李嘉琦, 李天祎, 夏春娟, 楊素萍, 張婭, 王家平△

1昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院放射科(云南昆明 650106)； 2昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院放射科(云南昆明 650118)

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是一種復雜的進行性疾病，近年來CKD患病率逐年上升，全球一般人群患病率已高達14.3%，CKD目前已成為影響全球約10%人口的重要公共衛(wèi)生問題[1]。從輕、中度腎臟疾病發(fā)展為終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)是一個及其復雜的過程，其中涉及許多因素，包括小管間質(zhì)性炎癥和纖維化等。近年來研究表明，持續(xù)的炎癥與CKD的發(fā)生、發(fā)展之間存在密切關(guān)系[2]。骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemarrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是存在骨髓中的成體細胞，具有多向分化潛能、無免疫排斥、可自體移植等良好的細胞特性，研究表明BMSCs具有促進慢性腎損傷修復的潛能，是再生醫(yī)學中用于修復損傷組織和臟器的一種優(yōu)秀種子細胞[3-4]。已有研究證實BMSCs能增強腎臟應(yīng)對多種急性損傷信號的能力，在促進腎臟修復方面起到顯著作用[5]。目前對于BMSCs傳統(tǒng)移植方式主要包括以下幾種：靜脈途徑移植、動脈途徑移植、局部注射。研究發(fā)現(xiàn)不同途徑移植BMSCs可影響其治療效果，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)在阿霉素慢性腎病大鼠模型中經(jīng)腎動脈途徑移植BMSCs效果優(yōu)于經(jīng)尾靜脈途徑。雖然目前已有一些關(guān)于BMSCs有效性的研究，但是對于移植劑量，尚未形成標準，一些研究設(shè)計了高低計量的對照試驗，但大劑量干細胞輸注可能造成局部栓塞的風險。2021年3—9月，我們通過對大鼠多次低劑量注射阿霉素建立CKD模型，通過介入方法經(jīng)腎動脈途徑對CKD大鼠移植不同劑量BMSCs，通過觀察不同劑量干細胞修復受損腎臟以及減輕炎癥反應(yīng)能力，探討干細胞輸注劑量對腎臟炎癥的影響，以期為干細胞治療CKD提供新的思路及實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 于昆明醫(yī)科大學實驗動物中心購入65只6周齡健康清潔級雄性SD大鼠，其中2只4周齡用于提供BMSCs。購入美國Gibco公司胎牛血清(FBS)、低糖培養(yǎng)基(L-DMEM)、PBS緩沖液；購入Sigma公司阿霉素；購入HE染色試劑盒、青鏈霉素雙抗和0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(北京索萊寶科技有限公司)；購入CD3、CD20單克隆抗體(Abcam公司)。相應(yīng)實驗經(jīng)由昆明醫(yī)科大學動物實驗倫理審查委員會通過(kmmu2020273)。

1.2 BMSCs體外分離培養(yǎng) 2只健康4周齡雄性SD大鼠腹腔注射水合氯醛后脫頸處死，于75%酒精中浸泡5 min后取股骨、脛骨，按照以往經(jīng)驗分離培養(yǎng)BMSCs[6]，用相差倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)及生長方式，取P3代細胞進行成骨、成脂誘導分化培養(yǎng)，流式細胞儀鑒定細胞表面抗原。鑒定合格后取P4代細胞用PBS緩沖液洗滌3次后配成濃度為1×106個/mL、2×106個/mL、3×106個/mL的溶液，1 mL EP管置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 模型構(gòu)建及實驗分組 大鼠購入后給予充足食物與水，適宜溫度下飼養(yǎng)2周。51只大鼠通過尾靜脈直接注射阿霉素方法造模，為防止尾靜脈注射阿霉素因組織液外導致尾巴腐爛，課題組采用李愛平等[7]方法，以酒精、熱水浸泡大鼠尾巴，使尾靜脈充分膨脹后，注射器回抽有血、注射無阻力再行注入，首次劑量為4 mg/kg，間隔1周后，第2次注射劑量為2 mg/kg[8]，本實驗7周左右成模，成模期間2只大鼠因為嚴重腹瀉死亡，一只因尾部潰爛感染死亡，最后存活48只。參考楊揚[9]方法以血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白升高，取腎切片行蘇木精-伊紅染色(HE染色)光鏡觀察符合CKD改變?yōu)槌晒?。造模成功后將大鼠隨機分為模型組(M組)、低劑量組(A組)、中劑量組(B組)、高劑量組(C組)，每組12只，另外取12只作正常對照組(N組)。A、B、C組參照陸發(fā)承等[10]方法通過介入途徑經(jīng)腎動脈移植BMSCs 0.5 mL，濃度分別為1×106個/mL、2×106個/mL、3×106個/mL，M組經(jīng)腎動脈輸注等量PBS，N組經(jīng)尾靜脈輸注等量0.9% NaCl，術(shù)后14 d，處死各組大鼠，取腎組織備用。

1.4 主要觀察指標 觀察各組大鼠一般情況，如毛發(fā)、精神狀態(tài)、體重改變等。分別于BMSCs移植后第7、14天，將各組大鼠放入代謝籠中收集24 h尿液，尾靜脈采血，通過全自動生化分析儀檢測24 h尿蛋白、血肌酐(Cr)和血尿素氮(BUN)水平。14 d末處死大鼠，迅速取出右腎剔除包膜，0.9%NaCl沖洗，甲醛固定、乙醛脫水、石蠟包埋后5 μm連續(xù)切片，行HE染色光學顯微鏡下觀察腎臟結(jié)構(gòu)病理改變，免疫組化染色觀察CD3、CD20表達情況。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況 N組大鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，皮毛有光澤；阿霉素造模后大鼠精神萎靡不振，毛發(fā)粗糙無光澤，食欲變差，蜷縮弓背，體重減輕。經(jīng)腎動脈移植BMSCs后，A、B、C組大鼠食欲較前改善，體重增加，但各組間體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 移植BMSCs后各組大鼠體重比較

2.2 BMSCs移植治療結(jié)果 與N組相比，M組、A組、B組、C組血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白均顯著升高(P<0.05)。BMSCs移植7、14 d后，A組、B組、C組與M組比較血肌酐、尿素氮、24 h尿蛋白降低(P<0.05)，且B、C組低于A組，但兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 BMSCs移植后各組大鼠血肌酐、尿素氮、24h尿蛋白比較

2.3 免疫組化結(jié)果 N組大鼠中CD3、CD20未見或微量表達，M組CD3在大量腎小管上皮細胞以及腎間質(zhì)中呈強陽性或陽性表達，CD20在腎間質(zhì)中呈強陽性表達，部分腎小球中呈陽性表達。A組、B組、C組大鼠腎間質(zhì)CD3、CD20表達較M組表達減輕，其中B、C組減輕更為明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠CD3、CD20免疫組化染色結(jié)果(×200)

2.4 大鼠腎臟病理結(jié)果 N組HE染色未見明顯病理改變，腎小球血管袢薄且清晰，腎小管形態(tài)正常；M組腎小球部分見空泡變性，系膜細胞和基質(zhì)見不同增生，部分腎小球毛細血管襻受壓閉塞，部分腎小管管腔擴張，小管上皮細胞腫脹，腎間質(zhì)可見大量炎癥細胞浸潤；A組、B組、C組可見腎小球不同程度萎縮，腎小管間質(zhì)可見少量輕-中度淋巴細胞、漿細胞浸潤并伴有結(jié)締組織增生，其中B、C組病理學形態(tài)較A組輕微。見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織HE染色結(jié)果(×200)

3 討論

近年來，已有一些相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)BMSCs對CKD具有良好的治療效果[11-13]。但是在移植劑量上卻沒有形成統(tǒng)一標準，為探尋腎損傷炎癥修復程度與移植劑量的關(guān)系，本實驗設(shè)置了低、中、高劑量組。關(guān)于輸注途徑，目前主要有經(jīng)靜脈途徑、經(jīng)動脈途徑以及器官內(nèi)直接注射幾大類。龔勇泉等[14]發(fā)現(xiàn)BMSCs可以減輕心臟移植排斥反應(yīng)，且動脈途徑優(yōu)于靜脈途徑和心肌局部注射途徑。夏勇等[15]研究發(fā)現(xiàn)靜脈移植干細胞更有益于改善糖尿病的整體代謝情況。穆麗雅等[16]發(fā)現(xiàn)在小鼠急性肝損傷模型中，BMSCs促進肝臟修復的程度與移植途徑無關(guān)。不同學者研究得出的結(jié)果不同。一般來說，實驗動物體積均較小，對其而言，通過手術(shù)進行器官直接注射干細胞，對其創(chuàng)傷較大，易增加感染及死亡風險，靜脈途徑相較于動脈途徑有著不可避免的肺循環(huán)過程，這一過程減少了干細胞歸巢數(shù)量，雖然部分研究結(jié)果未展示出動脈途徑輸注的良好效果，但不排除與其所選擇的干細胞種類、輸注劑量、動物模型以及造模方法有關(guān)，所以本實驗采用動脈注射途徑去驗證其有效性。本實驗相較于傳統(tǒng)開腹直視下注射干細胞，其創(chuàng)新性為通過介入微創(chuàng)方法超選擇性經(jīng)腎動脈輸注BMSCs，避免了傳統(tǒng)操作方法可能所導致的不良后果如：因?qū)嶒瀯游矬w型過小造成穿刺時腎動脈撕裂、腎動脈術(shù)后狹窄等情況。

目前研究認為，持續(xù)性無菌性炎癥是CKD的重要標志和臨床特征。一些學者認為隨著腎功能的下降，體內(nèi)的活性氧自由基會逐漸增多，從而促使免疫細胞不斷激活并釋放大量炎癥因子，使機體長期處于一個“微炎癥狀態(tài)”。而這種長期的氧化應(yīng)激反應(yīng)會進一步促使多個臟器損傷，尤其是對于腎臟，主要表現(xiàn)為炎癥因子的表達、聚集，加速腎臟纖維化，從而導致疾病的進一步發(fā)展[17-18]。近年來炎癥因子對腎間質(zhì)的損害受到了眾多學者的關(guān)注，其與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。張春雷等[19]研究發(fā)現(xiàn)在IgA 腎病患者中檢測炎癥因子可以用來檢測腎損傷程度，炎癥損傷與疾病的進展有著密切的關(guān)系。Matoba等[20]研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子的產(chǎn)生在啟動糖尿病腎損傷中起關(guān)鍵作用。因此通過檢測炎癥因子的表達情況，可以一定程度上為判斷患者疾病嚴重程度以及給予針對性治療提供參考。目前國內(nèi)外學者主要通過免疫組織化學法來測定腎組織中細胞膜表面的具有特異性標識的分化抗原簇(cluster of differentiation，CD)來反映腎組織中免疫分子的表達程度，從而間接反映腎臟損害嚴重程度。近年來CD分子通過不同致病途徑參與腎臟疾病的進展已經(jīng)得到了證實，其中又以 CD3、CD20 的研究較多。

CD3、CD20分別作為成熟T淋巴細胞、B淋巴細胞表面特征性的標志之一，通過評估其表達程度，可以一定程度上評估腎組織炎癥嚴重程度[21]。因此，本研究擬通過采用免疫組織化學法測定腎組織中具有特異性標識的分化抗原簇判斷疾病的嚴重程度。

本實驗通過對比經(jīng)腎動脈途徑移植不同劑量BMSCs治療CKD大鼠，BMSCs移植7、14 d后，治療組大鼠一般情況得到明顯改善，其中大劑量對于體重的改善更為明顯。研究結(jié)果顯示不同劑量BMSCs均可對受損的腎功能起到修復作用，生化結(jié)果示：BMSCs移植后第7、14天，A組、B組、C組與M組相比，血肌酐、血尿素氮、24 h尿蛋白均降低(P<0.05)，且B組、C組降低程度優(yōu)于A組，但兩組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；免疫組化結(jié)果示：M組、A、B、C組CD3、CD20均呈陽性或強陽性表達，A、B、C組較M組表達減輕，其中B、C組減輕更明顯。此外HE染色結(jié)果示：移植組炎性細胞表達減少，萎縮腎小球數(shù)量減少，腎小管一定程度上擴張。本實驗中對照組腎組織中也檢測出微量CD分子，這些分子的存在可能與信息遞呈、組織修復等相關(guān)，CD分子在模型組中顯著表達，進一步驗證了其可能參與腎臟的損害，疾病的進展，本實驗發(fā)現(xiàn)隨著腎臟病理損傷嚴重程度的增加，CD分子表達也隨之增加，二者間存在一定的相關(guān)性，提示CD分子陽性表達程度對評判腎臟損害程度具有較高價值。實驗中隨著細胞移植劑量的提升并未呈現(xiàn)出有利于治療的量效關(guān)系，推測可能由于細胞濃度過高，移植后器官內(nèi)脈管系統(tǒng)栓塞所導致，以上表明在治療腎損傷引起的炎癥反應(yīng)時可能需要適宜的細胞數(shù)量，其具體原因需后續(xù)實驗進一步探究。

綜上所述，經(jīng)腎動脈移植BMSCs療法可通過抑制炎癥反應(yīng)緩解CKD大鼠腎功能損傷，其可能是通過降低CD分子表達所實現(xiàn)，且此療效與移植數(shù)量有關(guān)，在觀察時限內(nèi)，移植較大劑量BMSCs組效果優(yōu)于小劑量組。目前應(yīng)用干細胞進行疾病治療，部分學者研究的方向在于探討不同濃度的干細胞對于疾病的治療效果。但隨著醫(yī)學的不斷發(fā)展，個體化精準治療的優(yōu)勢逐漸展現(xiàn)出來，所以在今后應(yīng)用BMSCs治療CKD時，如果根據(jù)移植者自身情況定制個體化方案，在其耐受的情況下，盡量減少并發(fā)癥發(fā)生率的同時移植適宜濃度的BMSCs或者考慮按照公斤體重進行移植相信會取得更好的療效。

利益相關(guān)聲明：所有作者共同認可文章無利益沖突。

作者貢獻說明：李嘉琦負責數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計分析、論文撰寫；李天祎、夏春娟負責論文審閱與修改；楊素萍、張婭負責方案執(zhí)行與實施；王家平負責研究設(shè)計與方案指導。