何圓圓, 李平萍, 李瑤蕓, 曾麗紅, 吳國波, 周雪花, 唐卒卒, 肖彬, 周天紅, 王麗, 張新華△

中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二三醫(yī)院 1血液科， 2檢驗科， 3兒科， 4輸血科(廣西南寧 530021)

廣西是地中海貧血(以下簡稱地貧)高發(fā)區(qū)[1-2]，長期以來廣西地貧胎兒出生率高，地貧患者生存狀況差[3-4]。2010年廣西政府啟動了“廣西地貧防治計劃”，目的是降低重型地貧胎兒的出生率、改善已出生患者生存狀況，2018年廣西政府提出了“重癥地貧零出生目標”。在地貧防控流程中，找出地貧高危孕婦是關(guān)鍵，即胎兒可能是重型地貧的孕婦，在孕婦都檢出地貧基因型后就可以達到目的。然而，α地貧很容易通過檢出的基因型區(qū)分重型(--/--)和中間型(--/-α或--/αTα)[1]，而β地貧卻很難區(qū)分，過去常認為β0/β0基因型為重型β地貧(TM)，β+/β+基因型為中間型β地貧(TI)，而β0/β+基因型既可以是TM也可以是TI[1]，但是大量的研究表明臨床結(jié)局常常與此不相符[5-9]。2013年國際地貧聯(lián)合會(TF)將地貧分類為輸血依賴型地貧(TDT)和非輸血依賴型地貧(NTDT)，并分別編輯出版了相應的診療指南[10-11]，按指南標準過去以基因型判斷的中間型α地貧和TI中的部分患者是TDT，但出生前是無法確定的，而未來地貧防控關(guān)注的重點除了孕中晚期或出生后即死亡的重型α地貧外就是TDT。另外，部分TDT患者盡管臨床可診斷地貧但常規(guī)基因分析無法明確基因診斷，而他們的父母均有一方?jīng)]查出地貧基因而進入地貧防控的盲區(qū)。通過回顧性分析我院就診的1 331例廣西籍β地貧患者出生年份及基因突變類型特點，探討地貧防控策略的效果及走向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2007年1月至2020年12月期間在我院就診資料完整的廣西籍β地貧患者1 331例，其中男781例，女550例，年齡1～65歲，中位年齡12歲。本研究已通過中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二三醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法 以血常規(guī)、血紅蛋白電泳及地貧基因分析結(jié)果進行診斷，診斷標準參照《血液病診斷及療效標準》[12]。以身份證或戶口本確定出生地和出生年份。地貧基因型結(jié)果以三甲及以上醫(yī)院或第三方檢驗平臺做的地貧基因分析報告單為依據(jù)，均以國家衛(wèi)生計生委婦幼司、國衛(wèi)婦幼出防便函[2014]106號和國家衛(wèi)健委婦幼健康司、國衛(wèi)辦婦幼函[2018]683號批準的地貧試劑盒檢測，地貧試劑盒不能檢出的基因突變類型采納第三方檢測平臺測序結(jié)果(不同年代所用測序方式不同，從一代測序到三代測序)。臨床、血常規(guī)和電泳結(jié)果提示為TM或TI，但常規(guī)試劑盒檢測僅診斷為β地貧雜合子的，經(jīng)骨髓細胞學分析確定為溶血性貧血骨髓像的均作為有“罕見基因突變類型”。常規(guī)試劑盒僅能檢出23種基因型，包括：3種常見缺失型α地貧基因：--SEA、-α3.7和-α4.2；3種常見突變型α地貧基因：αCS、αQS和αWS及17種常見β地貧基因：CD41-42(-TCTT)，IVS-Ⅱ-654(C→T)，-28(A →G)，CD71-72(+A)，CD17(A→T)，βE(CD26G→A)，CD31(-C)，CD43(G→T)，-32(C→A)，CD27-28(+C)，-29(A→G)，-30(T→C)，CD14-15(+G)，CAP+40-+43(-AAAC)，Int(ATG→AGG)，IVS-Ⅰ-1(G→T)和 IVS-Ⅰ-5(G→C)。

2 結(jié)果

2.1 出生年份 1 331例患者中1987年出生的為10例，此前均為個位數(shù)，此后逐年增加，2009年達到頂峰為103例，2010年開始下降，2018年降至18例，2020年降至2例。見圖1。

圖1 1 331例β地貧患者出生年份分布

2.2 基因突變類型 1 293例(97.15%)通過常規(guī)基因分析明確基因型，檢出12種基因突變類型，常見基因突變類型的分布頻率見表1。38例(2.85%)罕見基因突變類型患者26例通過測序明確基因型，12例未能明確基因型(按當時測序結(jié)果，沒有進行新的測序)，檢出8種β地貧基因突類型和2種α三聯(lián)體，見表2。1 293例常見基因突變類型β地貧中最常見的4種基因型是CD41-42/CD17(205例，15.9%)、CD41-42/CD41-42(197例，15.2%)、CD41-42/-28(96例，7.4%)和CD17/CD17(92例，7.1%)。1 293例患者中β0/β0純合子344例(26.6%)，β0/β0雙重雜合子380例(29.4%)，β0/β+雙重雜合子370例(28.6%)，β+/β+純合子22例(1.7%，其中14例-28/-28，8例IVS-Ⅱ-654/IVS-Ⅱ-654)，β+/β+雙重雜合子31例(2.4%，其中25例IVS-Ⅱ-654/-28，4例29/-28，2例IVS-Ⅱ-654/-29)，β/HbE 146例(11.3%)。有176例患者復合了α地貧(13.6%)。

表1 1 293例患者常見β地貧基因突變類型的分布頻率

表2 通過測序檢出的8種β-地貧罕見基因突變類型和2種α三聯(lián)體

3 討論

β地貧致病的核心機制是α/β珠蛋白鏈的不平衡[1，13]。由于α/β珠蛋白鏈比例失衡，過多的α珠蛋白在紅細胞前體中積聚并沉淀形成四聚體，沉積在紅細胞膜上，引發(fā)血色素分解和游離Fe3+釋放，后者可催化活性氧反應并降低還原型谷胱苷肽，導致膜蛋白氧化，引發(fā)膜損傷，加上四聚體沉積所引發(fā)的自體免疫清除機制，促使成熟紅細胞形成脆性增加和可塑性降低的“地貧樣紅細胞”，此類細胞易于在微循環(huán)中破裂而產(chǎn)生溶血[13]。此外，雖然造血旺盛，但重型和中間型β地貧患者的紅系祖細胞大多數(shù)在髓內(nèi)死亡，導致無效造血[13]。無效造血反而促進骨髓造血的代償性增加，造血腔擴大，出現(xiàn)骨骼畸形，骨質(zhì)疏松，形成地貧面容，嚴重者出現(xiàn)病理性骨折，還引起脾臟增大，相應的脾臟破壞紅細胞增加，加重貧血[10-11，13]。無效造血時還將促使機體增加鐵吸收，導致鐵過載，過量的鐵沉積于肝臟、心臟、胰腺、甲狀腺、性腺等部位，導致肝功能不全、心功能不全、糖尿病、生長發(fā)育遲緩、第二性征推遲等并發(fā)癥[10-11]。β地貧的治療主要是規(guī)范輸血和足量除鐵，造血干細胞移植是目前唯一根治的手段，而血源緊張和治療費高昂是地貧患者生存的障礙，做好地貧防控，減少重癥地貧胎兒出生是關(guān)鍵。

1 331例β地貧患者的出生年份分布顯示過去廣西地貧患者生存狀況差，大多在幼兒時期死亡[3]，而隨著經(jīng)濟條件和醫(yī)療條件的改善，地貧患者生存狀況得到改善[4]，特別是2010年“廣西地貧防治計劃”實施后地貧患者生存狀況進一步改善[14]，同時由于防控工作成效顯著，重癥地貧胎兒出生率大幅度下降[15]。2018年廣西政府提出了“重癥地貧零出生目標”，零出生指標是：重型地貧胎兒診斷率≥98%，重型地貧胎兒醫(yī)學干預率≥98%，重型地貧患兒出生率<0.3/萬。按廣西地貧流調(diào)結(jié)果以每年70萬孕婦估算廣西每年出生的TM和TI胎兒約為724 例(95%CI： 603～897)[2]，從圖1可見2009年當年全廣西出生的TM和TI患者中約有1/7(103例)來過我院就診，而2009年就是最高值，從2010年起快速減少，2018年是18例，2020年僅2例。從桂婦兒健康服務(wù)信息管理系統(tǒng)獲悉2020年廣西助產(chǎn)機構(gòu)活胎產(chǎn)數(shù)為57.49萬例，按重型地貧零出生目標計算當年TM患兒出生例數(shù)應<17例，而當年出生的TM患兒中有2例到我院就診，如果按廣西1/7的TM和TI患者會到我院就診估算是達標了，但需要注意是廣西各地醫(yī)院在實施地貧防治計劃后高度重視地貧防治工作，地貧診療水平顯著提高，來我院就診的TM和TI患者也相應減少，我院就診患者量已難以準確反映廣西TM和TI患者的實際出生人數(shù)。

1 331例β地貧患者中1 293例患者明確基因型，最常見的4個基因型是CD41-42/CD17、CD41-42/CD41-42、CD41-42/-28和CD17/CD17，與流調(diào)結(jié)果一致。38例(2.85%)臨床診斷TM或TI的患者中通過常規(guī)基因分析沒有明確基因診斷的，通過測序有26例明確了基因型，測序檢出8種β地貧基因突類型和2種α三聯(lián)體，可見地貧防控精準度有必要進一步提高。38例患者中多數(shù)是父母做地貧篩查時一方?jīng)]檢出地貧基因而漏診。目前國家衛(wèi)生計生委婦幼司、國家衛(wèi)婦幼出防便函[2014]106號和國家衛(wèi)健委婦幼健康司、國衛(wèi)辦婦幼函[2018]683號批準的地貧試劑盒只檢測我國最常見的23種基因型，而在中國人群中已發(fā)現(xiàn)129種β珠蛋白基因點突變(含異常血紅蛋白)和16種β地貧缺失突變[13]。

有研究通過高通量測序(二代基因測序，NGS)對10 111對夫婦進行地貧分子篩選分析中，共檢測到4 180對攜帶4 840個突變等位基因的個體，并確定了186對有可能影響后代的夫婦，發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)篩查比較，可以將高風險夫婦的陽性檢出率提高23.2%[16]。而NGS技術(shù)也有不能明確的罕見基因，NGS技術(shù)在實際應用中也存在缺陷，如讀長較短，無法跨越基因上串聯(lián)重復區(qū)域，導致其在檢測串聯(lián)重復區(qū)域時存在明顯不足[17]。與NGS技術(shù)相比，地貧等位基因綜合分析(CATSA)的三代測序(TGS)方法用于識別α和β地貧遺傳攜帶者狀態(tài)有更大的優(yōu)勢，針對此項技術(shù)的全國多中心研究結(jié)果已有報道[18]，其發(fā)現(xiàn)TGS結(jié)合遠程聚合酶鏈式反應(PCR)的技術(shù)對于地貧等位基因的覆蓋率、可靠性和準確性，提供了一種全面的方法，有可能為地貧基因攜帶者篩查提供一種通用的解決方案，實現(xiàn)對地貧基因攜帶者的精準診斷，避免在地貧產(chǎn)前診斷及臨床診斷方面出現(xiàn)漏診。本研究3例α三聯(lián)體為TGS技術(shù)檢出。

“廣西地貧防治計劃”更多關(guān)注的是重型地貧的醫(yī)學干預，β0/β0胎兒是TM需要在知情同意前提下終止妊娠，β0/β+患者可以是TM也可以是TI[1，19-20]，無法判斷出生后是TM還是TI，也需要在知情同意前提下終止妊娠，而認為β+/β+胎兒是TI[1，19-20]，所以無需進行醫(yī)學干預，另外理論上β地貧復合α地貧的患者貧血會有所減輕[1，19-20]，會認為復合α地貧的β0/β+是TI，無需進行醫(yī)學干預。然而大量的研究證明，由于存在著基因修飾因子的修飾作用，臨床上基因型與表型可能不一致，例如BCL11A、HBSIL、MYB、KLF1[5-9]等修飾基因都可能會影響到β地貧的表型。本研究患者中5例是β0/β+復合東南亞缺失，卻仍然是TDT。另外，本研究患者中β+/β+純合子有53例(4.1%)，此類胎兒如何處置有必要達成共識，如果還按現(xiàn)在的防控策略讓β+/β+地貧胎兒繼續(xù)妊娠(或β+/β+孕婦無需產(chǎn)前診斷)會有產(chǎn)生一部分TDT患者。

目前的地貧防控策略非常明細，需要各個環(huán)節(jié)的醫(yī)務(wù)人員認真落實，早孕建卡檢測是防控的最后一環(huán)，如果確定孕婦夫婦一方攜帶地貧基因，產(chǎn)科醫(yī)生務(wù)必結(jié)合血常規(guī)中的平均紅細胞體積、血紅蛋白電泳中的HbA2和地貧基因檢測3個結(jié)果一起分析，三者不相符時務(wù)必進行認真分析，必要時送測序，避免漏診。隨著二代或三代測序技術(shù)水平的提高和檢測試劑盒成本的降低，二代或三代測序技術(shù)進入地貧防控策略是必然的，這將會顯著降低漏診率，顯著提高工作效率。

利益相關(guān)聲明：不存在競爭經(jīng)濟利益。

作者貢獻說明：李平萍、李瑤蕓、曾麗紅、吳國波、周雪花、唐卒卒、肖彬、周天紅、王麗負責資料收集、分類管理、數(shù)據(jù)整理；何圓圓、張新華負責方案設(shè)計、數(shù)椐分析統(tǒng)計和論文撰寫。