陽(yáng)智芬, 曠開(kāi)其, 陳潔, 謝毓濱

長(zhǎng)沙血液中心輸血研究所(湖南長(zhǎng)沙 410001)

新生兒同種免疫性血小板減少癥(neonatal alloimmune thrombocytopenia，NAIT)是由于胎兒與母親血小板抗原不一致，母親產(chǎn)生了針對(duì)胎兒的血小板抗體，血小板抗體可通過(guò)胎盤(pán)進(jìn)入胎兒體內(nèi)，從而破壞胎兒血小板，引發(fā)一系列的免疫綜合征，與新生兒溶血病中紅細(xì)胞的破壞機(jī)制相似[1]。通過(guò)對(duì)RhD陰性孕產(chǎn)婦IgG抗-D篩查與效價(jià)測(cè)定來(lái)評(píng)估發(fā)生新生兒溶血病的危險(xiǎn)度，加強(qiáng)新生兒溶血病的防治目前已經(jīng)達(dá)成了共識(shí)，但是對(duì)于RhD陰性人群母嬰血小板抗原不合而引起NAIT的研究還相對(duì)較少。本研究通過(guò)對(duì)RhD陰性女性進(jìn)行血小板抗原及抗體的檢測(cè)，分析血小板抗體與NAIT發(fā)生的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年12月至2020年8月在本血液中心進(jìn)行產(chǎn)(孕)前免疫學(xué)檢查的RhD陰性女性的血液標(biāo)本204例，年齡18～46歲，平均(29±5.6)歲。本研究已通過(guò)長(zhǎng)沙血液中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑 PCR儀(賽默飛世爾科技)、GBOX凝膠成像儀(美國(guó)Syngene)、電泳儀(北京六一)、平板離心機(jī)(PlateSpinⅡ，日本久保田)、洗板機(jī)(瑞士Tecan)、酶標(biāo)儀(Epoch， 美國(guó)Bio Tek)、孵育箱(上海圣科)。

血小板抗體檢測(cè)試劑盒(長(zhǎng)春博德，批號(hào)20191005)、PAKPLUS血小板抗體特異性分析試劑盒(美國(guó)Immucor 公司，批號(hào)3008388)、全血基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技公司，批號(hào)S8111)、人類(lèi)血小板同種抗原HPA1-18，21試劑盒(PCR-SSP法)(天津秀鵬公司，批號(hào)K201911004)，LIFECODES LSA 試劑盒(美國(guó)Immucor公司，批號(hào)3009479)。

1.3 方法

1.3.1 血小板抗體篩查 采用固相凝集法，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)要求操作，結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)如下，陽(yáng)性：指示紅細(xì)胞均勻平鋪于反應(yīng)孔底部表面； 弱陽(yáng)性： 指示紅細(xì)胞結(jié)合區(qū)域大于陰性對(duì)照； 陰性： 指示紅細(xì)胞聚集于反應(yīng)孔底部中央形成紅細(xì)胞聚集。

1.3.2 血小板抗體特異性分析 采用ELISA方法進(jìn)行血小板抗體特異性分析，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟操作，結(jié)果判斷：Cutoff =NCOD× cutoff Multiplier，OD值≥Cutoff 值則判為陽(yáng)性。

1.3.3 HLA特異性抗體檢測(cè) 利用Luminex平臺(tái)檢測(cè)， 嚴(yán)格按LIFECODES LSA 試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.4 HPA基因分型 采用PCR-SSP法對(duì)人類(lèi)血小板同種抗原進(jìn)行基因分型，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。擴(kuò)增完成后取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL，在2.5%瓊脂糖凝膠中150 V電泳12 min，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍攝成像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血小板抗體篩查結(jié)果 204 例RhD陰性女性中，血小板抗體篩查陽(yáng)性者29 例，陽(yáng)性率為14.22%。其中無(wú)妊娠史組的陽(yáng)性率為2.94%，有妊娠史組的陽(yáng)性率為16.47%，兩組陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=4.253，P<0.05)。將有妊娠史的孕產(chǎn)婦分為3組，分別為妊娠次數(shù)1次組、2次組和≥3次組，3組陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=1.469，P>0.05)。見(jiàn)表1、2。

表1 妊娠史對(duì)RhD陰性女性血小板抗體篩查結(jié)果的影響

表2 不同妊娠次數(shù)對(duì)RhD陰性孕產(chǎn)婦血小板抗體篩查結(jié)果的影響

2.2 血小板抗體特異性檢測(cè)結(jié)果 29例血小板抗體陽(yáng)性者血小板抗體類(lèi)型分布見(jiàn)表3，9例HPA抗體鑒定結(jié)果分布見(jiàn)表4。

表3 29例 RhD陰性女性血小板抗體類(lèi)型

表4 9例HPA 抗體特異性分布

2.3 HPA基因分型結(jié)果 29例血小板抗體篩查陽(yáng)性者HPA基因型和基因頻率分布見(jiàn)表5。結(jié)果顯示，HPA-3和HPA-15系統(tǒng)的多態(tài)性豐富，其他系統(tǒng)以aa為主，ab少見(jiàn)，bb未檢出。

表5 血小板抗篩陽(yáng)性者 HPA1-18，21系統(tǒng)基因型和基因頻率分布

2.4 NAIT的發(fā)生情況 通過(guò)對(duì)血小板抗體篩查陽(yáng)性的孕婦進(jìn)行產(chǎn)后追蹤隨訪，了解其小孩出生后是否出現(xiàn)血小板計(jì)數(shù)<150×109·L-1，是否有皮膚黏膜出現(xiàn)瘀點(diǎn)、瘀斑等血小板減少的臨床癥狀，其中有1例血小板抗體陽(yáng)性的孕婦，其血清經(jīng)血小板特異性抗體檢測(cè)分析，結(jié)果為HPA特異性抗體陰性，HLA抗體陽(yáng)性。經(jīng)luminex進(jìn)一步的免疫抗體分析，結(jié)果顯示該抗體為抗HLA-B60抗體和HLA-Cw7抗體。其胎兒出生后3次血小板計(jì)數(shù)均小于100×109·L-1，證實(shí)其發(fā)生了NAIT并及時(shí)對(duì)癥治療。

3 討論

本研究共完成了204例RhD陰性女性的血小板抗體篩查，其中陽(yáng)性29例，陽(yáng)性率為14.22%。血小板抗體的產(chǎn)生機(jī)制分為兩種，一種是同種免疫因素，胎兒含有母親缺乏的血小板抗原，可刺激母體產(chǎn)生抗血小板抗體，此IgG性質(zhì)的抗體可通過(guò)胎盤(pán)，一般第一胎不發(fā)病，再次妊娠時(shí)易發(fā)生NAIT；另一種是自身免疫因素，母親患有自身免疫性疾病，母親體內(nèi)已經(jīng)產(chǎn)生的抗血小板抗體在妊娠期間可通過(guò)胎盤(pán)進(jìn)入胎兒體內(nèi)，與胎兒血小板結(jié)合，導(dǎo)致血小板減少，這種在第一胎時(shí)就可以發(fā)病[2]。本研究中，無(wú)妊娠史組中有1例陽(yáng)性，進(jìn)一步分析為抗-GP Ⅰa/Ⅱa抗體，該檢測(cè)者也無(wú)輸血史，可能為血小板自身抗體。

本研究中有妊娠史的陽(yáng)性率為16.47%，有妊娠史組陽(yáng)性率高于無(wú)孕產(chǎn)史組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。葉水文等[3]報(bào)道初產(chǎn)婦組和經(jīng)產(chǎn)婦組血小板血型抗體陽(yáng)性率分別為5.6%和12.3%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，無(wú)早期流產(chǎn)組和有早期流產(chǎn)組血小板抗體陽(yáng)性分別為6.8%和11.4%。其他多個(gè)研究也表明血小板抗體和妊娠次數(shù)及早期流產(chǎn)次數(shù)及孕周密切相關(guān)，與年齡和分娩方式無(wú)關(guān)[3-7]。金琪等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，妊娠次數(shù)為1次的孕婦血小板抗體陽(yáng)性率為4.9%，妊娠2～3次的陽(yáng)性率為12.6%，妊娠>3次的陽(yáng)性率高達(dá)31.3%，隨著妊娠次數(shù)的增加，血小板抗體產(chǎn)生的概率也增加。而本研究中不同妊娠次數(shù)組之間血小板抗體陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能原因?yàn)樵挟a(chǎn)婦未如實(shí)填寫(xiě)妊娠史，尤其是流產(chǎn)史，提示我們?cè)诓杉挟a(chǎn)婦的信息時(shí)需要進(jìn)一步引導(dǎo)和規(guī)范。張文麗等[8]的研究表明血小板抗體陽(yáng)性的孕婦主要分布在前置胎盤(pán)、瘢痕子宮、胎盤(pán)植入、血小板減少癥等疾病中。總之，輸血史、生育史、疾病類(lèi)型對(duì)于孕婦血小板抗體陽(yáng)性率均有一定的影響。

血小板抗體主要分為兩種，一種是針對(duì)血小板特異性抗原的抗-HPA抗體，一種是針對(duì)HLA-Ⅰ類(lèi)抗原的抗-HLA抗體，本研究發(fā)現(xiàn)29例陽(yáng)性者中抗-HLA抗體20例(68.97%)，抗-HPA 4例(13.79%)，抗-HLA抗體和抗-HPA 抗體均陽(yáng)性者5例(17.24%)，任明等[9]報(bào)道的血液病患者血小板抗體特性分析結(jié)果為抗-HLA 類(lèi)60.00%，抗-HPA 2.61%，抗-HLA類(lèi)和抗-HPA 37.39%，該研究與本研究的結(jié)果一致，均表明血小板抗體以抗-HLA抗體為主。

血小板抗體可導(dǎo)致血小板輸注無(wú)效，輸血后紫癜和NAIT。NAIT是導(dǎo)致新生兒血小板減少癥的最常見(jiàn)病因，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)顱內(nèi)出血[10-11]，在已報(bào)道的NAIT病例中，大多數(shù)是由HPA抗體所致，在高加索人群中，75%～85%的NAIT是由抗-HPA-1a引起的，在日本引起NAIT最常見(jiàn)的抗體是HPA-5b，其次為HPA-4b[12]。目前國(guó)內(nèi)僅有關(guān)于由HPA-5b[13]、HPA-3a[14]等抗體所致NAIT的個(gè)例報(bào)道，尚無(wú)基于大數(shù)據(jù)分析的關(guān)于引起 NAIT的HPA抗體分型的研究。本研究中HPA基因分型結(jié)果顯示HPA-3和HPA-15系統(tǒng)具有多態(tài)性，可能是導(dǎo)致母嬰血小板特異性抗原不合的主要因素，但仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。隨著研究的深入，HLA抗體引起的NAIT被相繼報(bào)道，鄧晶等[15]分析了4例與母源性HLA 抗體相關(guān)的NAIT，可能的HLA抗體為-HLA-A11、-HLA-A2、-HLA-B40、-HLA-B15、-HLA-B7和-HLA-B27。本研究發(fā)現(xiàn)1例NAIT，患兒母親血小板計(jì)數(shù)正常，血小板抗體檢測(cè)陽(yáng)性，經(jīng)鑒定為針對(duì)患兒的抗-HLA 類(lèi)抗體，HLA基因測(cè)序結(jié)果顯示，患兒HLA-A* 24:02、B* 40:01和C* 07:02為遺傳自父親的等位基因，其對(duì)應(yīng)的抗原分別為A24、B60和Cw7，這3種HLA抗原有可能會(huì)刺激母體產(chǎn)生相應(yīng)抗體。HLA抗體特異性分析結(jié)果顯示，A24抗體未檢出，B60和Cw7抗體呈強(qiáng)陽(yáng)性。因此結(jié)合HLA抗體檢測(cè)和基因分型結(jié)果可確定該病例為由HLA-B60抗體和HLA-Cw7抗體引起的NAIT[16]?；純貉“蹇贵w篩查結(jié)果為陰性，可能是由于患兒體內(nèi)大多數(shù)血小板抗體已與自身血小板結(jié)合，血清中游離的血小板抗體濃度較低，因此血小板抗體篩查呈陰性?；純撼錾?次血小板計(jì)數(shù)均小于100×109·L-1，出生時(shí)無(wú)瘀點(diǎn)瘀斑。

隨著二胎及三胎政策的開(kāi)放，RhD陰性孕產(chǎn)婦這個(gè)特殊群體的孕產(chǎn)安全得到了更加廣泛的關(guān)注，產(chǎn)前免疫學(xué)檢測(cè)越發(fā)重要，目前紅細(xì)胞血型、不規(guī)則抗體篩查及鑒定、血型抗體效價(jià)檢測(cè)等已成為產(chǎn)前檢查的常規(guī)項(xiàng)目，而血小板抗體篩查與鑒定還未得到充分重視。血小板檢測(cè)專家共識(shí)[17]中指出，可疑NAIT妊娠患者應(yīng)進(jìn)行血小板抗體檢測(cè)。因此，通過(guò)對(duì)孕婦，尤其是有多次妊娠史和流產(chǎn)史的經(jīng)產(chǎn)婦進(jìn)行血小板抗體及效價(jià)，可為NAIT的預(yù)防、診斷和治療提供一定的依據(jù)，從而實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育，提高人口出生素質(zhì)。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說(shuō)明：陽(yáng)智芬負(fù)責(zé)主持、項(xiàng)目設(shè)計(jì)與實(shí)施，并負(fù)責(zé)論文撰寫(xiě)；謝毓濱負(fù)責(zé)項(xiàng)目設(shè)計(jì)、項(xiàng)目協(xié)調(diào)；曠開(kāi)其、陳潔負(fù)責(zé)項(xiàng)目實(shí)施。