc,2007,72(5):451-457.

[16]魏丕芳.不同自溶方式對(duì)啤酒廢酵母甘露聚糖的降解作用[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2008（9）：75-77.