謝誠芳, 胡煉, 彭飛輝, 徐艷

長沙市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科(湖南長沙 410006)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指發(fā)生3次或3次以上的自然流產(chǎn)，從流行病學(xué)資料中顯示，孕育期女性發(fā)生RSA的比例大約在1%～5%之間，因此伴隨流產(chǎn)次數(shù)的增加，RSA的發(fā)生率也在提升。RSA的病因有很多種，包括生殖異常、免疫功能障礙、母體系統(tǒng)性疾病、環(huán)境因素及胎兒染色體異常等[1-2]。位于10號染色體的基因ZEB1會通過兩面激酶(Janus Kinase，JAK)來抑制蛋白的表達(dá)，進(jìn)而參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)目前已證實，ZEB1在腎癌、肺癌等浸潤轉(zhuǎn)移過程中有表達(dá)上調(diào)的作用，而ZEB1在胚胎停育中的作用機(jī)制目前還沒有詳盡研究[3]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)屬于重要的調(diào)控因子，其會參與胎盤血管新生的全過程，會促進(jìn)血管的新生[4]。miR-200則是已知和胚胎著床相關(guān)的miR，對絨毛組織中滋養(yǎng)細(xì)胞的侵入、增殖及血管新生具有重要調(diào)控作用[5]。鑒于此，本研究從比較RSA患者和正常人工流產(chǎn)婦女、早晚期RSA患者絨毛組織中ZEB1、miR-200、VEGF表達(dá)量的水平入手，結(jié)合ZEB1、miR-200、VEGF相關(guān)性分析來驗證這3種因子在RSA發(fā)生中的預(yù)測作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院于2019年1月至2021年1月婦產(chǎn)科門診接診的100例RSA患者，將其設(shè)置為觀察組，同時，挑選出另外100例同期正常妊娠、要求人工終止妊娠的婦女，將其設(shè)置為對照組。一般資料對比如表1所示，兩組受試者年齡、早期妊娠例數(shù)、晚期妊娠例數(shù)、早期妊娠周數(shù)、晚期妊娠周數(shù)、體質(zhì)指數(shù)(BMI)、收縮壓、舒張壓對比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。兩組受試者妊娠次數(shù)對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 兩組一般資料對比

納入標(biāo)準(zhǔn)：對照組患者：人工流產(chǎn)的正常妊娠女性；既往無自然流產(chǎn)史；無陰道流血等先兆流產(chǎn)癥狀；彩超檢查胚胎發(fā)育正常，有心管搏動和胚芽。觀察組患者：患者超聲檢查、白帶檢查均排除生殖道畸形及生殖道感染；3次或3次以上自然流產(chǎn)史；夫妻雙方、彩超檢查胚胎染色體檢查正常；患者自身抗體(抗甲狀腺抗體、抗核抗體、抗心磷脂抗體等)均呈陰性；彩超提示宮內(nèi)妊娠，無心管搏動或無胚芽；男方精液檢查正常。妊娠周數(shù)<12周為早期RSA，12<妊娠周數(shù)<28為晚期RSA。

排除標(biāo)準(zhǔn)：甲狀腺、凝血功能異常；近期生活中發(fā)生重大事件；TORCH檢測結(jié)果示近期感染；近期接觸過重金屬等毒物。

本研究已經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(CSSDSYY-LLSC-KYXM-2021-4-3)，所有參與本次研究的研究對象均知情同意。

1.2 方法 樣品采集及保存：所有孕婦均行清宮術(shù)，采集妊娠周數(shù)<12周與>12周患者新鮮胎盤絨毛組織100 mg，用無菌水進(jìn)行沖洗，然后置于液氮中速凍，-80℃保存。另外于入組3 d后清晨空腹抽取所有研究對象靜脈血3 mL，高速離心后取上清液，置于-80℃保存待測。

采用miRNA熒光定量PCR法檢測胎盤絨毛組織與血清中各自ZEB1、miR-200、VEGF表達(dá)量，首先利用各自試劑盒對VEGF、miR-200進(jìn)行擴(kuò)增，軟件自動生成擴(kuò)增循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(Ct)，根據(jù)公式2-ΔΔCt以U6、β-actin分別為內(nèi)參計算miR-200、VEGF的相對表達(dá)量。miR-200引物序列為F：5′-CGGGTGAAATGTTTAGG-3′，R：5′-TTGGCCATGTGTACGTA-3′。ZEB1引物序列為F：5′-GCACCTGAAGAGGACCAGAG-3′；R：5′-TGCATCTGGTGTTCCATTTT-3′。VEGF引物序列為F：AGGCCAGCACATAGGAGAGA，R：TACCGGGATTTCTTGCGCTT。試劑盒由杭州開泰生物技術(shù)有限公司(生產(chǎn)批號：2936441570、18512004752)提供。

2 結(jié)果

2.1 ZEB1、miR-200、VEGF在兩組胎盤絨毛組織中、血清中的表達(dá)差異 觀察組絨毛組織中、血清中miR-200表達(dá)量明顯比對照組高(P<0.05)，ZEB1、VEGF表達(dá)量明顯比對照組低(P<0.05)。見表2、3和圖1。

表2 ZEB1、miR-200、VEGF在兩組胎盤絨毛組織中的表達(dá)

表3 ZEB1、miR-200、VEGF在兩組血清中的表達(dá)

圖1 ZEB1、miR-200、VEGF在兩組胎盤絨毛組織和血清中的表達(dá)PCR條帶圖

2.2 ZEB1、miR-200、VEGF在早期、晚期患者胎盤絨毛組織中、血清中的表達(dá)差異 與對照組早期流產(chǎn)患者相比，對照組晚期流產(chǎn)患者絨毛組織中、血清中ZEB1表達(dá)量升高，miR-200、VEGF表達(dá)量降低、觀察組早期RSA、晚期RSA患者絨毛組織中、血清中miR-200表達(dá)量升高，ZEB1、VEGF表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。與對照組晚期流產(chǎn)患者相比，觀察組早期RSA、晚期RSA患者絨毛組織中、血清中miR-200表達(dá)量升高，ZEB1、VEGF表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。與觀察組早期RSA患者相比，晚期RSA患者絨毛組織中、血清中miR-200表達(dá)量降低，ZEB1、VEGF表達(dá)量升高(P<0.05)，見表4、5。

表4 ZEB1、miR-200、VEGF在早期、晚期患者胎盤絨毛組織中的表達(dá)

表5 ZEB1、miR-200、VEGF在早期、晚期患者血液中的表達(dá)

2.3 絨毛組織中ZEB1、miR-200、VEGF三者之間的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示，ZEB1、miR-200呈負(fù)相關(guān)(r=-0.349，P=0.004)；miR-200、VEGF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.486，P=0.001)；ZEB1、VEGF呈正相關(guān)(r=0.654，P=0.001)。見圖2。

圖2 ZEB1、miR-200、VEGF之間相關(guān)性

2.4 ROC曲線分析ZEB1、miR-200、VEGF對RSA的診斷價值 如表6、圖3所示，ROC曲線分析顯示，與ZEB1、miR-200、VEGF單項診斷相比，三項聯(lián)合對RSA診斷價值較高(P<0.05)。

表6 ROC曲線分析ZEB1、miR-200、VEGF對RSA的診斷價值

圖3 ZEB1、miR-200、VEGF對RSA的診斷價值ROC曲線

3 討論

RSA屬于較為常見的婦科妊娠類疾病，其會對女性的生理、心理造成嚴(yán)重影響，RSA在妊娠早期、晚期都會出現(xiàn)，嚴(yán)重者會發(fā)展成為不孕不育[6]。導(dǎo)致RSA的因素有很多，其中最常見的因素包括遺傳因素、環(huán)境因素及胚胎發(fā)育因素等，雖然該疾病的作用機(jī)制目前還未明確，但可以肯定的是發(fā)生RSA的直接原因是子宮內(nèi)膜得不到充足的營養(yǎng)供給。在整個妊娠環(huán)節(jié)中，胎盤絨毛組織血管會持續(xù)控制滋養(yǎng)層細(xì)胞運動，一旦滋養(yǎng)層細(xì)胞的作用機(jī)制被干擾、阻斷，其最終結(jié)果就會引發(fā)RSA[7-8]。

相關(guān)研究顯示，ZEB1在細(xì)胞分化、基因調(diào)控及胚胎發(fā)育中一直發(fā)揮重要作用。在胚胎發(fā)育階段，胚胎的著床及形成都需要ZEB1的參與，ZEB1低表達(dá)則會阻礙上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，讓細(xì)胞浸潤能力降低，此時滋養(yǎng)層外胚胎細(xì)胞利用上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)行遷移的過程就會受到影響，最終會阻斷胚胎和母體之間聯(lián)系的建立。由此可以看出，ZEB1在母胎物質(zhì)交換的作用是至關(guān)重要的[9-10]。由此可知，ZEB1發(fā)揮自身調(diào)控作用會直接決定妊娠結(jié)局的如何，本研究結(jié)果顯示，和人工流產(chǎn)患者相比，RSA患者絨毛組織中、血清中的ZEB1表達(dá)水平都較低，且從RSA不同分期看，早期患者ZEB1表達(dá)水平也遠(yuǎn)低于晚期患者。由此可以推斷，ZEB1自身的調(diào)控作用對妊娠結(jié)局是有一定影響的，ZEB1低表達(dá)會讓滋養(yǎng)層細(xì)胞浸潤能力降低，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化受到抑制，導(dǎo)致胎盤淺著床，發(fā)生RSA的概率會大大增加。

miRNA表達(dá)和RSA存在關(guān)聯(lián)，miR-200多分布在上皮組織中，在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，研究表明，miR-200會調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞[11-12]。另外，以往研究證實，在RSA患者絨毛組織中、血清中miR-200的表達(dá)量會異常升高，miR-200表達(dá)異常升高后讓子宮內(nèi)膜受容性降低[13-14]。在本研究結(jié)果中，和人工流產(chǎn)患者相比，miR-200在RSA患者絨毛組織中、血清中的表達(dá)量都較高，此結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，另外，從RSA病理分期看，早期RSA患者miR-200的表達(dá)量也高于晚期RSA患者。提示RSA患者血液及絨毛組織中miR-200的過高表達(dá)會阻礙上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，影響胚胎發(fā)育。

在胚胎發(fā)育中，VEGF會讓血管形成高特異有絲分裂原，讓血管通透性增加，對血管增生及內(nèi)破細(xì)胞分化過程有重要影響[15-16]。有研究指出，VEGF的低表達(dá)是胚胎血管障礙的直接原因[17-18]。研究證實，在妊娠階段，孕婦子宮內(nèi)膜及絨毛組織間隙中的氧分壓較低，胚胎會長時間處于低氧環(huán)境中[19-20]，而VEGF高水平表達(dá)會促進(jìn)分支血管的生成，保證血管的重鑄，為胚胎提供有效的血氧供給[21]。本研究結(jié)果顯示，和人工流產(chǎn)患者相比，RSA患者絨毛組織中、血清中VEGF的表達(dá)量較低，且在RSA不同分期中，早期RSA患者VEGF的表達(dá)量要低于晚期RSA患者。這說明在胚胎早期發(fā)育階段，VEGF的過低表達(dá)不利于胚胎血管的生長、分化，一旦分支血管的生成與重鑄無法完成，母體對胚胎的營養(yǎng)供給就無法進(jìn)行，則胚胎會停止發(fā)育。

另外本文分析ZEB1、miR-200、VEGF之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，三者存在相關(guān)關(guān)系，是判定RSA發(fā)生的重要參考，ZEB1、VEGF與miR-200存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，ZEB1和VEGF是正相關(guān)關(guān)系。滋養(yǎng)層細(xì)胞的浸潤能力下降，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力降低，不利于分支血管的生成，因此胚胎的著床和發(fā)育均受到影響，最終發(fā)生RSA。而影響上述機(jī)制的正是ZEB1的低表達(dá)、miR-200的高表達(dá)、以及VEGF的低表達(dá)，采用ROC曲線分析三者對RSA的診斷價值發(fā)現(xiàn)，三者聯(lián)合用于診斷RSA的價值較高，但本文并未深入分析ZEB1、miR-200、VEGF作用于RSA的具體機(jī)制，因此，本文研究結(jié)果未來還需要更多的臨床數(shù)據(jù)來證實以驗證三者與RSA的關(guān)系。

綜上所述，RSA患者絨毛細(xì)胞組織中、血清中ZEB1、VEGF表達(dá)會異常降低，miR-200表達(dá)會異常升高，且RSA發(fā)生的越早，可對患者體內(nèi)ZEB1、VEGF、miR-200水平造成影響，RSA的發(fā)生與ZEB1、miR-200、VEGF有直接關(guān)系，所以絨毛組織中三者表達(dá)之間存在相關(guān)性，聯(lián)合診斷可以預(yù)估RSA的發(fā)生。

利益相關(guān)聲明：本文所有作者聲明沒有利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：謝誠芳直接參與醞釀和設(shè)計實驗，實施研究，采集分析解釋數(shù)據(jù)，撰寫論文，獲取研究經(jīng)費，全面支持該項研究，審閱論文，指導(dǎo)研究。胡煉審閱論文，指導(dǎo)研究。彭飛輝審閱論文。徐艷采集分析解釋數(shù)據(jù)，審閱論文。